En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

En fractionnement subcellulaire in situ des cellules de mammifères sur des lamelles de microscope permet la visualisation de la localisation des protéines.

La fonction des protéines est intimement couplée à la localisation des protéines. Bien que certaines protéines sont limités à un endroit précis ou un compartiment subcellulaire, de nombreuses protéines sont présentes en tant que population librement diffusant dans le libre-échange avec une sous-population qui est étroitement associé à un domaine particulier ou d'une structure subcellulaire. En fractionnement subcellulaire in situ permet la visualisation de compartimentation de protéines et peut aussi révéler des protéines sous-populations qui localisent à des structures spécifiques. Par exemple, la suppression des protéines solubles dans le cytoplasme et lâchement protéines nucléaires peut révéler l'association stable de certains facteurs de transcription à la chromatine. Après la digestion de l'ADN peut dans certains cas révéler association avec le réseau de protéines et d'ARN qui est collectivement appelés le nucléaire échafaudage ou de la matrice nucléaire.

Nous décrivons ici les étapes nécessaires au cours des fractionnement in situ de adhérentes et cellules non adhérentes de mammifères sur des lamelles de microscope. La visualisation des protéines peut être réalisée en utilisant des anticorps spécifiques ou des protéines de fusion fluorescentes et la microscopie à fluorescence. Les anticorps et / ou des colorants fluorescents qui agissent comme des marqueurs pour les compartiments spécifiques ou des structures permettant la localisation des protéines à être cartographié en détail. En fractionnement in situ peut également être combiné avec Western blot pour comparer les quantités de protéines présentes dans chaque fraction. Cette approche simple biochimiques peuvent révéler des associations qui seraient autrement inaperçus.

I. Préparation pour le fractionnement

Cette section décrit la préparation de poly-L-Lysine lamelles de microscope enduit et la fixation des cellules avant de fractionnement. Si nécessaire, les cellules peuvent être transitoirement transfectées avec des vecteurs d'expression de protéines avant ou après la fixation.

A. Préparation de poly-L-Lysine lamelles revêtement

1. Préparer une solution de 1mg/ml poly-L-lysine dans l'eau distillée.
2. Lamelles pelage propre à la poly-L-Lysine en les incubant dans la solution pendant au moins 1 heure sur une plate-forme à bascule à 22 ° C.
3. Lavez les lamelles recouverte d'eau distillée stérile à deux reprises et suivi avec un seul lavage avec de l'éthanol à 96%.
4. Sécher à l'air les lamelles couché sur un morceau de papier filtre et les conserver dans un récipient sec pour une utilisation future (une fois secs, ils peuvent être empilés).

Cellules B. Attachement à lamelles

Cellules non adhérentes (ici nous utilisons K562)

1. Placer une lamelle de poly-L-Lysine couché dans un puits dans une plaque à 6 puits avec la surface revêtue vers le haut.
2. Graine K562 à une densité de 7x10 ⁵ cellules / puits dans du milieu Dulbecco Modified Eagles (DMEM) supplémenté avec 10% sérum de veau fœtal (FBS) et PS (pénicilline 100units/ml, 100mg/ml streptomycine). Dans le cas des cellules K562 transfection transitoire peut être effectuée en utilisant l'électroporation (0.4cm cuvettes d'électroporation avec 1x10 ⁷ cellules dans 200 ul de médias à 250V / 975μF) avant l'ensemencement des cellules.
3. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO _2.
4. Décanter le milieu et laver les cellules deux fois avec du phosphate glacée saline tamponnée (PBS).
5. Suivez avec le protocole de fractionnement subcellulaire.

