Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Dans ce protocole, nous fournissons un procédé pour isoler des cellules dendritiques (DC) et les cellules épithéliales (TEC) à partir du thymus humain. DC et TEC sont la principale cellule présentatrice d'antigène (APC) de types trouvés dans un thymus normal et il est bien établi que ils jouent des rôles distincts lors de la sélection thymique. Ces cellules sont localisées dans des micro-environnements distincts dans le thymus et chaque type APC ne constitue qu'une petite population de cellules. Pour mieux comprendre la biologie de ces types de cellules, la caractérisation de ces populations de cellules est très souhaitable, mais en raison de leur basse fréquence, l'isolement de l'un de ces types de cellules nécessite une procédure efficace et reproductible. Ce protocole détaille une méthode pour obtenir des cellules appropriées pour la caractérisation des propriétés cellulaires divers. Tissu thymique est mécaniquement perturbé et après différentes étapes de digestion enzymatique, la suspension de cellules résultante est enrichi à l'aide d'une étape de centrifugation par densité de Percoll. Pour l'isolement des myéloïde DC (CD11c <sup> +), des cellules provenant de la fraction de faible densité (LDF) sont immunosélectionné par tri cellulaire magnétique. Enrichissement des populations de TEC (mTEC, la technologie cTEC) est réalisé par déplétion des hématopoïétiques (CD45 ^hi) des cellules de la fraction cellulaire de faible densité Percoll permettant leur isolement subséquent par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant des marqueurs cellulaires spécifiques. Les cellules isolées peuvent être utilisées pour différentes applications en aval.

Le thymus est l'organe dans lequel le développement des cellules T se produit. Sa taille relative et absolue diminue avec l'âge quand il est remplacé successivement par de la graisse bien que l'activité du thymus peut encore être détecté dans la vieillesse. Son importance pour la réponse immunitaire a été démontrée dans le début des années 1960 ^1.

Le répertoire des cellules T est façonnée par l'interaction des récepteurs des cellules T avec des complexes peptide-MHC sur les différents types de thymus APC, qui assurent la survie ou la mort des indices de développement de cellules T, ce qui entraîne un répertoire fonctionnel et largement auto-tolérance des lymphocytes T ^2.

Environ 98% des cellules dans le thymus humain développent des lymphocytes T appelés thymocytes. Les 2% restants se composent d'un certain nombre de différents types de cellules, y compris une variété de TEC (corticale, médullaire, sous-capsulaire), myéloïde et CD plasmacytoïdes (MDC, PDC), les macrophages, les lymphocytes B, les cellules matures re-circulation T, les granulocytes, faibroblasts, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales de très rares avec un phénotype d'expression qui ressemble à celle des cellules provenant d'autres tissus tels que les muscles, les neurones et de l'épithélium des voies respiratoires (Figure 1). Parmi ceux-ci, TEC et DC sont les principaux types d'APC présents dans un thymus normal. Au cours des dernières années, la purification de ces types d'APC pour la culture et le profilage moléculaire a gagné de plus en plus d'intérêt. En raison de leur basse fréquence, l'isolement de l'un de ces types de cellules pour une analyse détaillée nécessite une procédure efficace, reproductible et économique. La méthode présentée ici est une modification d'études publiées antérieurement ^3,4.

Comme avec n'importe quel autre tissu, l'extraction des cellules du thymus peut être obtenue en décomposant par voie enzymatique de la cellule-cellule et les réseaux d'interactions cellule-matrice, pour obtenir une suspension de cellules uniques. Il existe certains paramètres comme la bonne efficacité de dissociation, le rendement cellulaire, la viabilité des cellules et le maintien des cellules smarqueurs de urface qui sont cruciales et doivent être optimisées pour l'isolement réussi de ces populations de cellules rares.

