Method Article
T lenfosit göç homing lenfoid organlar, damar çıkış sırasında oluşur ve periferik dokularda girmeden. Burada, T lenfosit göçü analiz etmek için kullanılan bir protokol tarif In vitro.
T lenfositlerin göçü, diğer hücrelere veya ekstraselüler matriks proteinleri ile ifade ligandlar hücre yüzeyinde integrinler yapışkan bir etkileşim içerir. Düşük bir yakınlık durumuna hücre öncü afinitesi yüksek bir devlet İntegrinlerin hassas uzaysal aktivasyonu, T lenfosit geçiş için önemli
1. İnsan T Lenfositler izolasyonu
2. İnsan T Lenfositler Kültür
3 İn Vitro Lenfosit Göç Testi
4. NIS Elements Yazılım Kullanarak Bir Resim Sırası yakalama
5. Temsilcisi Sonuçlar
IL-2 veya IL-15, T lenfositleri ya varlığı kültür, 6 günyanı sıra olumlu CD4 ve / veya CD8 boyama pozitif CD3 boyama tarafından belirlenir hücrelerinin>% 98 kadar olun. IL-2 için, biz% 83 CD4 + hücreler,% 15 CD8 + ve <% 1 CD4 + CD8 + hücreler bulundu. IL-15 için,% 88 CD4 + hücreler, CD8 +% 11 ve <% 1 CD4 + CD8 + hücreler bulundu. ICAM-1/SDF-1 yüzeylerde T lenfosit göç sırasında, hücreler, yaklaşık 1 saatlik zaman dilimi içinde sürekli 15 mm / dak bir hız sergiledi. ICAM-1/SDF-1 T lenfosit göç, LFA-1-aracılı adezyon bağımlı olarak bir anti-LFA-1 ligand engelleme antikor göç ciddi engeller.
Şekil 1. T lenfositleri göç Hücre izleme, tam kan izole edilen ve 6 gün boyunca IL-2 veya IL-15 varlığında kültür T lenfositleri 10 mcg / mL ICAM-1 ve kaplamalı cam tabanlı yemekler yapışmaz ve geçiş için izin verildi 2 mcg / ml SDF-1. Görüntüler 30 dakika boyunca her 10 saniyede elde edildi. Hücreler her görüntünün Volocity yazılım kullanarak zaman içinde tespit ve takip edilmiştir. Bu film ~ 15 mm / dak hızda T lenfositlerin rastgele göç gösterir.
Videoyu görmek için buraya tıklayın.
T lenfositleri göç Film 1. Hücre izleme. T lenfositlerin, tam kan varlığında izole ve kültür IL-2, 6 gün süreyle veya IL-15, 10 mikrogram / ml ICAM-1 ve 2 mcg / ml SDF-1 ile kaplı cam dipli yemekleri üzerine yapışır ve göç etmeye izin verildi . Görüntüler 30 dakika boyunca her 10 saniyede elde edildi. Hücreler her görüntünün Volocity yazılım kullanarak zaman içinde tespit ve takip edilmiştir. Bu film ~ 15 mm / dak hızda T lenfositlerin rastgele göç gösterir.
Şekil 2 Spatiotemporal hücre konumu. Her bir hücrenin XY koordinatlarını Volocity yazılımı kullanarak her zaman noktası için elde edilmiştir.
Şekil 3 "Örümcek web arsa." XYt kullanarak, her bir hücre, 15 hücre rastgele seçilmiştir ve kökeni ortak bir başlangıç noktası ile çizilen koordine eder. Örümcek web grafikleri karşılaştırarak, farklı deneysel koşullar arasında göç farklılıkları hızlı bir görsel tasviri verir. T lenfosit göçü kontrol koşulları altında (sol panel) ve anti-LFA-1 ligand engelleme antikor (sağ panel) varlığı Arsalar.
Bu deneyde, birincil insan T lenfosit motilite analiz etmek için basit bir sistem hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. In vitro göç deneyleri, çeşitli hücre tipleri hareketine katılan birçok moleküller ve sinyal yolları rolleri incelemek kullanılmıştır . Bizim protokol kendi deney tasarımı akılda tutulması gereken bazı kritik kontrolleri şunlardır: 1), sığır serum albumini (BSA) veya poli-L lisin (PLL) gibi yapışkanlı olmayan veya non-integrin yapışkan substrat kaplamalar, sırasıyla, 2 ) integrin özel SDF-1 protokolünde açıklandığı gibi uyarıcı sinyal olmadan integrin özgüllük ve 3) işbirliği kaplama belirlemek için antikor tedavisi engelliyor.
Bu proje, Ulusal Sağlık Grants HL087088 (MK) Enstitüleri ve HL18208 (MK) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300070.03 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
1-Step Polymorphs | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AN221725 | |
PHA | Remel, Thermo Fisher Scientific | R30852801 | |
Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | |
Protein G | Sigma-Aldrich | 19459 | |
Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | |
Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır