İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

Bu protokolde, insan timus dendritik hücreler (DC) ve epitel hücreleri (TEC) izole etmek için bir yöntem sağlar. DC ve TEC büyük antijen sunan hücre normal timus bulundu (APC) türleri vardır ve iyi onlar timus seçimi sırasında farklı rolleri oynadığı kurulmuştur. Bu hücreler, timus ayrı mikroçevrelerde lokalize ve her APC tür hücrelerin sadece küçük bir popülasyonu oluşturan vardır. Bundan başka, bu hücre tiplerinin biyolojisi anlamak için, bu hücre popülasyonlarının tanımlanması oldukça tercih edilir ama nedeniyle düşük bir frekansa, bu hücre tiplerinin herhangi birinden izolasyonu etkili ve yeniden üretilebilir bir prosedürü gerektirir. Bu protokol, çeşitli hücresel özellikleri karakterizasyonu için uygun hücrelerin elde edilmesi için bir yöntem göstermektedir. Timus doku mekanik olarak bozulur ve enzimatik sindirme farklı adımları sonra, elde edilen hücre süspansiyonu bir Percoll yoğunluk santrifüjleme aşaması kullanılarak zenginleştirilmiştir. Miyeloid DC (CD11c'nin izolasyonu için <sup> +), düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) gelen hücreler, manyetik hücre sıralama ile immunoselected edilir. TEC popülasyonlar (MTec, CTEC) zenginleştirilmesi spesifik hücre markörleri kullanılarak (FACS) floresan aktive hücre aracılığı ile daha sonra izole edilmesini sağlayan düşük yoğunluklu Percoll hücre fraksiyonundan hematopoietik (CD45 ^hi) hücrelerinin tükenmesi ile elde edilir. Izole edilmiş hücreler, farklı alt uygulamalar için kullanılabilir.

Timus T hücresi gelişme cereyan ettiği bir organdır. Timik aktivitesi hala yaşlılıkta tespit edilebilir, ancak bu durumda sürekli olarak yağ ile ikame olur zaman onun nispi ve mutlak büyüklüğü yaşla birlikte azalır. Immün tepkisi için önemi 1960'ların ^{1 'de} gösterilmiştir.

T hücresi işlevsel bir repertuar ve büyük ölçüde kendi kendine dayanıklı T hücresi repertuarının ² ile sonuçlanan T hücrelerinin gelişmekte olan hayatta kalma ya da ölüm ipuçları sağlamak timik APC farklı ilgili MHC-peptid kompleksleri ile T hücresi reseptörlerinin etkileşimi yoluyla şekillenir.

Insan timus hücrelerin yaklaşık% 98 timositlerde olarak adlandırılan T hücreleri geliştirmektedir. Geriye kalan,% 2, bir TEC çeşitli (kortikal, medüller, subkapsüler), miyeloid ve plazmasitoid DC (MDC, pDC), makrofajlar, B hücreleri, olgun yeniden dolaşan T hücreleri, granülositler gibi farklı hücre tipleri, bir dizi oluşmaktadır fbir ekspresyon fenotipli ibroblasts, endotelyal hücrelerin ve çok nadir epitel hücreleri, kas, nöronlar ve solunum yolu epitel gibi diğer dokuların (Şekil 1) gelen hücre benzeyen. Bunlardan, TEC ve DC normal timus bulunan başlıca APC türleridir. Son yıllarda, kültür ve moleküler profili çıkartmak için, bu tip APC saflaştırılması daha fazla ilgi görmüştür. Nedeniyle düşük bir frekansa, ayrıntılı analiz için, bu hücre tiplerinin herhangi birinin izolasyonu etkin, tekrarlanabilir ve maliyet-etkin bir prosedürü gerektirir. Burada sunulan yöntem, daha önce yayınlanmış çalışmalar ^{3,4 'den} bir modifikasyonudur.

Başka bir doku gibi, timüs hücre ekstre enzimatik olarak tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşim ağları ayırmak ile elde edilebilir. Iyi ayrışma verimliliği, hücre verimi, hücre canlılığı ve hücre s tutma gibi bazı parametreler vardırönemli olan ve sert bir yere belirteçler bu nadir hücre popülasyonlarının başarılı bir şekilde izole edilmesi için optimize edilmesi gerekir.