Dans ce protocole, l'isolement des sous-ensembles de DC et TEC est réalisée par formation d'une suspension à cellule unique du tissu par rupture mécanique et la digestion enzymatique. Nous utilisons la collagénase A de Clostridium histolyticum, qui a un rapport équilibré des différentes activités enzymatiques, à briser le collagène natif qui détient le tissu ensemble. DNase I est inclus dans la solution enzymatique pour réduire l'agrégation cellulaire en raison de l'ADN libre à partir de cellules mortes (thymocytes sont très sensibles). Nous fournissons également une approche alternative à la digestion du tissu enzymatique typique impliquant un traitement de tissu mécanique et enzymatique assistée par un dissociateur de tissu. La suspension cellulaire unique est ensuite soumis à une centrifugation unique de densité Percoll pour l'enrichissement de la fraction de faible densité (LDF) de cellules. A partir de cette fraction de cellules, DC peut être isolé par coloration fou marqueurs DC-surface (c.-à-CD11c ⁺⁾ et en utilisant une séparation magnétique ou une cellule activé par fluorescence (FACS). A la différence des cellules lymphoïdes comprenant la grande majorité des cellules dans le thymus, les TEC n'expriment pas CD45 à des niveaux élevés, mais sont positifs pour le adhésion cellulaire épithéliale molécule EpCAM. Ctec peut être distingué du TEC médullaire par l'expression d'un antigène reconnu non encore défini par le CDR-2 (cortical dendritique réticulocytes-2) un anticorps ^{de 4,5} et l'expression d'EpCAM un peu plus faible. L'écart-co-expression de EpCAM et CDR2 permet l'isolement efficace de ces sous-ensembles de TEC par l'intermédiaire de la cellule à grande vitesse de tri ^6.

Le protocole présenté ici est optimisée pour les tissus du thymus humain. La durée de la procédure dépend de la quantité de tissu et de la capacité de l'expérimentateur, ainsi que la vitesse du trieur de cellules, si tri FACS est utilisé. Normalement, le protocole pour l'isolement de CC peut être achevée dans un délai de 5-6 H et à l'isolement des TEC en 8-10 heures. L'isolement des DC et des sous-ensembles de TEC de tissu thymique est sensible au temps. Plus la procédure d'isolement, meilleure est l'état des cellules. Enfin, les cellules isolées peuvent être utilisées pour d'autres investigations, comme des études comparatives de l'ARNm et l'expression des protéines, des expériences de PCR, l'isolement de la protéine, le profilage moléculaire (à savoir les transcriptomique, micro-analyse de l'ARN), ainsi que la culture de la cellule ^6.

Déclaration d'éthique

Afin d'être en mesure de travailler avec le tissu de thymus humain, le chercheur doit obtenir l'approbation du comité d'éthique local ou les autorités responsables ainsi que d'un consentement écrit du donneur (ou habituellement ses parents, puisque le tissu est généralement obtenu à partir de mineurs les enfants). En outre, tous les tissus humains doivent être traités comme étant potentiellement infectieux et des mesures appropriées doivent être prises, telles que le travail avec des gants, etc.

Une. Préparation des outils, des solutions enzymatiques, et tampons

Effectuez les étapes suivantes de préparation avant de commencer le protocole.

1. Outils
   Propre, sec et à l'autoclave les outils suivants et les conserver dans un emballage stérile jusqu'à l'utilisation.
   1. Petits ciseaux pointus avec des conseils soit courbes ou droites pour couper le tissu de thymus. Petites pinces courbes avec des pointes crantées pour la manipulation du tissu.
   2. 50 ml d'Oak Ridge Tubes à centrifuger, PC, pour l'étape de centrifugation Percoll-densité.
2. solutions d'enzymes
   Préparer la collagénase / DNase I enzyme de mélange (2 mg de collagénase / ml et 0,1 mg de DNase I / ml) comme suit:
   1. Dissoudre 500 mg de collagénase A lyophilisée (Roche) dans 250 ml de RPMI 1640 brut (pas de FCS) pour obtenir une solution à 2 mg / ml de collagénase. Collagénase est assez difficile à dissoudre, il est donc recommandé de laisser un peu de temps sur un rouleau vibrant à la température ambiante.
   2. Dissoudre 100 mg de DNase I (Roche) dans10 ml d'eau distillée stérile. 2,5 ml aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C. Ajouter 2,5 ml de la solution de 10 mg de DNase I dans la solution 2 mg de collagénase A.
   3. Filtre stérile le mélange de collagénase / DNase en utilisant une unité de filtre Stericup (0,22 um). Magasin à 10-20 ml aliquotes à -20 ° C jusqu'à utilisation.
3. Tampons et solutions
   1. 1,5 M de NaCl solution stock: Dissoudre NaCl dans de l'eau distillée stérile à une concentration finale de 1,5 M. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
   2. 10x tampon MACS: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-libre)} contenant 5% de BSA et 20 mM EDTA. Filtre stérile la solution avec un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. Avant d'utiliser préparer une solution 1x par dilution de la langue 10x à 1x au froid stérile 1x PBS.
   3. Tampon FACS: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-libre)} contenant 1% de BSA et 0,02% _{de NaN3.}
   4. FACS tampon pour le tri de cellules: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + sans) contenant 2% de BSA. Stériliser à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um et stocker à 4 ° C.}

