In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

In situ frazionamento subcellulare delle cellule di mammifero su vetrini microscopio permette la visualizzazione della localizzazione delle proteine.

Funzione della proteina è intimamente unita alla localizzazione delle proteine. Sebbene alcune proteine ​​sono limitate a una posizione specifica o compartimento subcellulare, molte proteine ​​sono presenti come una popolazione liberamente diffondere in libero scambio con una sotto-popolazione che è strettamente associata a un determinato dominio o struttura subcellulare. Frazionamento subcellulare in situ permette la visualizzazione di compartimentalizzazione delle proteine ​​e può anche rivelare le proteine ​​sotto-popolazioni che si localizzano a strutture specifiche. Per esempio, la rimozione di proteine ​​solubili citoplasmatici e vagamente tenuto proteine ​​nucleari in grado di rivelare l'associazione stabile di alcuni fattori di trascrizione con cromatina. Successiva digestione del DNA possono in alcuni casi rivelano associazione con la rete di proteine ​​e RNA che viene collettivamente definito il nucleare patibolo o matrice nucleare.

Qui si descrivono le operazioni necessarie durante il frazionamento in situ di cellule di mammifero aderenti e non aderenti a lamelle microscopio. Visualizzazione di proteine ​​può essere ottenuto utilizzando anticorpi specifici o proteine ​​di fusione fluorescenti e microscopia a fluorescenza. Anticorpi e / o coloranti fluorescenti che agiscono come marcatori per specifici comparti o strutture consentono la localizzazione delle proteine ​​da mappare nel dettaglio. Frazionamento in situ può anche essere combinato con western blotting per confrontare la quantità di proteine ​​presenti in ogni frazione. Questo semplice approccio biochimico in grado di rivelare le associazioni che altrimenti rimarrebbero inosservati.

I. Preparazione per il frazionamento

Questa sezione descrive la preparazione di poli-L-lisina coprioggetto microscopio rivestiti e l'attaccamento di cellule prima del frazionamento. Se necessario le cellule possono essere transitoriamente transfettate con vettori di espressione delle proteine ​​prima o dopo l'attaccamento.

A. Preparazione del coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina

1. Preparare una soluzione di 1mg/ml poli-L-lisina in acqua distillata.
2. Coprioggetto cappotto pulito, con poli-L-lisina in incubazione, in nella soluzione per almeno 1 ora su una piattaforma oscillante a 22 ° C.
3. Lavare i coprioggetti rivestito con acqua distillata sterile due volte e seguire con un lavaggio singolo con il 96% di etanolo.
4. Far asciugare i vetrini rivestiti su un pezzo di carta da filtro e conservarle in un contenitore asciutto per un uso futuro (una volta asciutta possono essere impilati).

Cellule B. Connessione a lamelle

Non aderente cellule (qui usiamo cellule K562)

1. Inserire una poli-L-lisina coprioggetto rivestiti in un pozzo in un 6-pozzetti con la superficie rivestita rivolta verso l'alto.
2. Semi di cellule K562 ad una densità di 7x10 ⁵ cellule / pozzetto in Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e PS (penicillina 100units/ml, 100mg/ml streptomicina). Nel caso di cellule K562 trasfezione transiente può essere eseguita con elettroporazione (0,4 centimetri cuvette elettroporazione con 1x10 ⁷ cellule in 200μl di media a 250V / 975μF) prima di seminare le cellule.
3. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in 5% di CO _2.
4. Eliminare il medio e lavare le cellule due volte con fosfato ghiacciata soluzione salina tamponata (PBS).
5. Seguite con il protocollo di frazionamento subcellulare.

Cellule aderenti (qui usiamo cellule COS-7)

1. Inserire un vetrino rivestito in un pozzo in un 6-pozzetti.
2. Lavare due volte in PBS preriscaldata a 37 ° C.
3. Staccare le cellule digestione con tripsina (0,03% EDTA, 0,25% tripsina) in PBS a 37 ° C per 2 a 5 minuti. E 'importante non a un eccesso di digerire le cellule e per fermare la digestione non appena le cellule galleggianti prevalentemente individuali sono presenti.
4. Fermare la digestione seminando le cellule ad una densità di 3x10 ⁵ cellule / pozzetto in un 6-pozzetti in DMEM supplementato con 10% FBS e PSG (penicillina 100 unità / ml, streptomicina 100ug/ml e L-glutamina 292ug/ml) , su lamelle normale. Cellule aderenti generalmente allegare anche sul coprioggetto microscopio normale, tuttavia, vetrini rivestiti di poli-L-lisina può essere utilizzato se necessario.
5. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2. Nel caso di cellule COS-7 trasfezione transiente può essere effettuata utilizzando Fugene 6 (Roche) se richiesto e le celle a sinistra per recuperare per altre 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
6. Eliminare il medio e lavare le cellule due volte con PBS freddo ghiaccio.
7. Seguite con il protocollo di frazionamento subcellulare.

