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Tリンパ球遊走には、リンパ器官、血管系から出口へのホーミング中に発生し、末梢組織に入る。ここで、我々は、Tリンパ球の遊走を分析するために使用できるプロトコルを記述する in vitroで。
Tリンパ球の遊走は、他の細胞や細胞外マトリックスタンパク質と発現するリガンドと細胞表面のインテグリンの接着剤の相互作用を伴います。低親和性状態からセル最先端で高親和性状態へのインテグリンの正確な時空間的活性化は、Tリンパ球遊走に重要です。
1。ヒトTリンパ球の分離
2。ヒトTリンパ球の培養
(3) 体外リンパ球遊走アッセイで
4。 NISの要素ソフトウェアを用いた動画像のキャプチャ
5。代表的な結果
IL - 2またはIL - 15、Tリンパ球のいずれかの存在下での培養の6日目として正のCD3の染色だけでなく、肯定的なCD4および/またはCD8染色によって決定される細胞の> 98%を、占める。 IL - 2の場合、我々は83%のCD4 +細胞を、15%CD8 +と<1%のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 IL - 15の場合、我々は88%のCD4 +細胞を、11%CD8 +と<1%のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 ICAM-1/SDF-1基板上でのTリンパ球の移行時に、細胞は1時間の期間にわたって持続することができる約15μm/分の速度を示した。抗LFA - 1リガンド阻害抗体は、深刻な移行を阻害するとして。ICAM-1/SDF-1でTリンパ球遊走には、LFA - 1媒介接着に依存しています
図1。 Tリンパ球の移行の細胞追跡。Tリンパ球全血から分離し、6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養を10μg/ mLのICAM - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させたと濃度2μg/ mLのSDF - 1。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。
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Tリンパ球の移行の動画1。細胞のトラッキング。全血と6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養から分離されたTリンパ球は、10μg/ mLのICAM - 1および2μg/ mLのSDF - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させた。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。
図2時空間セルの位置。各セルのXY座標がVolocityソフトウェアを使用して、各時点が得られた。
図3。"スパイダーウェブのプロット。"各セルのXYTの座標を使用して、15セルがランダムに選択し、原点を共通の出発点でプロットした。クモの巣プロットを比較すると、異なる実験条件間移行の違いを簡単に視覚的描写を与える。制御条件の下でTリンパ球遊走(左パネル)および抗LFA - 1リガンド阻害抗体(右パネル)の存在下でプロット。
この実験では、一次ヒトTリンパ球の運動性を分析するためにシンプルなシステムについて詳しく説明します。vitroでの遊走のアッセイでは多くの分子と種々の細胞型の運動に関与するシグナル伝達経路の役割を解明するために使用されている。我々のプロトコルから独自の実験を設計するとき心に留めておくべきいくつかの重要なコントロールが含まれます:1)、ウシ血清アルブミン(BSA)またはポリ- Lリジン(PLL)などの非接着または非インテグリン接着基質のコーティングを、それぞれ、2 )インテグリン特異的にそのような我々のプロトコルで説明されているSDF - 1などの刺激シグナル、なし抗体のインテグリン特異性を決定するために、治療、および3)共同コーティングをブロック。
このプロジェクトは、健康補助HL087088(MK)とHL18208(MK)の国立研究所によってサポートされていました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300070.03 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
1-Step Polymorphs | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AN221725 | |
PHA | Remel, Thermo Fisher Scientific | R30852801 | |
Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | |
Protein G | Sigma-Aldrich | 19459 | |
Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | |
Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
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