2. Préparation du Tissue

Le traitement du tissu doit être effectuée en utilisant des réactifs stériles et des travaux dans une hotte à flux laminaire. Avant le début de la procédure, préparer les réactifs et les équipements suivants:

1. 1. Chauffer le suivant pour RT: milieu RPMI 1640 complet (RPMI 1640, 10% sérum de veau fœtal, 1% pénicilline / streptomycine), RPMI 1640 plaine, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} sans PBS et 2x solution enzymatique collagénase / DNase.
   2. Incubateur thermale chaude avec l'unité de rotation à 37 ° C et laisser refroidir angle fixe rotor de la centrifugeuse à 4 ° C.
   3. Préparer une boîte avec de la glace.

Remarque: la durée de cette étape dépend de l'état et la taille du tissu. Environ 20-30 minutes est un délai raisonnable nécessaire pour une pièce de taille moyenne tissu en bon état (~ 5 cm de largeur).

2. Placez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS stérile et rincer tout le sang résiduel.
   1. Ajouter du PBS frais pour empêcher le tissu de séchage et l'aide de pinces et ciseaux nettoyer le tissu de caillots de sang, du tissu conjonctif et la graisse et de toute partie qui ne semble pas en bonne santé.
   2. Prendre soin d'enlever les tissus nécrosés qui permettra d'augmenter la quantité de débris.
   3. Après le nettoyage, peser tissu pour référence.
   4. Coupez le tissu en environ 1 cm ³ morceaux / blocs. Ajouter suffisamment de PBS pour couvrir le tissu.

Remarque: Pour la reproductibilité des résultats, le tissu doit être coupé en morceaux de taille uniforme.

3. Utilisation de l'arrière d'une seringue stérile (10-20 ml) appliquer une pression (pas trop vigoureux ou prolongée) sur les morceaux de tissu thymique. Cette procédure va supprimer la majeure partie des thymocytes, réduisant ainsi le volume du tissu qui doit être digéré par la suite. Effectuez cette étape sur la glace et travailler rapidement.
4. La solution sera visiblement nuageux comme thymocytes sont libérés. Remuer doucement le plat et ensuite à l'aide d'une pipette de 5 ml ou un aspirateur de verre éliminer le surnageant contenant les thymocytes en prenant soin de ne pas aspirer accidentellement les morceaux de tissu.

Conseil: Racloir de culture cellulaire stérile peut être utilisé pour concentrer l'ensemble des morceaux de tissu sur un côté de la cuvette puis incliner l'antenne (angle de 45 °) et aspirer le surnageant. Remplacez-le par du PBS frais et répétez cette procédure jusqu'à ce que le surnageant est relativement transparent. Effectuer dernier lavage avec du RPMI plaine.

5. Émincer les morceaux de tissu avec des ciseaux aiguisés (aussi finement que possible, des fragments doivent être d'au moins 2-4 mm). Les fragments doivent être suffisamment petits pour entrer dans une pipette de 5 ml.

3. Préparation de l'unité cellulaire Suspension de Thymus tissus

Ici,deux approches alternatives pour cette étape sont décrits. La première approche décrit une digestion enzymatique de tissu typique (section 3.1) tandis que le second implique le traitement de tissu mécanique et enzymatique assistée par un dissociateur de tissu (section 3.2).

Ce protocole est optimisé pour le traitement d'échantillons de tissus d'un poids de 5 g. Pour les échantillons de tissus plus ou moins, ajuster les volumes de l'enzyme en conséquence.

3,1 digestion enzymatique de tissu typique pour obtenir une suspension cellulaire unique

1. Placez le tissu purée en tubes de 50 ml avec 10 ml de solution de collagénase / DNase par 5 g de tissu. Ajouter RPMI plaine pour donner un volume total de 20 ml.

Note: dans un tube de 50 ml à digérer jusqu'à 10 g de tissu. Régler le volume de l'enzyme en conséquence.