Bu protokol, DC ve alt-TEC izolasyonu mekanik parçalama ve enzimatik sindirme ile doku tek hücre süspansiyonu yaparak gerçekleştirilir. Biz doku bir arada tutan yerli kolajen yıkmak için, farklı enzim aktiviteleri dengeli bir orana sahiptir Clostridium histolyticum'dan, gelen Kolajenaz A kullanın. DNase I (timositleri çok hassastır). Ayrıca bir doku ayrıştırıcı yardımıyla mekanik ve enzimatik doku tedavi ile ilgili tipik bir enzimatik Doku sindirimi için alternatif bir yaklaşım sağlar nedeniyle ölü hücrelerden serbest DNA hücre agregasyonunu azaltmak için enzim çözeltisi dahildir. Tek hücre süspansiyonu daha sonra hücre düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) zenginleştirilmesi için tek bir Percoll yoğunluk santrifüj işlemine tabi tutulur. Hücrelerin bu fraksiyondan DC f boyama izole edilebilirya da DC-yüzey belirteçleri (örneğin, CD11c ⁺⁾ ve manyetik ayırma veya floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak. Timus hücrelerin büyük bir çoğunluğu içeren lenfoid hücrelerinin aksine, TEC yüksek seviyelerde CD45 eksprese ancak epitelyal hücre yapışma molekülü EpCAM pozitif olan yoktur. CTEC CDR-2 (kortikal dendritik retikülosit-2) antikoru ^4,5 ve daha düşük EpCAM ifadesi tarafından tanınan bir henüz tanımlanmamış antijeninin ekspresyonu ile medüller TEC ayırt edilebilir. Diferansiyel EpCAM ve CDR2 eş ifadesi, yüksek hızlı bir hücre ile bu alt-TEC etkin yalıtım ⁶ ayırma sağlar.

Burada sunulan protokol, insan timus dokusu için optimize edilmiştir. FACS kullanılması halinde, prosedürün süresi, doku miktarı ve deneyi yeteneği hem de hücre sıralayıcı hızına bağlıdır. Normal olarak, DC izolasyonu için protokol 5 içinde tamamlanabilir-6 Hr ve 8-10 saat içinde TEC izolasyonu için. Timik doku DC ve TEC altkümelerin izolasyon zaman duyarlı. Daha hızlı izolasyon prosedürü, hücrelerin durumu daha iyi. Son olarak, izole edilmiş hücreler mRNA karşılaştırmalı çalışmalar ve protein ifadesi, PCR deneyleri, protein izolasyon, moleküler profili (yani transkriptomik, mikro RNA analizi) yanı sıra hücre kültürü ⁶ gibi daha ileri araştırmalar için de kullanılabilir.

Etik Bildirimi

Insan timus dokusu ile çalışmak edebilmek amacıyla araştırmacı doku genellikle reşit elde beri yerel etik kurul veya sorumlu makamlar yanı sıra donörün bilinçli bir yazılı izni (ya da genellikle kendi anne, onay almak gerekiyor çocuklar). Ayrıca, tüm insan dokuları potansiyel bulaşıcı ve uygun önlemlerin vb, eldiven ile çalışma gibi, alınmalıdır olarak ele alınmalıdır.

1.. Araçlar, Enzim Çözümleri ve Tamponlar hazırlanması

Protokol başlamadan önce aşağıdaki hazırlık adımları gerçekleştirin.

