Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Protein fonksiyonu yakından protein lokalizasyonuna birleştirilmiştir. Yerinde Subselüler fraksiyonasyon bazı proteinler belirli bir konuma veya hücre içi bölmesi ile sınırlı olmasına rağmen, birçok protein, belirli bir Subselüler etki alanı veya yapısı ile sıkı sıkıya ilişkili bir alt nüfusa sahip, serbest döviz serbestçe difüzyon nüfus olarak mevcuttur. görselleştirme sağlar protein bölümlendirme ve aynı zamanda protein belirli yapılara lokalize alt-topluluklarda ortaya çıkarabilir. Örneğin, çözünür sitoplazmik proteinleri ve gevşek tutulan nükleer proteinlerin çıkarılması kromatin ile bazı transkripsiyon faktörleri istikrarlı bir ilişki ortaya çıkarabilir. DNA sonraki sindirim topluca nükleer iskele veya nükleer matriks denir protein ve RNA ağı ile birlikte, bazı durumlarda ortaya çıkarabilir.

Burada, yapışık ve yapışmaz memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde fraksiyonasyon sırasında gerekli adımları açıklar . Protein görselleştirme spesifik antikorların ya da floresan füzyon proteinleri ve floresan mikroskopi kullanılarak elde edilebilir. Antikorlar ve / veya özel bölme ya da yapılar için belirteç olarak hareket floresan boyalar protein yerelleştirme ayrıntılı olarak eşlenen izin yerinde fraksiyonasyon da batı her fraksiyon protein miktarları karşılaştırmak için blot ile kombine edilebilir. Bu basit biyokimyasal yaklaşım, aksi tespit edilmemiş kalacaktı dernekler ortaya çıkarabilir.

I. fraksiyonasyon için hazırlanması

Bu bölümde, poli-L-Lizin kaplı mikroskop lamelleri ve fraksiyonasyon önce hücre eki hazırlama açıklamaktadır. Hücrelerin Gerekirse geçici eki önce veya sonra ya protein ekspresyon vektörleri ile transfekte olabilir.

A. poli-L-Lizin kaplı lamelleri hazırlanması

1. Distile su 1mg/ml poli-L-Lizin bir çözüm hazırlayın.
2. Sallanan bir platform üzerinde en az 1 saat için 22 çözüm onları kuluçka poli-L-Lizin Coat temiz lamelleri ° C
3. Steril distile su ile kaplı lamelleri iki kez yıkayın ve% 96 etanol ile tek bir yıkama ile takip.
4. Hava filtre kağıt parçası üzerinde kaplı lamelleri kuru ve kuru bir konteyner (bir kez kuru onlar yığılmış olabilir) ileride kullanmak üzere saklayın.

Lamelleri B. takılması hücreleri

Sigara yapışık hücrelere (burada K562 hücreleri kullanır)

1. 6-plaka kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde çok iyi bir poli-L-Lizin kaplı lamel yerleştirin.
2. 7x10 ⁵ hücre yoğunluğu Tohum K562 hücre / Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS), PS (penisilin 100units/ml, streptomisin 100mg/ml) ile desteklenebilir. K562 hücrelerinin durumda geçici transfeksiyon hücrelerin ekim önce elektroporasyon (0.4cm elektroporasyon küvetler 250V / 975μF medya 200μl 1x10 ⁷ hücre) kullanılarak yapılabilir.
3. 37 ° C% 5 CO ₂ hücreleri az 24 saat süreyle inkübe edin.
4. Orta kapalı dökün ve hücreler iki kez yıkayın buz fosfat tamponlu salin (PBS).
5. Subselüler fraksiyonasyon protokolü ile izleyin.

Yapışık hücrelere (burada Cos-7 hücre)

1. 6 plaka iyi bir kaplanmamış lamel yerleştirin.
2. 37 ° C PBS içinde iki kez yıkayın prewarmed
3. , 37 tripsin (% 0.03 EDTA,% 0.25 'lik tripsin) PBS içinde sindirerek hücrelerin Ayır ° C'de 2 ila 5 dakika. Bu ağırlıklı olarak bireysel yüzen hücreler gibi hücrelerin aşırı sindirimi ve sindirim en kısa sürede durdurmak için önemlidir.
4. /% 10 FBS ve PSG (penisilin 100 ünite / ml, streptomisin 100ug/ml ve L-glutamin 292ug/ml) ile desteklenmiş DMEM 6 plaka ekim 3x10 ⁵ hücre yoğunluğu hücreler tarafından sindirimi durdurur normal lamelleri. Yapışık hücrelere genellikle gerekirse Ancak, poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanılabilir, normal mikroskop lamelleri üzerine takın.
5. 37 ° C ve% 5 CO ₂ hücreleri az 24 saat süreyle inkübe edin. Cos-7 hücreleri durumda geçici transfeksiyon Fugene gerekirse 6 (Roche) ve 37, bir 24 saat daha kurtarmak için sol hücreleri kullanılarak yapılabilir ° C ve% 5 _CO 2 .
6. Orta dökün ve hücrelerin buz PBS ile iki kez yıkayın.
7. Subselüler fraksiyonasyon protokolü ile izleyin.

II. Subselüler fraksiyonasyon

In situ fraksiyonu Şekil 1'de gösterildiği gibi şematik göre yapılır ve bir yönteme dayalı daha ^önce 5 açıklanan değişiklikler, daha ^önce 7 açıklanan ve aşağıda ayrıntılı bir protokol. Bu sıvı çıkarmadan önce lamel çıkarmadan her fraksiyonasyon adım izleyerek yeni bir 6-plaka lamelleri aktarmak için tavsiye edilir. Sadece dört lamelleri görüntüleme için gerekli olmasına rağmen, ek lamelleri, bu paralel olarak yapılacak ise batı blot tam hücre özü ve nükleer matriks kesirler üretmek için gereklidir.

1. Hazırlayın ve hücre iskeletinin tampon (CSK) filtresi: 10mM BORU, 300mm Sakkaroz, 100 mM NaCl, 3mm MgCl _2, 1mm EGTA. CSK tampon fraksiyonasyon gün taze hazırlanmalıdır.
2. Gerekirse bir lamel hücreleri doğrudan lamel üzerine hafifçe 200ul TES tampon (% 1 SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH: 7.4) yerleştirerek ve 1 ya da 2 dakika süreyle inkübe blot batı için bütün hücre elde etmek için kullanılabilir 22 ° C Sonra 1M 250ul (NH ^{4) 2} SO ⁴ ve diğer batı örnekleri hazır olana kadar buz üzerinde inkübe ekleyerek tüm hücre özü çıkarılır ve proteinleri presipite olabilir.
3. 22 ° C eğerek 6 iyi plakalı iki veya üç kez kalan lamelleri, 1 ml buz PBS ile iki kez yıkayın.
4. Tüm hücre ve taze bir 6-plaka transfer temsil eden lamel çıkarın. Hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile izleyin.
5. Kalan kuyulardan PBS yavaşça çıkarın.
6. Yavaşça 200ul CSK tampon yerleştirerek, sitoplazmik ve gevşek düzenlenen nükleer proteinlerin Özü + 0.1% (V / V) doğrudan kalan her lamel üzerine Triton X-100 ve kuluçka1 dakika boyunca buz.
7. Sitoplazmik ve gevşek tutulan nükleer özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir.
8. 22 lamelleri 1ml buz PBS ile iki kez yıkayın ° C devirme 6 plakalı.
9. Sıkıca tutulan nükleer malzeme temsil lamel çıkarın ve hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile takip.
10. Sonra yavaşça geri kalan kuyulardan PBS kaldırmak + 0.5% (V / V) Triton X-100 doğrudan kalan her lamel üzerine hafifçe 200ul CSK tampon yerleştirerek ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe tarafından sıkıca tutulan proteinler ayıklayın.
11. Sıkıca tutulan özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir.
12. 22 lamelleri 1ml buz PBS ile iki kez yıkayın ° C devirme 6 plakalı.
13. Kromatin fraksiyonu temsil eden lamel çıkarın ve hücre fiksasyon ve immüno-floresans protokol ile takip.
14. CSK sonra yer 200ul tamponu + 100ug/ml DNaz I 30 dakika kalan lamelleri ve inkübe üzerine 37 ° C yavaşça kalan kuyulardan PBS kaldırmak
15. Kromatin özü çıkarın ve 2. adımda açıklandığı gibi hızlandırabilir.
16. ° C eğerek 6-plaka 22 lamelleri buz PBS ile iki kez yıkayın.
17. Nükleer matriks fraksiyonu temsil lamel çıkarın ve hücre tespit ve immuno-floresans protokol ile takip.
18. Gerekirse matriks proteinlerine 2. adımda açıklandığı gibi 200ul TES tampon kullanarak blot batı için ek bir matris lamel çıkarılabilir.
19. Western blot örnekleri, 4 masa üstü mikrosantrifüj 13000 rpm'de santrifüje tabi tutulmalıdır ° C ve 40ul SDS yükleme tamponu (62.5mm Tris-HCl, pH 6.8,% 2 SDS (w / v), 50 mM DTT, yeniden süspanse pelet % 10 gliserol, SDS-PAGE ile analiz öncesi% 0.01 Bromophenol Mavi (w / v)).
    