II. Frazionamento subcellulare

Della frazione in situ viene eseguita secondo lo schema mostrato nella Figura 1 e si basa su un metodo descritto in precedenza ⁵ con le modifiche descritte in precedenza ⁷ e nel protocollo dettagliato di seguito. Si consiglia di trasferire i coprioggetti di un nuovo 6-pozzetti dopo ogni fase di frazionamento di rimuovere il vetrino prima di rimuovere il liquido. Anche se solo quattro lamelle sono necessari per l'imaging, coprioggetto sono necessari ulteriori per la produzione di estrarre cellule intere, e le frazioni di matrice nucleare per western blotting se questo deve essere eseguito in parallelo.

1. Preparare e filtro citoscheletro buffer (CSK): TUBI 10mm, Saccarosio 300mm, 100mM NaCl, 3mm MgCl _2, 1 mM EGTA. CSK tampone deve essere preparata il giorno di frazionamento.
2. Se necessario le cellule da un coprioggetto può essere utilizzato per preparare l'estratto cellule intere, per western blotting con delicatezza mettendo 200ul tampone TES (1% SDS, 2mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) direttamente sul coprioggetto e incubare per 1 o 2 minuti a 22 ° C. L'estratto cellule intere possono quindi essere rimossi e le proteine ​​precipitate con l'aggiunta di 250ul di 1M (NH ^{4) 2} SO ⁴ e incubazione su ghiaccio fino a quando gli altri campioni occidentali sono pronti.
3. Lavare i coprioggetti restanti con 1ml PBS freddo ghiaccio due volte a 22 ° C inclinando il 6 ben piatto due o tre volte.
4. Rimuovere il vetrino che rappresentano le cellule intere e trasferimento in un nuovo 6-pozzetti. Seguite con la fissazione delle cellule e l'immuno-fluorescenza protocollo.
5. Rimuovere delicatamente la PBS dai pozzetti rimanenti.
6. Estrarre le proteine ​​citoplasmatiche e nucleari vagamente tenuto delicatamente mettendo 200ul tampone CSK + 0,1% (v / v) Triton X-100 direttamente su ogni coprioggetto rimanente e incubazione dighiaccio per 1 minuto.
7. Rimuovere l'estratto citoplasmatico e vagamente tenuto nucleare e precipitare come descritto al punto 2.
8. Lavare i coprioggetti con ghiaccio 1ml PBS freddo due volte a 22 ° C inclinando il piatto ben 6.
9. Rimuovere il vetrino che rappresentano ben tenuta materiale nucleare e seguire con la fissazione delle cellule e l'immuno-fluorescenza protocollo.
10. Rimuovere delicatamente la PBS dai pozzetti rimanenti quindi estrarre le proteine ​​strettamente tenuto delicatamente mettendo 200ul tampone CSK + 0,5% (v / v) Triton X-100 direttamente su ogni coprioggetto rimanente e incubazione in ghiaccio per 20 minuti.
11. Rimuovere l'estratto ben tenuto e precipitare come descritto al punto 2.
12. Lavare i coprioggetti con ghiaccio 1ml PBS freddo due volte a 22 ° C inclinando il piatto ben 6.
13. Rimuovere il vetrino che rappresentano frazione cromatina e seguire con la fissazione delle cellule e l'immuno-fluorescenza protocollo.
14. Rimuovere delicatamente la PBS dai pozzetti rimanenti poi posto 200ul CSK tampone + 100ug/ml di DNasi I rimanenti sul coprioggetto e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
15. Rimuovere l'estratto della cromatina e precipitare come descritto al punto 2.
16. Lavare i coprioggetti con ghiaccio PBS freddo due volte a 22 ° C inclinando il piatto ben 6.
17. Rimuovere il vetrino che rappresenta la frazione nucleare matrice e seguire con la fissazione delle cellule e l'immuno-fluorescenza protocollo.
18. Se necessario, la proteine ​​della matrice può essere rimossa da un coprioggetto matrice aggiuntivi per western blotting utilizzando 200ul tampone TES come descritto al punto 2.
19. I campioni per western blot devono essere centrifugati a 13000 rpm in microcentrifuga da banco a 4 ° C ed il pellet risospeso in 40ul SDS tampone di caricamento (62,5 mm Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS (w / v), 50 mM DTT, 10% glicerolo, 0,01% blu di bromofenolo (w / v)) prima dell'analisi mediante SDS-PAGE.
    