1. Araçlar
   Temiz, kuru ve aşağıdaki araçları otoklav ve kullanıma kadar steril bir paket içinde saklayın.
   1. Timus doku kesmek için kavisli veya düz ya da ipuçları ile küçük keskin makas. Doku kullanımı için tırtıklı ipuçları ile küçük kavisli forseps.
   2. Percoll yoğunluklu santrifüjleme aşaması için 50 ml Oak Ridge Santrifüj Tüpleri, PC,.
2. Enzim çözeltiler
   Aşağıdaki gibi (2 mg Kollajenaz / ml ve 0.1 mg DNase I / ml) karışımı enzim kolajenaz / DNase hazırlanması:
   1. , Bir 2 mg / ml kollajenaz çözelti elde etmek için RPMI 1640 Düz (FCS) 250 ml kollajenaz liyofilize A (Roche) içinde çözülür, 500 mg. Kolajenaz çözmek oldukça zordur, bu nedenle oda sıcaklığında bir roller-çalkalayıcı üzerinde biraz zaman bırakmak tavsiye edilir.
   2. 100 mg DNase I (Roche) içinde çözülürSteril damıtılmış su içinde 10 mi. 2.5 ml lik bir kısmı -20 ° C'de saklanabilir 2 mg Kollajenaz bir çözelti içinde 10 mg DNase I çözeltisinin 2.5 ml ilave edilir.
   3. Steril filtre Stericup filtre birimi (0.22 um) kullanılarak kollajenaz / DNase karışımı. -20 ° C'de kullanıma kadar 10-20 ml şişelerde saklayın.
3. Tamponlar ve Çözümler
   1. 1.5 M NaCl stok solüsyonu: oda sıcaklığında 0.22 um filtresi ve mağaza üzerinden solüsyonu filtre 1.5 M bir son konsantrasyona kadar damıtılmış steril su içinde NaCI eritin.
   2. 10x MACS tamponu: 1x PBS (Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +} içermeyen),% 5 BSA ve 20 mM EDTA ihtiva eden. Steril filtre, 4 ° C'de bir 0.22 mikron filtre ve mağaza ile çözelti Önce soğuk steril 1x PBS 1x 10x stok seyreltilmesi ile 1x çözeltisi hazırlamak kullanmak için.
   3. FACS Tampon: 1x PBS (Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +} içermeyen),% 1 BSA ve% 0.02 _NaN3 içeren.
   4. FACS Tampon hücre sıralama için: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + içermeyen),% 2 BSA içeren. 0.22 um bir şırınga filtresi kullanılarak sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın}

2. Doku hazırlanması

Dokunun işleme, düzgün akış kabininde steril reaktifler ve iş kullanılarak yapılmalıdır. Prosedürü başlamadan önce, aşağıdaki reaktifler ve ekipman hazırlamak:

1. 1. , Oda sıcaklığına kadar aşağıdaki Isınma: RPMI 1640 tam ortamı (RPMI 1640,% 10 fetal inek serumu,% 1 pen / strep), RPMI 1640, düz, ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +-serbest} PBS ile 2x kollajenaz / DNase enzim çözeltisi.
   2. 37 ° C'ye dönüş birimi ve 4 ° C'ye soğutun sabit açılı rotor santrifüj ile sıcak ısı kuluçka
   3. Buz ile bir kutu hazırlayın.

Not: Bu aşamanın süresi doku durumuna ve büyüklüğüne bağlıdır. Yaklaşık 20-30 dk ti orta boy bir parça için makul bir süre gereklidiriyi durumda ssue (~ 5 cm genişliğinde).

2. Steril PBS içeren bir Petri kabındaki doku yerleştirin ve herhangi bir kalıntı kan durulayın.
   1. Kurutma ve forseps ve makas kan pıhtıları, bağ ve yağ dokusu ve sağlıklı görünmüyor herhangi bir yerinden doku temizlemek kullanarak doku önlemek için taze PBS ekleyin.
   2. Enkaz miktarı artacak nekrotik doku kaldırmak için özen gösterin.
   3. Temizlikten sonra, başvuru için doku tartın.
   4. Yaklaşık 1 cm ³ adet / blok içinde doku kesti. Doku karşılamak için yeterli PBS ilave edin.

Not: Sonuçların tekrarlanabilirlik, doku muntazam boyutta parçalar halinde kesilmiş olmalıdır.

3. Steril bir şırınga (10-20 mi) içinde geri kullanarak timik doku parçalarının üzerine basınç (çok güçlü ve uzun süreli değildir) uygulanır. Bu prosedür, böylece daha sonra sindirilmiş edilecek olan doku hacmini azaltır, timositlerin kısmını kaldırır. Buz üzerinde bu adımı uygulayın ve hızlı çalışır.
4. Timositleri çıktıkça çözüm gözle bulutlu olacak. 5 ml'lik bir pipet yardımıyla veya bir cam aspiratör yanlışlıkla doku parçaları aspire için özen timositlerin içeren süpernatant kaldırmak yavaşça ve daha sonra çanak karıştırın.

