Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro

La migrazione dei linfociti T si verifica durante homing verso gli organi linfoidi, uscire dal sistema vascolare, e di entrare in tessuti periferici. Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per analizzare la migrazione dei linfociti T In vitro.

La migrazione dei linfociti T richiede l'interazione adesiva delle integrine superficie cellulare con ligandi espressi su altre cellule o con proteine ​​della matrice extracellulare. L'attivazione delle integrine preciso spazio-temporale da uno stato a bassa affinità ad uno stato ad alta affinità al bordo cellula principale è importante per la migrazione dei linfociti T

1. Isolamento dei linfociti T

1. Ottenere sangue umano da un donatore sano. Lasciare che il sangue a temperatura ambiente (~ 30 min) prima di procedere alla fase successiva.
2. Delicatamente Pipettare 3 ml di sala multimediale densità Polymorph gradiente di temperatura in un ml 8 a fondo rotondo in polistirene. Delicatamente aggiungere 3 ml di sangue intero in cima ai media Polymorph. E 'importante evitare la sovrapposizione dei due reagenti.
3. Centrifugare le provette a 500 xg per 45 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono ora separati da altri componenti del sangue nello strato superiore delle cellule. Lo strato PBMC appare, dall'alto verso il basso, come la prima band nuvoloso.
5. Rimuovere con attenzione il chiaro di colore giallo fase superiore del sangue, sopra il livello PBMC, e quindi utilizzare un P1000 micropipetta per trasferire lo strato PBMC a 15 ml o 50 ml di tubo conico.
6. Lavare i PBMC due volte con PBS, centrifugazione le cellule a 500 xg per 5 minuti ogni volta. Il supernatante sarà un po 'torbida dopo ogni lavaggio.

2. Cultura dei diritti dell'uomo e Linfociti T

1. Utilizzando una pipetta, trasferire il PBMC in un pallone T-75 della cultura in 20 ml RPMI 1640 supporti contenenti il ​​10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 1 mg / ml fitoemoagglutinina (PHA).
2. Incubare a 37 ° C e 5% di CO ₂ per almeno 1 ora, e fino a 24 ore. Questo passaggio consente monociti, che sarà aderente alla superficie del pallone, di essere separati dai linfociti che rimangono in sospensione. Se una breve incubazione (1 ora) viene utilizzata in questa fase, è accettabile utilizzare mezzi RPMI 1640 contenente il 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina senza integrazione con PHA, come specificato al punto 2.1.
3. Rimuovere con cura tutti i supporti dal pallone, aggiungerlo ad un tubo da 50 ml conica, e centrifugare a 500 xg per 5 minuti.
4. Risospendere il pellet di cellule, che ora contiene principalmente i linfociti, le cellule e il trasferimento a un nuovo T-75 beuta contenente 25 mL RPMI 1640 supporti contenenti il ​​10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 1 mg / mL di PHA.
5. Incubare a 37 ° C per 3 giorni (2 giorni se l'incubazione iniziale di PBMC era notte). Dopo 24 ore di crescita, può essere necessario aggiungere 15-20 ml di mezzi freschi e il trasferimento ad un T-175 più grandi pallone.
6. Dopo 3 giorni, utilizzare una pipetta di rimuovere il supporto e linfociti sospeso il pallone e in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti.
7. Risospendere il pellet cellulare e le cellule trasferire in un pallone nuovo T-75 o T-175 contenente 25 ml (T-75) o 50 ml (T-175) RPMI 1640 con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 20 ng / mL umano IL-2 o IL-15.
8. Crescere linfociti per 4-7 giorni. Se a partire da un T-75 fiasco, la cultura dovrà essere ampliato e trasferito in un T-175 fiasco dopo 1-2 giorni.

3. Test in vitro la migrazione dei linfociti

1. 1 giorno prima del test di migrazione, il cappotto di un fondo di vetro piatto 0,17 mm con 20 mg / ml di proteina A o G in PBS notte a 4 ° C.
2. Lavare il piatto ampiamente con PBS.
3. Immobilizzare ICAM-1/Fc umano (10 mg / mL) e umano SDF-1 (2 mg / mL) con l'aggiunta di questi reagenti in soluzione PBS al piatto e incubazione 4 ore a temperatura ambiente.
4. Preparare i linfociti T determinando prima la densità delle cellule in coltura nel T-175 con un fiasco emocitometro. Circa 2-5 x 10 ⁵ cellule dovrebbero essere utilizzati per piatto per ottenere una densità cellulare appropriato per l'analisi della migrazione.
5. Lavare i linfociti T per due volte con PBS e poi risospendere in 1 ml L-15 supporti contenenti 1 mg / ml di D-glucosio.
6. Lavare il piatto rivestito con ICAM-1/Fc e SDF-1 estesamente con PBS.
7. Trasferimento dei linfociti T in 1 media ml al piatto e mantenerli a 37 ° C.