Les cellules adhérentes (ici nous utilisons cellules Cos-7)

1. Placer une lamelle non couché dans un puits dans une plaque à 6 puits.
2. Laver deux fois dans du PBS préchauffé à 37 ° C.
3. Détacher les cellules par digestion par la trypsine (0,03% d'EDTA, 0,25% de trypsine) dans du PBS à 37 ° C pendant 2 à 5 minutes. Il est important de ne pas trop assimiler les cellules et d'arrêter la digestion dès majoritairement individuels cellules flottantes sont présents.
4. Arrêter la digestion par l'ensemencement des cellules à une densité de 3x10 ⁵ cellules / puits dans une plaque de 6 puits dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et le PSG (pénicilline 100 unités / ml, streptomycine 100ug/ml et L-glutamine 292ug/ml) , sur des lamelles normale. Les cellules adhérentes attachent généralement bien sur des lamelles de microscope normal, cependant, la poly-L-Lysine lamelles revêtement peut être utilisé si nécessaire.
5. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Dans le cas des cellules Cos-7 transfection transitoire peut être effectuée en utilisant Fugene 6 (Roche) si nécessaire et les cellules de gauche à récupérer pour une période supplémentaire de 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.
6. Décanter le milieu et laver les cellules deux fois avec PBS glacé.
7. Suivez avec le protocole de fractionnement subcellulaire.

II. Fractionnement subcellulaire

Dans fraction in situ est réalisée selon le schéma de la figure 1 et est basé sur une méthode décrite précédemment ⁵ avec des modifications décrites précédemment ⁷ et dans le protocole détaillé ci-dessous. Il est recommandé de transférer les lamelles d'une nouvelle plaque de 6 puits après chaque étape de fractionnement enlever la lamelle avant d'enlever le liquide. Bien que seulement quatre lamelles sont requises pour l'imagerie, des lamelles supplémentaires sont nécessaires pour produire l'extrait de cellules entières et des fractions de la matrice nucléaire pour western blot, si ce n'est d'être réalisées en parallèle.

1. Préparer et filtre cytosquelette tampon (CSK): TUYAUX 10 mM, saccharose 300mm, 100mm de NaCl, 3mm _MgCl2, 1 mM EGTA. Tampon CSK doit être fraîchement préparée le jour de fractionnement.
2. Si nécessaire les cellules d'une lamelle peut être utilisé pour préparer extrait cellulaire entier pour western blot en plaçant délicatement 200ul tampon TES (1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) directement sur la lamelle et incuber pendant 1 ou 2 minutes à 22 ° C. L'extrait de cellules entières peuvent ensuite être retirés et les protéines précipitées en ajoutant 250ul de 1M (NH ^{4) 2} SO ⁴ et incubation sur la glace jusqu'à ce que les autres échantillons occidentaux sont prêts.
3. Lavez les lamelles restantes avec 1 ml PBS glacé à deux reprises à 22 ° C en inclinant la plaque de 6 bien deux ou trois fois.
4. Retirer la lamelle représentant des cellules entières et le transfert à un nouveau 6-même assiette. Suivez avec la fixation des cellules et l'immuno-fluorescence protocole.
5. Retirez délicatement le PBS dans les puits restants.
6. Extraire les protéines cytoplasmiques et nucléaires lâchement en plaçant délicatement 200ul CSK tampon + 0,1% (V / V) de Triton X-100 directement sur chaque lamelle restant et l'incubation desla glace pendant 1 minute.
7. Retirer l'extrait cytoplasmique et lâchement nucléaire et précipiter comme décrit dans l'étape 2.
8. Lavez les lamelles avec 1 ml PBS glacé à deux reprises à 22 ° C en inclinant le bien-six plaques.
9. Retirer la lamelle représentant étroitement tenu des matières nucléaires et de suivre avec la fixation des cellules et l'immuno-fluorescence protocole.
10. Retirez délicatement le PBS dans les puits restants, puis extraire les protéines étroitement tenues en plaçant délicatement 200ul CSK tampon + 0,5% (V / V) de Triton X-100 directement sur chaque lamelle restant et l'incubation sur la glace pendant 20 minutes.
11. Retirer l'extrait bien eu lieu et le précipité comme décrit dans l'étape 2.
12. Lavez les lamelles avec 1 ml PBS glacé à deux reprises à 22 ° C en inclinant le bien-six plaques.
13. Retirer la lamelle représentant fraction de la chromatine et suivi avec la fixation des cellules et l'immuno-fluorescence protocole.
14. Retirez délicatement le PBS dans les puits restants ont alors lieu 200ul CSK tampon + 100ug/ml de DNase I sur les lamelles restantes et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
15. Retirer l'extrait de la chromatine et précipitée comme décrit dans l'étape 2.
16. Lavez les lamelles de glace PBS froid à deux reprises à 22 ° C en inclinant le bien-six plaques.
17. Retirer la lamelle représentant la fraction de la matrice nucléaire et de suivre avec la fixation des cellules et l'immuno-fluorescence protocole.
18. Si nécessaire protéines de la matrice peut être retiré de la matrice une lamelle supplémentaire pour Western blot en utilisant 200ul tampon TES comme décrit dans l'étape 2.
19. Les échantillons pour test western blot doit être centrifugé à 13000 rpm dans une microcentrifugeuse de paillasse à 4 ° C et les culots remis en suspension dans 40ul SDS tampon de chargement (62,5 mm de Tris-HCl pH 6,8, SDS 2% (p / v), 50 mM de DTT, glycérol à 10%, 0,01% bleu de bromophénol (p / v)) avant l'analyse par SDS-PAGE.
    