Kriteri: Bir steril hücre kültürü kazıyıcı sonra çanak (45 ° açı) eğim ve süpernatant aspire yemeğin bir tarafında, tüm doku parçaları konsantre kullanılabilir. Taze PBS ile değiştirin ve yüzer nispeten saydam oluncaya kadar bu işlemi tekrarlayın. RPMI ova ile son yıkama yapın.

5. Keskin bir makas kullanarak doku parçaları sakınmadan (ince mümkün olduğunca, fragmanlar en az 2-4 mm olmalıdır). Parçalar, 5 ml'lik pipet girmek için yeterince küçük olmalıdır.

3. Thymus Dokusundan Tek Hücre Süspansiyon Hazırlanması

Burada,Bu aşama için iki alternatif yaklaşımlar açıklanmıştır. Ikinci bir doku dissociator (bölüm 3.2) yardımıyla mekanik ve enzimatik doku tedavi gerektirir ise ilk yaklaşım tipik bir enzimatik doku sindirim (bölüm 3.1) açıklanmaktadır.

Bu protokol, 5 g ağırlığında doku numunelerinin işlenmesi için optimize edilmiştir. Daha büyük ya da daha küçük doku örnekleri için, buna göre enzim seviyesini ayarlamak.

Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 3,1 tipik doku enzimatik sindirim

1. Doku 5 g başına 10 ml kolajenaz / DNase çözeltisi ile 50 ml tüplere doku püresi yerleştirin. 20 ml'lik toplam hacim elde RPMI düz ekleyin.

Not: Bir 50 ml'lik bir tüp içinde 10 g doku kadar sindirimi. Buna göre enzim seviyesini ayarlayın.

2. Termal bir kuluçka makinesi içinde yavaş dönme altında, 37 ° C'de 40 dk için doku süspansiyonu inkübe edin.

Not: inkübasyon adımları dönme birimi ile bir termal inkübatör veya bir çalkalama ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde, bakteriyel ya da gerçekleştirilebilir.

3. Hücreler içine serbest olarak enzim çözeltisi bulanık olacaktır. Doku parçaları çökeltmek için 2 dakika boyunca 110 xg'de sindirim, santrifüj tüpünün ucunda.
4. Bu sindirim turdan süpernatant toplayın. 400 x g de 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu Pelet. Hücre peleti boyutuna bağlı olarak RPMI tam 10-50 ml süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon hücreleri.
5. Gevşek kapak ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücre süspansiyonu tutun.
6. Daha büyük hücre sayıları istenirse, sindirim aşaması, kalan doku parçaları ile tekrar tekrar ve birinci ve ikinci sindirimi toplanmış olabilir. TEC izole edilmelidir Ayrıca, eğer, sindirimler iki tur yapılmalıdır.
7. Tripan mavisi (1:10-1:100) 'de, hücre süspansiyonunun bir alikotu seyreltin ve hemasitometre kullanarak canlı hücreler sayılır.
8. Percoll yoğunluk santrifüj (bölüm 4) devam etmek için hazır olana kadar, bir inkübatör içinde 37 ° C'de hücreler tutun. DC alt kümelerinden (bölüm 5) sonraki izolasyon bu hücrelerden yapılacaktır.

Not: timik dokular tek hücre süspansiyonu sindirim etkinliği ve üretimi etkiler, özellikle yaşla birlikte, kendi bileşim içinde değişebilir.

9. Timik epitelial hücreler (TEC) müteakip izolasyonu için enzimatik sindirme bir üçüncü tur gereklidir. 10 taze Kolajenaz / DNaz çözüm ml artı 10 ml RPMI düz ve süspanse doku kalıntıları çözeltide tripsin / EDTA (01:50 dan 2.5% stok) ekleyin.
10. Hafif bir dönme ile, 40 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Son 10 sırasında - kuluçkalama 15 dakika Tripsin aktivitesini nötralize etme FCS (01:05) ekleyin.
11. Doku parçaları çökeltmek için, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 110 x g'de santrifüjleyin.