4. Catturare una sequenza di immagini Utilizzando il software NIS Elements

1. Aperto il software NIS Elements.
2. Nel menu delle impostazioni della fotocamera, scegliere "binning 2x2" come modalità per entrambe le immagini dal vivo e la cattura delle immagini.
3. Vai al menu Applicazioni e scegliere Definisci / Esegui esperimento.
4. Scegli l'intervallo di tempo tra le immagini e la lunghezza totale della sequenza di acquisizione delle immagini.
5. Premere il tasto "Run" per iniziare l'acquisizione di immagini.
6. Le celle possono essere monitorati e parametri di migrazione (velocità, lunghezza del percorso, spostamento, ecc) quantificato utilizzando uno dei pacchetti software, tra cui ImageJ, AutoQuant o Volocity (Figura 1).
7. Per generare un "complotto ragnatela", le coordinate XY per ogni cella e timepoint sono raccolti (Figura 2) e proiettate su un grafico con un comune punto di partenza per ogni cella all'origine (Figura 3).

5. Rappresentante Risultati

Il giorno 6 di coltura in presenza di uno di IL-2 o IL-15, i linfociti Tcostituiscono> 98% delle cellule, come determinato dalla colorazione CD3 positivi e CD4 positivi e / o CD8 colorazione. Per IL-2, abbiamo trovato 83% + cellule CD4, CD8 + 15% e <1% CD4 + CD8 +. Per IL-15, abbiamo trovato 88% + cellule CD4, CD8 + 11% e <1% CD4 + CD8 +. Durante la migrazione dei linfociti T in ICAM-1/SDF-1 substrati, le cellule mostravano una velocità di circa 15 micron / min che può essere sostenuta per un tempo di 1 ora di tempo. La migrazione dei linfociti T sulle ICAM-1/SDF-1 dipende LFA-1-mediata adesione, come un anti-LFA-1-bloccante ligando anticorpi inibisce fortemente la migrazione.

Figura 1. Monitoraggio della migrazione delle cellule T linfociti. Linfociti T isolati dal sangue intero e coltivate in presenza di IL-2 o IL-15 per 6 giorni è stato permesso di aderire e migrare sul fondo di vetro piatti rivestiti con 10 mg / ml ICAM-1 e 2 mg / mL SDF-1. Immagini sono state acquisite ogni 10 secondi per 30 minuti. Le cellule sono state identificate in ogni immagine e monitorati nel tempo utilizzando un software Volocity. Questo filmato mostra la migrazione dei linfociti T casuale ad una velocità di circa 15 micron / min.

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Movie 1. Inseguimento cella di migrazione dei linfociti T. Linfociti T isolati dal sangue intero e coltivate in presenza di IL-2 o IL-15 per 6 giorni è stato permesso di aderire e migrare sul fondo di vetro piatti rivestiti con 10 mg / ml ICAM-1 e 2 mg / ml SDF-1 . Immagini sono state acquisite ogni 10 secondi per 30 minuti. Le cellule sono state identificate in ogni immagine e monitorati nel tempo utilizzando un software Volocity. Questo filmato mostra la migrazione dei linfociti T casuale ad una velocità di circa 15 micron / min.

Figura 2. Posizione della cella spazio-temporale. Le coordinate XY di ogni cella sono stati ottenuti per ogni punto temporale utilizzando il software Volocity.

Figura 3. "Spider complotto web." Utilizzando il XYT coordinate per ogni cella, 15 cellule sono state scelte a caso e tracciati con un punto di partenza comune all'origine. Confrontando trame ragnatela dà una rappresentazione visiva rapido delle differenze di migrazione tra diverse condizioni sperimentali. Parcelle per la migrazione dei linfociti T in condizioni di controllo (pannello di sinistra) e in presenza di un anti-LFA-1-bloccante ligando anticorpi (pannello di destra).

In questo esperimento, forniamo i dettagli su un sistema semplice per analizzare la motilità del primario linfociti T umani. Saggi di migrazione in vitro sono stati utilizzati per sezionare i ruoli di molte molecole e le vie di segnalazione coinvolte nella locomozione dei vari tipi di cellule. Alcuni controlli critici da tenere a mente quando si progetta l'esperimento proprio dal nostro protocollo sono: 1) non-adesivo o non-integrina rivestimenti substrato adesivo, come sieroalbumina bovina (BSA) o poli L-lisina (PLL), rispettivamente, 2 ) integrina-specifico trattamento bloccante anticorpi per determinare la specificità integrina, e 3) co-rivestimento senza segnale stimolante, come SDF-1 descritto nel nostro protocollo.

Questo progetto è stato sostenuto dal National Institutes of Health Borse HL087088 (MK) e HL18208 (MK).