    Şekil 1. 10mM BORU, 300mm Sakkaroz, 100 mM NaCl, 3mm MgCl _2, 1mm EGTA yerinde Subselüler fraksiyonasyon şematik Sitoiskelet tampon (CSK) oluşur. TES tampon% 1 SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH: 7.4 oluşur.

III. Hücre fiksasyon ve immüno-floresan

1. Yavaşça 30 dakika boyunca her 4 lamel ve inkübe ° C için% 4 formaldehit / PBS 1 ml ekleyin.
2. Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın
3. , 22 ° C'de 10 dakika boyunca her lamel ve inkübe% 0,1 Triton X-100/PBS 400ul ekleyin.
4. Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın
5. Potansiyel arka plan boyama azaltmak için 20 dakika boyunca 22 ° C'de% 3 Bovine Serum Albumin (BSA) / PBS ve inkübe 400ul ekleyin.
6. Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın
7. 1 saat süreyle 22 ° C'de inkübe üzerine lamel ve PBS içinde birincil antikor Yeri 100ul. Birincil ve ikincil antikorlar gerekli konsantrasyonu PBS içinde seyreltilmelidir. Bu, kullanılan her bir antikor için optimize edilmesi gerekebilir.
8. Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın
9. 22 ° C uzakta 1 saat süreyle ışık, PBS ve inkübe ikincil antikor Yeri 200ul.
10. Her lamel 22 PBS 1ml 2-3 kez hafifçe ° C yıkayın
11. DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole hidroklorür) içeren Vectashield montaj orta kullanarak cam bir mikroskop lamı üzerine her lamel (hücre aşağı) monte edin.
12. Bir kağıt havlu kullanarak lamel dört bir yanından gelen aşırı montaj orta silin ve slayt ışıktan en az 30 dakika için 22 ° C'de inkübe edin.
13. Lamel, şeffaf akrilik tırnak cilası kullanarak cam slayt sabitleyin.
14. Slaytlar floresan mikroskobu ile görselleştirme önce ışıktan uzak tutun.

IV. Temsilcisi sonuçları

Şekil 2. Olmayan transfekte COS-7 hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon fraksiyonlara Cos-7 hücreleri formaldehit ile sabit ve DAPI içeren orta montaj ile tedavi takip TRITC için konjuge A / C antikorları kullanarak immunohistokimyasal α-tubulin, α-Histon H1 veya α-Lamin . Görüntüler Leica konfokal mikroskop kullanılarak 10x oküler lens ve 63x objektif lens ile elde edildi. Hücre çekirdeklerinin işaretleyici antikorlar ile boyanarak aynı alanda hücreleri TRITC bir filtre seti kullanılarak görüntülendi DAPI filtre seti kullanılarak görüntülendi.