Not: doku tamamen sindirimler bu üç tur sonra sindirilir olmayabilir. Yaş ve doku genel durumu timus dokusunun ayrışma etkinliği etkileyen iki parametredir.

12. Hücre süpernatan toplamak ve tortulaşmış doku parçaları atın.
13. 10 dakika boyunca 400 x g'de hücre süpernatan santrifüjleyin. RPMI tam aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet.

İpucu: Hücre topakları oldukça gevşek, yani süpernatant aspire / atarken dikkat.

14. Hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. Ayırma (bölüm 4) Percoll geçmeden kadar bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri yerleştirin. CD45 ^hi hücrelerinin tükenmesi TEC hücrelerinin sonraki ön-zenginleştirme bu hücrelerin (bölüm 6) dan yapılacaktır.

Bir doku dissociator Asisti 3.2 Mekanik ve enzimatik doku tedavi

. Aşağıdaki protokol TEC ^7,8 izolasyonu için fare timusundan doku ayırmak için kullanılan modifiye edilmiş bir versiyonudur.

1. Kolajenaz / DNase çözeltisi 10 ml ihtiva eden bir C tüp içine aktarın kıyılmış doku parçaları (adım 2.5) içinde 5 g.
2. Doku dissociator ve çalıştırma programı m_spleen_02 (10 sn) üzerine C tüp uyarlayın. Bu programı 4-5x (40-50 sn) tekrarlayın.
3. 37 ° C'de 20 dakika boyunca hafif bir dönme ile inkübe
4. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 110 x g'de santrifüjleyin.
5. Süpernatant toplayın ve adım 3.1.4 olarak devam edin. Taze Kolajenaz / DNaz çözeltisi 10 ml ekleyin.
6. Doku dissociator ve çalıştırma programı m_spleen_01 (56 sn) üzerine C tüp uyarlayın.
7. Hafif bir döndürme ile 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 110 x g'de santrifüjleyin.
9. ToplamaT hücre süpernatanı ve 400 x g de 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu pelet. Adım 3.1.4 olarak devam edin.
10. 3.1.9 tarif edildiği gibi sindirim üçüncü tur timik epitelial hücreler (TEC) ve daha sonra izole edilmesi için gereklidir. Bunun için, 10 taze Kolajenaz / DNaz çözüm ml artı Tripsin / EDTA tekrar süspansiyon doku kalıntıları (stokta 1:50 seyreltme% 2.5)
11. Hafif bir döndürme ile 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. FCS (1:5) ilave edin ve 10 dakika daha inkübe edilir.

Not: Bu yaklaşımı kullanarak, bu son sindirim doku genellikle tam olarak ayrışmış ve herhangi bir sindirilmemiş doku fragmanları gözlenmiştir aşama sonra.

12. Adımlar olarak devam 3.1.11-3.1.14.

4. Percoll-yoğunluk Separation Hücrelerinin LDF Zenginleştirme

Dokunun enzimatik sindirimden sonra toplam timik tek hücre süspansiyonları, tek bir Percoll yoğunluk centrifugat tabi tutulurLDF hücreleri zenginleştirmek üzere iyon adım. Hücrelerin LDF yüksek APC için zenginleştirilmiştir. DC ve TEC hem de hücrelerin bu kısmını tespit edilir.

1. (TEC izolasyonu için) veya ^3. özet (3.1.14) (adım 3.1.8 bakınız toplanmış hücreler) MDC izolasyonu için sindirir ^nd 1. ^ve 2. elde edilen tek hücre süspansiyonu kullanın. 10 dakika boyunca 400 x g'de her sindirim aşamasından elde edilen tek bir hücre süspansiyonu santrifüj.
2. Bu yıkama adımı (aşağıdaki tabloda örnek) içinde 1.07 g / ml 'lik bir son yoğunluğa sahip bir Percoll çözeltisi hazırlayın.