2. Incuber la suspension de tissu pendant 40 min à 37 ° C sous rotation lente dans une étuve thermique.

Remarque: les étapes d'incubation peuvent être réalisés soit dans un incubateur thermique avec une unité de rotation, ou dans un incubateur à 37 ° C de bactéries avec un agitateur.

3. La solution d'enzyme devient trouble que les cellules sont libérés en elle. A la fin de la digestion, tube à centrifuger à 110 g pendant 2 min pour sédimenter les fragments de tissu.
4. Recueillir le surnageant de cette ronde de digestion. Sédimenter la suspension de cellules pendant 10 min à 400 x g. Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 10 à 50 ml de milieu RPMI complet en fonction de la taille du culot cellulaire.
5. Gardez la suspension cellulaire dans 37 ° C incubateur avec le bouchon lâche.
6. Si les nombres de cellules plus importants sont désirés, l'étape de digestion peut être répétée avec les fragments de tissus restants et la première et la seconde digérer mis en commun. En outre, si TEC devrait être isolée, deux séries de digestions doivent être effectués.
7. Diluer une partie aliquote de la suspension de cellules dans du bleu trypan (1:10-1:100) et compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre.
8. Maintenir les cellules à 37 ° C dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à passer à la densité centrifugation Percoll (section 4). Isolement subséquent de sous-ensembles DC (section 5) sera effectuée à partir de ces cellules.

Remarque: Les tissus thymiques peuvent varier dans leur composition, en particulier avec l'âge, ce qui affecte l'efficacité de la digestion et de la génération d'une suspension à cellule unique.

9. Pour l'isolation ultérieure des cellules épithéliales thymiques (TEC) un troisième tour de digestion enzymatique est nécessaire. restes de tissus de remettre en suspension dans 10 ml de solution fraîche collagénase / DNase plus 10 ml de RPMI plaine et ajouter la trypsine / EDTA (01h50 de 2,5% stock) dans la solution.
10. Incuber à 37 ° C pendant 40 minutes avec une légère rotation. Pendant les 10 dernières - 15 min de l'incubation ajouter FCS (01h05) pour neutraliser l'activité de la trypsine.
11. Centrifuger à 110 g pendant 2 min à température ambiante dans les sédiments les fragments de tissus.

Remarque: Le tissu peut pas être complètement digéré après ces trois tours de digestions. L'âge et l'état général du tissu sont deux paramètres qui influent sur l'efficacité de dissociation du tissu thymique.

12. Recueillir le surnageant cellulaire et jeter les fragments de tissus sédimentées.
13. Centrifuger le surnageant de cellules à 400 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans culot cellulaire RPMI complet.

Astuce: Les culots cellulaires sont assez lâche, afin de prendre soin lors de l'élimination / l'aspiration surnageant.

14. Compter les cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre. Placez les cellules dans un incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que de procéder à la séparation de Percoll (section 4). Pré-enrichissement ultérieur de cellules TEC par la déplétion des cellules CD45 ^hi sera effectuée à partir de ces cellules (article 6).

3.2 traitement des tissus mécanique et enzymatique assistée par un dissociateur de tissu

Utilisation du tissu dissociateur abordent les étapes de la digestion des tissus peuvent être réduites à la moitié du temps nécessaire à l'approche décrite ci-dessus (section 3.1). Le protocole suivant est une version modifiée de celle qui est utilisée pour dissocier le tissu de thymus de souris pour l'isolement de ^7,8 TEC.

1. Transférer 5 g de morceaux de tissu haché (étape 2.5) dans un tube de C contenant 10 ml de solution de collagénase / DNase.
2. Adapter C tube sur la dissociateur de tissus et d'exécution du programme m_spleen_02 (10 sec). Répétez ce programme 4-5x (40-50 sec).
3. Incuber avec une légère rotation pendant 20 min à 37 ° C.
4. Centrifuger à 110 g pendant 2 min à température ambiante.
5. Recueillir le surnageant et procédez comme à l'étape 3.1.4. Ajouter 10 ml de solution fraîche collagénase / DNase.
6. Adapter C tube sur la dissociateur de tissus et d'exécution du programme m_spleen_01 (56 sec).
7. Incuber à 37 ° C pendant 20 minutes avec une légère rotation.
8. Centrifuger à 110 g pendant 2 min à température ambiante.
9. Collect surnageant et un culot de cellules de la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 400 x g. Procédez comme à l'étape 3.1.4.
10. Comme décrit dans 3.1.9 un troisième cycle de digestion est nécessaire pour l'isolation ultérieure des cellules épithéliales thymiques (TEC). Pour cela, des restes de tissus de remettre en suspension dans 10 ml de solution fraîche collagénase / DNase ainsi trypsine / EDTA (dilution 1:50 de stock de 2,5%)
11. Incuber à 37 ° C pendant 20 minutes avec une légère rotation. Ajouter FCS (1:5) et incuber pendant encore 10 min.