Şekil 3. GFP-6E2 füzyon proteini nükleer matriks ile ilişkilidir. Insan papilloma virüsü (HPV) tip 6 erimiş yeşil floresan proteininin (GFP) oluşan bir füzyon proteini ifade Cos-7 hücre hücre içi fraksiyonasyonE2 proteininin (GFP-6E2). Transfekte hücreler GFP-6E2 lokalizasyonu GFP floresan üzerinden doğrudan görüntülenmiştir iken Hücre çekirdekleri DAPI boyama ile görüntülendi. Lamin A / C α-Lamin TRITC ve TRITC bir filtre seti konjuge A / C antikorları kullanarak görüntülendi. Birleştirme görüntüler GFP-6E2 protein bazı nükleer matriks (sağ alt panel) ile ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 2'de açıklandığı gibi görüntüler elde edildi.

Yaygın sorunlar ve öneriler:

Hücrelerin tamamı ya da bir çoğunu yıkama sırasında kaybolur. Yıkama adımları sırasında sıvı lamel kaçınarak 6 plaka yan yavaş yavaş ilave edilmelidir. Benzer şekilde, dikkatli bir şekilde devirme levha ile sıvı kaldırıldı olmalıdır ve aşırı sıvı yavaş yavaş pipetleme. Hücre adezyon poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanarak artırılabilir.

Genomik DNA'nın tamamen sindirilmiş değildir. Bazı hücre tipleri için DNAz I sindirim adım genomik DNA tümüyle kaldırılmasını sağlamak için genişletilmiş ve / veya DNAz I konsantrasyonu artışı gerekebilir.

Fiksasyon ve fraksiyonasyon eserler. Bazı proteinler fiksasyon veya fraksiyon ^6. sırasında relocalize dikkat etmek önemlidir. Örneğin nükleer membran çekirdeği aşağıdaki bozulması serbest Proteinler, aksi takdirde iyi ayrılmış bölümlerinde yer olurdu siteler bağlayabilirsiniz. Bu etkiler, örneğin formaldehit yerine paraformaldehid kullanarak farklı tespit yöntemleri kullanılarak elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak minimize edilebilir. Canlı hücre görüntüleme de en az ³ tüm hücreler için yararlı olabilir.

Bu teknik, iyi GFP füzyon proteini tespit için uygundur. Ancak, benzer bir şekilde füzyon proteini etiketsiz protein davranır onaylamak için önemlidir. Titrasyonu ile aşırı-ifadesi alt hücresel yerleşimi önemli ölçüde değiştirebilir protein beri proteinler karşılaştırılabilir düzeyde ifade olduğunu onaylamak için de önemlidir.

Tekniği uygulamaları:

Bu atıl tekniği, protein lokalizasyonu farklı hücre içi etki alanı veya yapıların iyi karakterize belirteçlerinin referans ile belirlenecek sağlar ve hücre biyolojisi birçok alanda uygulamalar vardır. Örneğin, pek çok transkripsiyon faktörleri sitoplazmaya lokalizasyonu ile karmaşık bir dağıtım, gevşek düzenlenen çekirdek plazması, kromatin ve / veya nükleer matris ^1,2,4 gösterir. Bu etki her Yerelleştirme protein işlevi yanı sıra protein ciro ve post-translasyonel modifikasyonlar etkileyebilir.

Protein gibi nükleer matriks gibi belirli etki co-lokalizasyon protein fonksiyonu içgörüler sağlayabilir. Yeniden localisation belirli sinyaller ve / veya ortak proteinleri ifade yanıt Protein aynı zamanda protein ^fonksiyonu 1,4 ışık tutabilir .

Anyaporn Sawasdichai ve Nazefah Abdülhamit'in doktora sırasıyla Kraliyet Tayland Hükümeti ve Malezya Hükümeti minnettarız Burslar. Bu çalışma, Wellcome Trust PSJ ve KG için verilen bir proje hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, Bristol Wolfson bio Tesisi Üniversitesi minnettarız.