   1.07 lik bir nihai yoğunluğa Percoll çözeltisi hazırlanması g / ml (ρ = 1.07)
   Tüp No	1	2	3	4
   Sulandırılmamış Perkol (ρ = 1.130) (ml)	2.96	5.92	8.88	11.84
   1.5 M NaCl (ml)	0.6	1.20	1.8	2.4
   damıtık H2O (ml)	2.44	4.88	7.32	9.76
   Son işleme seyreltme Cilt	6 mi	12 mi	18 mi	24 mi

3. Percoll tüplerin sayısı adımları 3.1.8 ve / veya 3.1.14 belirlenen hücre sayıları bağlıdır. Steril çözümleri birleştirin ve iyice karıştırın. Optimum izolasyonu için, 0,6-1 x 10 ⁹ hücreleri Percoll tüp başına yüklenebilir. Steril çözümleri birleştirin ve iyice karıştırın.

İpucu: Perkol ışığa duyarlı ve ek olarak soğuk tutulmalıdır. İlk NaCI ve _H2O (RT) ihtiva eden bir karışım hazırlayın ve sadece Percoll çözeltisi içindeki hücrelerin tekrar asılı tutulmasından önce, son sulandırılmamış Percoll ekleyin.

Bu protokolde, başlangıç ​​malzemesi olarak biz bilgilendirilmiş rıza sonra ve kurumsal kurallar altında elde edilen düzeltici kardiyovasküler cerrahi (Bölüm Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi, Üniversite Kliniği Tuebingen) geçiren çocuklarda çıkarılan timus doku kullanın. Bu atılan malzeme 2-30 g veya daha fazla boyutu büyük ölçüde değişebilir. Elde edilir MDC sayısı ve TEC alt-gruplar (CTEC ve MTec) boyut olarak hem de izolasyonu için kullanılan timus doku örneğinin yaşına bağlıdır.

Şekil 2 (~ 9 cm) altı yaşındaki bir çocukta elde edilen doku oldukça büyük bir parçasını gösterir. Bu protokolde önemli bir ilk hazırlayıcı aşama (beyaz oklar ile gösterilmektedir) arzu edilmeyen bölgelerinden gelen doku temizlenmesidir.

Tek bir Percoll yoğunluk santrifüjleme s kullanılarak ayrıldı tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 2 ve protokol 3.1 'de belirtildiği gibi Thymus doku işlenditek bir hücre süspansiyonu HLA-DR + hücrelerinin yaklaşık% 3 (Şekil 3A) ihtiva ederken tep, Percoll uygulanan santrifüj işlemi sonrasında bu oran% 15-40 kadar, büyük ölçekli hücreleri içeren, düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) artmış iken esas olarak muntazam küçük boyutlu timositlerin oluşan yüksek yoğunluklu fraksiyon (HDF) hemen hemen hiç bu tür hücreleri (Şekil 3B) içerir. İlgi (LDF) fraksiyonu içeren zenginleştirilmiş APC, daha sonra toplandı ve daha sonra izolasyon adımda kullanım için hücreleri toplamak için yıkanmıştır.

Timik MDC CD11c9, 10 dahil olmak üzere, yüzey belirteçleri, bir dizi ekspresyonu ile tespit edilebilir olsa da, bu tür pDC BDCA-2, BDCA-4, CD45RA ve CD123 ^11,12 gibi belirteçler ifade eder. LDF hücrelerin zenginleştirilmesi sonra, her iki hücre tipleri ⁺ manyetik hücre ayırma ile veya CD11c'nin sıralama akış ⁺ veya BDCA-4 ya da, daha fazla sayıda aynı zamanda etkili izolasyonunu sağlayan, bu fraksiyonun% 2-10 teşkilhücreler ^6.

Şekil 4, bölüm 5'de tarif edilen tadil edilmiş bir manyetik hücre ayrıştırma protokolü kullanılarak CD11c ⁺ hücrelerinin etkili izolasyonunu gösterir. Izole edilmiş hücreler tarafından oluşturulan imüno olarak izole edilmesinden sonra, CD11c ⁺ DC saflığı% 93 olmuştur. Ortalama olarak, izole edilmiş CD11c ⁺ DC kurtarma 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ MDC 10 ^9, toplam timik hücre başına tek bir giriş, bir dizi farklı yaş doku ağırlığının birkaç ayrı timus örneklerinden elde edilmiştir. Tablo 1 verileri hücre süspansiyonları, hem de total LDF sayıları ve onu takip eden CD11c ⁺ verim ve saflık.