Remarque: En utilisant cette approche, après cette dernière étape digestion du tissu est généralement complètement dissocié et aucun des fragments de tissus non digérés sont observés.

12. Procédez comme dans les étapes 3.1.11-3.1.14.

4. Enrichissement de FDL de cellules utilisant la séparation Percoll densité

Après une digestion enzymatique du tissu, le total des suspensions de cellules individuelles thymiques sont soumis à un seul centrifugat de densité Percolll'étape d'ions pour enrichir en cellules de FDL. Le FDL de cellules est fortement enrichi pour APC. Les deux DC et TEC sont détectés dans cette fraction de cellules.

1. Utilisez suspension cellulaire unique obtenu à partir de la 1 ^ère et 2 ^ème digère pour mDC isolement (cellules regroupées, voir l'étape 3.1.8) ou 3 ^ème digest (pour l'isolement du TEC) (3.1.14). Centrifuger la suspension à cellule unique obtenue à partir de chaque étape de digestion à 400 xg pendant 10 min.
2. Préparer une solution de Percoll avec une densité finale de 1,07 g / ml au cours de cette étape de lavage (voir exemple dans le tableau ci-dessous).

   Préparation d'une solution de Percoll à une densité finale de 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Tube n °	1	2	3	4
   Non dilué Percoll (ρ = 1.130) (ml)	2.96	5,92	8.88	11,84
   NaCl 1,5 M (ml)	0,6	1.20	1.8	2.4
   H 2 O distillée (ml)	2.44	4,88	7.32	9,76
   Volume de dilution de travail final	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Le nombre de tubes dépend de Percoll les nombres de cellules déterminées dans les étapes 3.1.8 et / ou 3.1.14. Combiner les solutions stériles et bien mélanger. Pour l'isolation optimale, 0,6-1 x 10 ⁹ cellules peuvent être chargés par tube de Percoll. Combiner les solutions stériles et bien mélanger.

Astuce: Percoll est sensible à la lumière et en plus il doit être conservé au froid. Préparer d'abord le mélange contenant le NaCl et H ₂ O (RT) et d'ajouter, non dilué Percoll dernière, juste avant la remise en suspension des cellules dans la solution de Percoll.

Comme matière première dans ce protocole, nous utilisons des tissus thymus enlevé des enfants subissant une chirurgie cardiovasculaire correctives (ministère de la chirurgie thoracique et cardiovasculaire, Clinique universitaire de Tübingen) obtenus après consentement éclairé et sous les directives institutionnelles. Ce produit rejeté peut varier considérablement en taille 2-30 g ou plus. Le nombre de MDC et des sous-ensembles de TEC (technologie cTEC et MTEC) qui sont obtenus dépend de la taille ainsi que l'âge de l'échantillon de tissu de thymus utilisé pour l'isolation.

La figure 2 montre un assez grand morceau de tissu (~ 9 cm) obtenue à partir d'un enfant de six ans. Une première étape importante dans la préparation de ce protocole est le nettoyage du tissu de parties indésirables (indiquées par les flèches blanches).

Tissu thymus a été traitée comme décrit dans les sections 2 et 3.1 du protocole d'obtenir une suspension cellulaire unique qui a été séparée à l'aide d'une seule densité Percoll centrifugation step Bien que la suspension cellulaire unique contient environ 3% des cellules HLA-DR + (figure 3A), après centrifugation Percoll ce pourcentage est augmentée dans la fraction basse densité (LDF), contenant des cellules de grande taille, de 15 à 40%, tandis que le fraction de haute densité (HDF) qui se compose principalement de petite taille uniformes thymocytes contient pratiquement pas de ces cellules (figure 3B). La fraction d'intérêt (LDF), contenant enrichi APC a ensuite été recueilli et lavé à prélever des cellules à utiliser dans les étapes d'isolement ultérieurs.