    Figure 1. Une représentation schématique d'au fractionnement subcellulaire situ. Cytosquelette tampon (CSK) est constitué de 10 mM PIPES, saccharose 300mm, 100mm de NaCl, 3mm _MgCl2, 1 mM EGTA. Tampon TES se compose de 1% de SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.

III. Fixation de cellules et d'immuno-fluorescence

1. Ajouter délicatement 1ml de formaldéhyde à 4% / PBS dans chaque lamelle et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes.
2. Laver chaque lamelle doucement 2-3 fois avec 1ml de PBS à 22 ° C.
3. Ajouter 400ul d'X-100/PBS Triton de 0,1% à chaque lamelle et incuber à 22 ° C pendant 10 minutes.
4. Laver chaque lamelle doucement 2-3 fois avec 1ml de PBS à 22 ° C.
5. Ajouter 400ul de 3% albumine sérique bovine (BSA) / PBS et incuber à 22 ° C pendant 20 minutes pour réduire les taches de fond potentiels.
6. Laver chaque lamelle doucement 2-3 fois avec 1ml de PBS à 22 ° C.
7. 100ul Lieu de l'anticorps primaire dans le PBS directement sur la lamelle et incuber à 22 ° C pendant 1 heure. Les anticorps primaires et secondaires doivent être dilués dans du PBS à la concentration requise. Ce peut-être besoin d'être optimisé pour chaque anticorps utilisé.
8. Laver chaque lamelle doucement 2-3 fois avec 1ml de PBS à 22 ° C.
9. Lieu de 200ul anticorps secondaire dans le PBS et incuber à 22 ° C loin de la lumière pendant 1 heure.
10. Laver chaque lamelle doucement 2-3 fois avec 1ml de PBS à 22 ° C.
11. Montez chaque lamelle (cellules vers le bas) sur une lame de microscope en verre en utilisant un milieu de montage Vectashield contenant du DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole chlorhydrate).
12. Essuyer le milieu de montage à travers la lamelle à l'aide d'une serviette en papier et incuber la lame à 22 ° C pendant au moins 30 minutes de lumière.
13. Fixer la lamelle à l'aide de la lame de verre clair vernis acrylique.
14. Gardez les diapositives abri de la lumière avant la visualisation par microscopie à fluorescence.

IV. Les résultats représentatifs

Figure 2. Fractionnement subcellulaire de non-transfectées cellules COS-7. Fractionnée cellules Cos-7 ont été fixées avec du formaldéhyde et immunocolorés utilisant α-tubuline, α-histone H1 ou α-lamine A anticorps / C conjugué à la TRITC suivi par un traitement avec le milieu de montage contenant DAPI . Les images ont été acquises avec lentille oculaire 10x et 63x objectif en utilisant un microscope confocal Leica. Noyaux des cellules ont été visualisées en utilisant un ensemble DAPI filtre alors que dans le même domaine cellules colorées avec des anticorps marqueurs ont été visualisées en utilisant un ensemble TRITC filtre.