APC zenginleştirilmiş fraksiyon olarak, hücrelerin sadece yaklaşık% 0.5 'i ^lo EpCAM CD45 ⁺ veya CD45 ^negatif EpCAM ⁺ bulunmaktadır. CTEC ve Mtec EpCAM ^l olarak tripsin-sindirilmiş CD45 ^{lo / negatif} zenginleştirilmiş stromal hücrelerden sıralanabilir o ⁺ CDR2 ve EpCAM ^hi CDR2 ^-, sırasıyla, Şekil 5'te gösterildiği gibi.

Şekil 1. Hücresel organizasyon ve insan timus kompozisyonun basitleştirilmiş bir diyagram. Timus farklı olgunlaşma aşamalarında, timositlerin oluşur ve heterojen hücresel ağ timik ortamı oluşturarak timik stroma olarak anılacaktır. Ve makrofajlar Kısaltmalar: timik stromaya ana hücre tipleri MDC ve pDC, epitel (kortikal ve medüller lobülü içindeki yerleşimine göre iki ana kategoriye ayrılır): hücreler DC, dendritik hücreler, MDC, miyeloid dendritik hücreler;. pDC, plazmasitoid dendritik hücreleri Mφ, makrofaj, mono, monositler, CTEC, kortikal epitel hücreleri; MTec, medüller epitel hücreleri.

Şekil 3,. Saflaştırma işleminin farklı aşamalarında timik APC., FACS analizi ile saflaştırılması. Timus dokusunun tek hücre süspansiyonları, mekanik parçalama ve seri enzim sindirimleri ile elde edilmiştir ve APC Percoll yoğunluklu ayırma ile (LDF hücreleri) zenginleştirilmiş. (A) önce ve (B) sonra, hücreler Percoll yoğunluklu ayırma APC zenginleştirme kontrol etmek için HLA-DR antikoru-PE ile boyandı. Tipik olarak gözlenen HLA-DR + hücrelerin yüzdesi aralığı değil Göstergeler olduğunu ed.

Şekil 4. CD11c ⁺ MDC. Thymus doku izolasyonu tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere kollajenaz A / DNase kullanılarak sindirilmiştir. CD11c ⁺ MDC tek bir hücre süspansiyonu (% 0.6) arasında sadece küçük bir popülasyonu temsil etmektedir. Percoll yoğunluklu ayırma ile LDF hücrelerin zenginleştirilmesi sonra ~% 9 CD11c ⁺ hücrelerinin yüzdesi artmaktadır. LDF hücreler, CD11c-PE antikor ile etiketlenir ve daha sonra manyetik boncuk (anti-PE) kullanılarak izole edilmiştir. Doğrudan FACS manyetik hücre ayrılmasından sonra CD11c'nin ⁺ nüfusun Reanalysis% 93 saflığa işaret. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

0951/50951fig5.jpg "/>
Şekil 5,. CD45 ^{lo / negatif} hücre zenginleştirme ve TEC altkümelerinde CD45 yüzdelerini gösteren. A) Temsilcisi nokta araziler sonraki sıralama negatif / sırasıyla Perkol yoğunluk ayırma (% 9 ve% 16.2) önce ve sonra toplam tek hücre süspansiyonları düşük timik stromal hücreleri. (Mtec) veya EpCAM ^lo CDR2'de ⁺ (CTEC) ^- B) LDF hücreleri manyetik boncuk ve EpCAM ^hi CDR2'de olarak tükenmiş fraksiyonu sıralanır TEC alt kümelerini kullanarak CD45 ^hi hücreleri tükenmiş oldu.

Tablo 1. İki sindirim mermi gibi Percoll ayrıldıktan sonra LDF hücre verimi sonra serbest tek bir hücre süspansiyonu, toplam hücre sayıları farklı yaş doku ağırlığının altı bireylerin timus örneklerinde yapılan izolasyon için gösterilmiştir. MDC Sıklıkları göre akış sitometrisi ile tespit edilmiştir Toplam LDF hücrelerde CD11c ifadesi üzerindeki (APC zenginleştirilmiş). Verim ve CD11c ⁺ hücrelerinin saflığı manyetik boncuk ayırma sonra her donör için gösterilmiştir.