Bien que thymique mDC peut être identifiée par l'expression d'un certain nombre de marqueurs de surface, y compris CD11c9, 10, pDC expriment des marqueurs tels que BDCA-2, BDCA-4, CD45RA et CD123 ^11,12. Après enrichissement des cellules de FDL, les deux types de cellules constituent 2-10% de cette fraction, ce qui permet leur isolement efficace également en plus grand nombre, soit par séparation magnétique de cellules ou de tri de s'écouler CD11c ⁺ ou BDCA-4 ⁺⁶ cellules.

La figure 4 montre l'isolement efficace de CD11c ⁺ cellules en utilisant le protocole de séparation magnétique des cellules modifié décrit dans la section 5. Après isolement, la pureté du CD11c ⁺ DC est de 93% établie par immunomarquage des cellules isolées. En moyenne, la reprise de isolé CD11c ⁺ DC est de 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ mDC par 10 ⁹ cellules thymiques totales données. Tableau 1 les émissions obtenues à partir de plusieurs échantillons thymus individuelles de différents âges et poids de tissu avec une gamme de l'entrée unique suspensions cellulaires ainsi que les numéros de FDL totaux et le rendement ultérieur ^{de +} CD11c et de pureté.

Dans la fraction enrichie en APC, seulement environ 0,5% des cellules sont CD45 ⁺ ou EpCAM ^lo CD45 ^{+ neg} EpCAM. CTEC et mTEC peuvent être triés à partir des cellules digérés par la trypsine CD45 ^{lo / neg} enrichis stromales que EpCAM ^l o ⁺ CDR2 et EpCAM ^salut CDR2 ^-, respectivement, comme indiqué sur la figure 5.

Figure 1. Un schéma simplifié de l'organisation cellulaire et la composition du thymus humain. Le thymus est constitué de thymocytes, à différents stades de maturation, et un réseau cellulaire hétérogène appelé le stroma thymique formant l'environnement thymique. Les principaux types de stroma thymique cellulaires sont MDC et PDC, les cellules épithéliales (divisés en deux grandes catégories en fonction de leur localisation dans le lobule: corticales et médullaire) et les macrophages abréviations: DC, les cellules dendritiques; MDC, les cellules dendritiques myéloïdes. pDC, les cellules dendritiques plasmacytoïdes; Mφ, macrophages, mono, monocytes; CTEC, les cellules épithéliales corticales; mTEC, les cellules épithéliales médullaires.

Figure 3. Purification de l'analyse thymique APC. FACS des différentes étapes de la procédure de purification. Des suspensions monocellulaires de tissu de thymus ont été obtenus par rupture mécanique et les digestions enzymatiques série et enrichis APC (cellules de FDL) séparation par densité de Percoll-. Cellules avant (A) et après (B) la séparation de Percoll-densité ont été colorées avec anticorps anti-HLA-DR-PE pour vérifier l'enrichissement APC. gamme de pourcentage de HLA-DR + cellules généralement observés est INDICAT ed.

Figure 4. Isolation de CD11c ⁺ mDC. Tissu thymique a été digéré à l'aide de la collagénase A / DNase I pour créer une suspension cellulaire unique. CD11c ⁺ mDC représentent seulement une population mineure de la suspension de cellules individuelles (0,6%). Après enrichissement des cellules par l'intermédiaire d'une séparation de FDL densité Percoll le pourcentage de cellules CD11c ⁺ augmente à environ 9%. Les cellules ont été marquées avec FDL anticorps CD11c-PE et ensuite isolés en utilisant des billes magnétiques (anti-PE). Une nouvelle analyse de l'CD11c ⁺ population directement après la séparation magnétique des cellules par FACS a indiqué 93% de pureté. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 5. Enrichissement de CD45 des cellules ^{lo / neg} et le tri ultérieur des sous-ensembles de TEC.) Représentant parcelles de points montrant les pourcentages de CD45 négatif / bas cellules stromales thymiques dans le total des suspensions de cellules individuelles avant et après la séparation de Percoll densité (9% et 16,2%, respectivement). B) Les cellules de FDL a été appauvries en cellules CD45 ^hi utilisant des billes magnétiques et les sous-ensembles de TEC triés de la fraction appauvrie en EpCAM ^salut CDR2 ^- (MTEC) ou EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

Tableau 1. Nombre de cellules en suspension de cellules simples totaux libérés après deux tours de digestion ainsi que les rendements des cellules FDL après Percoll séparation sont présentés pour les isolements effectués dans des échantillons de thymus de six personnes d'âge différent et le poids du tissu. Fréquences de MDC ont été déterminés par cytométrie de flux sur la base sur l'expression de CD11c dans les cellules de FDL totales (APC enrichi). rendement et la pureté de CD11c ⁺ cellules après la séparation des billes magnétiques sont indiqués pour chaque donateur.