Figure 3. Une protéine de fusion GFP-6E2 est associée à la matrice nucléaire. Fractionnement subcellulaire des cellules Cos-7 exprimant une protéine de fusion constituée de la protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à virus du papillome humain (VPH) de type 6E2 protein (GFP-6E2). Noyaux des cellules ont été visualisées par l'intermédiaire coloration DAPI alors la localisation de la GFP-6E2 dans les cellules transfectées a été visualisé directement via fluorescence de la GFP. Lamine A / C a été visualisée en utilisant α-lamine A anticorps / C conjugué à la TRITC et un ensemble TRITC filtre. Les images révèlent que certains fusionnent de la protéine GFP-6E2 est associée à la matrice nucléaire (en bas à droite). Les images ont été obtenues comme décrit dans la figure 2.

Les problèmes courants et suggestions:

Tous ou la plupart des cellules sont perdues pendant le lavage. Pendant les étapes liquides de lavage doit être ajouté lentement sur le côté de la plaque de 6 puits en évitant la lamelle. De même les liquides doivent être enlevés par attentivement inclinant la plaque et lentement pipetage hors excès de liquide. L'adhésion cellulaire peut être augmentée en utilisant la poly-L-Lysine lamelles enrobées.

L'ADN génomique est pas complètement digérée. Pour certains types de cellules de l'étape de digestion DNase I peut être nécessaire d'étendre et / ou la concentration DNAse I ont augmenté pour atteindre l'élimination complète de l'ADN génomique.

Fixation et artefacts de fractionnement. Il est important de noter que certaines protéines peuvent relocaliser lors de la fixation ou de fractionnement ^6. Les protéines libérées par les perturbations suivantes noyau de la membrane nucléaire par exemple, peuvent se lier à des sites qui, autrement, serait situé dans des compartiments bien séparés. Ces effets peuvent être minimisés en comparant les résultats obtenus en utilisant différentes méthodes de fixation par exemple en utilisant paraformaldéhyde en place de formaldéhyde. Imagerie des cellules vivantes peuvent aussi être utiles pour les cellules entières au moins ^3.

Cette technique est bien adaptée à la détection de protéines de fusion GFP. Cependant, il est important de confirmer que la protéine de fusion comporte d'une manière similaire à la protéine non balisé. Il est également important de confirmer par titrage que les protéines sont exprimées à des niveaux comparables puisque la sur-expression de protéines peuvent altérer considérablement localisation sub-cellulaire.

Applications de la technique:

Cette technique permet la localisation sous-utilisée protéine d'être déterminée par référence à des marqueurs bien caractérisé de différents domaines subcellulaires ou des structures et a des applications dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire. Par exemple, nombreux facteurs de transcription d'afficher une répartition complexe avec la localisation dans le cytoplasme, nucléoplasme lâchement, la chromatine et / ou nucléaires matrice ^1,2,4. Localisation dans chacun de ces domaines peuvent influencer la fonction des protéines ainsi que le renouvellement des protéines et des modifications post-traductionnelles.

Protéines co-localisation à des domaines spécifiques tels que la matrice nucléaire peut fournir des indications sur la fonction des protéines. Re-localisation des protéines en réponse à des signaux spécifiques et / ou l'expression de protéines partenaires peuvent aussi faire la lumière sur la fonction des protéines ^1,4.

Anyaporn Sawasdichai et Nazefah Abdul Hamid sommes reconnaissants envers le gouvernement royal thaïlandais et le Gouvernement de la Malaisie, respectivement, pour un doctorat Bourses. Ce travail a été financé par une subvention du Wellcome Trust de projet attribué à PSJ et KG. Nous sommes également reconnaissants à l'Université de Bristol Facilité Bioimaging Wolfson.