Burada açıklanan protokol Götter ve arkadaşları tarafından yayımlanan ⁴ protokol bir modifikasyonudur. Protokolde kritik adım durumu ve doku ilk hazırlanması hem de Percoll yoğunluk ayrılması bulunmaktadır. Önemle kısa sürede toplandıktan sonra doku işlemek için tavsiye. Bu temizlik ve doku keserken hızlı ama iyice çalışmak önemlidir. Adım 2.3 'de tarif edilen timosit yıkama sırasında, stromal hücrelere zarar verebilir çok güçlü ve uzun süreli basınç doku parçaları üzerinde, şırınga pistonunun arka basınç uygularken, doğru denge bulmak için çok önemlidir. Bozulmaları neden olmadan Percoll çözeltisi / hücre süspansiyonu üzerine orta katman aynı zamanda, bazı uygulama gerektirebilir. Santrifüj işleminden sonra, bu mümkün olduğu kadar çabuk Percoll çözeltisi, minimum miktarda Percoll tabakanın tüm düşük yoğunluklu fraksiyon hücreleri toplamak için önemlidir.

genel hücre verimleri ve nispi APC numaralar (bkz. Tablo 1) çok değişken olabilir ve (özellikle yaşa göre) donör ve deneyci hazırlık becerilerine bağlıdır. Kısa bir bakış için, hücre süspansiyonları istediğiniz gibi protokol farklı adımlar aşağıdaki HLA-DR ve / veya diğer işaretleri ile boyanmış olabilir. Fenotipik analizi için kullanılan tüm antikorlar, en iyi sonuçları elde etmek için titre edilmelidir.

Izole edilmiş hücreler daha fazla sayıda arzu edildiği takdirde dolayı thymoctyes göre timus APC türlerine nispeten düşük bolluğu nedeniyle, timus daha büyük parçalar gerekli olabilir.

Bir doku ayıracı laboratuarda mevcut ise, bu ölçüde doku işleme hızlandırır, ama burada açıklanan her iki varyasyonları eşit derecede iyi çalışır. Nispeten sık görülen bir sorun, özellikle de ayırma ve Percoll MACS / FACS tasnifi arasındaki adımları sırasında, hücrelerin topaklanma olabilir. Bu durumda, kısa bir DNase I kazmakprotokol açıklandığı gibi estion genellikle sorunu çözecektir. Timus doku arda büyük vericiden yaşlanma, Thymi farklı sindirim aşamalarından elde edilen tek hücre süspansiyonları santrifüjden sonra tüp üstünde yüzer bazı yağ içerebilir sırasında yağ dokusu ile değiştirilir beri. Böyle bir durumda, yağ protokolü devam etmeden önce, bir pipet ile çıkarılmalıdır. En iyi sonuçlar hem de biz antikorları değil, aynı zamanda anti-PE, mikro-boncuklar, sadece titre etmek için tavsiye ekonomi nedenleriyle (bölüm 5 ve 6). Fare timüs TEC izolasyonu için, alternatif enzim karışımları TEC verimi ^8,13 geliştirmek için tarif edilmiştir, ama biz insan dokusu ile onları test etmedim.

Prensip olarak, B hücreleri ve timus pDC gibi diğer APC ve stromal hücreler de ilgili işaretleyiciler bilinen durumunda FACS ayıklama / MACS ile (kolajenaz / DNase sindirim ve Percoll takip edilerek) LDF hücrelerden izole edilebilir. Örneğin, Pd-C, BDCA-2-BDCA için4 ve CD123 belirteçler ^6,14 olarak tarif edilmiştir. Timosit alt kümelerinin analizi veya izolasyonu isteniyorsa oldukça saf ve minimal manipülasyon geçirmiş beri, biz, (adım 2.3) sıkarak yayımlanan hücreleri kullanarak öneririz.

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Biz CDR2 antikorun sağlanması için timus örnekler ve Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Almanya) ile bize sağlamak için Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, Üniversite Kliniği Tuebingen cerrahlar için minnettarız. Biz de sıralama tesisinin (Tübingen Üniversitesi) Hans-Jörg Bühring ve Sabrina Grimm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma SFB 685 ve hertie Vakfı tarafından desteklenmiştir.