Le protocole décrit ici est une modification du protocole publié par Gotter et al ^4. Les étapes critiques dans le protocole sont la condition et la préparation initiale du tissu ainsi que la séparation de densité Percoll. Nous vous recommandons fortement de traiter le tissu le plus tôt possible après la collecte. Il est important de travailler vite mais bien lors du nettoyage et couper le tissu. Lors du lavage des thymocytes décrit à l'étape 2.3, il est essentiel de trouver le juste équilibre dans l'application de pression à l'arrière du piston de la seringue sur les morceaux de tissu comme une pression trop forte et prolongée peut endommager les cellules stromales. Superposition de la moyenne au-dessus de la solution / suspension cellulaire Percoll sans causer de perturbations peut également exiger un peu de pratique. Après centrifugation, il est important de recueillir toutes les cellules de la fraction de faible densité aussi rapidement que possible à partir de la couche de Percoll avec un minimum de solution de Percoll.

Larendements cellulaires globaux et des chiffres relatifs APC peuvent être très variables (voir le tableau 1) et dépendent du donneur (surtout par rapport à l'âge) et les compétences de préparation de l'expérimentateur. Pour un bref aperçu, suspensions de cellules peuvent être colorées avec HLA-DR et / ou d'autres marqueurs qui suit différentes étapes du protocole comme vous le souhaitez. Tous les anticorps utilisés pour l'analyse phénotypique doit être adaptée pour obtenir des résultats optimaux.

En raison de la relativement faible abondance des types d'APC dans le thymus par rapport à thymoctyes, de gros morceaux de thymus pourraient être nécessaires si un plus grand nombre de cellules isolées sont souhaitées.

Si un dissociateur de tissu est disponible dans le laboratoire, ce sera considérablement accélérer le traitement des tissus, mais les deux variantes décrites ici fonctionnent aussi bien. Un problème relativement fréquent pourrait être l'agglutination des cellules, en particulier pendant les étapes entre la séparation de Percoll et MACS / tri FACS. Dans ce cas, une courte DNase je creuseestion tel que décrit dans le protocole général de résoudre le problème. Depuis tissu thymique est successivement remplacé par du tissu adipeux au cours du vieillissement, thymi de donneurs plus âgés pourrait contenir un peu de gras, qui nagera sur le dessus du tube après centrifugation des suspensions de cellules individuelles obtenues à partir des différentes étapes de la digestion. Dans un tel cas, la graisse doit être retiré avec une pipette avant de continuer le protocole. Pour des résultats optimaux, ainsi que des raisons d'économie nous vous conseillons de titrer non seulement les anticorps, mais aussi les microbilles anti-PE (articles 5 et 6). Pour l'isolement des TEC de thymus de la souris, des mélanges d'enzymes de remplacement ont été décrites pour améliorer le rendement de ^8,13 TEC, mais nous ne les avons pas testé avec les tissus humains.

En principe, d'autres cellules APC et stromales thymiques, comme les cellules B et les pDC peuvent également être isolés à partir des cellules de FDL (ci-après digestion de collagénase / DNase et Percoll) par FACS / MACS tri si les marqueurs sont connus respectifs. Par exemple, pour les pDC, BDCA-2, BDCA-4 et CD123 ont été décrits en tant que marqueurs ^6,14. Si l'analyse ou l'isolement des sous-ensembles de thymocytes est souhaitée, nous recommandons d'utiliser les cellules libérées en serrant (étape 2.3), car ils sont tout à fait pur et ont subi une manipulation minimale.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Nous sommes reconnaissants envers les chirurgiens du département de chirurgie thoracique et cardiovasculaire, Clinique universitaire de Tübingen pour nous fournir les échantillons de thymus et Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Allemagne) pour fournir l'anticorps CDR2. Nous tenons également à remercier Hans-Jörg Bühring et Sabrina Grimm du centre de tri (Université de Tübingen). Ce travail a été soutenu par le SFB 685 et la Fondation Hertie.