    Figura 1. Una rappresentazione schematica di conservazione in situ frazionamento subcellulare. Citoscheletro buffer (CSK) si compone di TUBI 10mm, Saccarosio 300mm, 100mM NaCl, 3mm MgCl _2, 1 mM EGTA. TES tampone è costituito da 1% SDS, 2mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.

III. Fissazione delle cellule e immuno-fluorescenza

1. Delicatamente aggiungere 1 ml di formaldeide al 4% / PBS per ogni coprioggetto e incubare a 4 ° C per 30 minuti.
2. Lavare ogni coprioggetto delicatamente 2-3 volte con 1 ml di PBS a 22 ° C.
3. Aggiungi 400ul di X-100/PBS Triton 0,1% per ogni coprioggetto e incubare a 22 ° C per 10 minuti.
4. Lavare ogni coprioggetto delicatamente 2-3 volte con 1 ml di PBS a 22 ° C.
5. Aggiungi 400ul del 3% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS e incubare a 22 ° C per 20 minuti per ridurre la colorazione di fondo potenziale.
6. Lavare ogni coprioggetto delicatamente 2-3 volte con 1 ml di PBS a 22 ° C.
7. 100ul posto dell'anticorpo primario in PBS direttamente sul coprioggetto e incubare a 22 ° C per 1 ora. Anticorpi primari e secondari devono essere diluiti in PBS alla concentrazione richiesta. Questo può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni anticorpo utilizzato.
8. Lavare ogni coprioggetto delicatamente 2-3 volte con 1 ml di PBS a 22 ° C.
9. 200ul luogo di anticorpo secondario in PBS e incubare a 22 ° C al riparo dalla luce per 1 ora.
10. Lavare ogni coprioggetto delicatamente 2-3 volte con 1 ml di PBS a 22 ° C.
11. Montare ciascun vetrino coprioggetto (celle in basso) su un vetrino da microscopio in vetro con supporto Vectashield montaggio contenente DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindolo cloridrato).
12. Pulire l'eccesso mezzo di montaggio di tutto il coprioggetto utilizzando un tovagliolo di carta e incubare il vetrino a 22 ° C per almeno 30 minuti al riparo dalla luce.
13. Fissare il coprioggetto al vetrino usando chiaro smalto acrilico.
14. Tenere le diapositive al riparo dalla luce prima visualizzazione al microscopio a fluorescenza.

IV. Rappresentante risultati

Figura 2. Frazionamento subcellulare di non transfettate cellule COS-7. Frazionato cellule COS-7 sono stati fissati con formaldeide e immunostained con α-tubulina, α-istoni H1 o α-Lamina A / C anticorpi coniugati con TRITC seguita da trattamento con mezzo di montaggio contenente DAPI . Le immagini sono state acquisite con oculare 10x e lenti dell'obiettivo 63x utilizzando un microscopio confocale Leica. Nuclei delle cellule sono state visualizzate utilizzando una serie DAPI filtro mentre nelle cellule stesso campo colorate con anticorpi marcatori sono stati visualizzati utilizzando un insieme TRITC filtro.

Figura 3. Un GFP-6E2 proteina di fusione è associato con la matrice nucleare. Frazionamento subcellulare di Cos-7 cellule che esprimono una proteina di fusione costituita da una proteina fluorescente verde (GFP) fuso con il papillomavirus umano (HPV) di tipo 6E2 proteine ​​(GFP-6E2). Nuclei delle cellule sono stati visualizzati tramite colorazione DAPI, mentre la localizzazione della GFP-6E2 nelle cellule transfettate era direttamente visualizzati tramite fluorescenza GFP. Lamina A / C è stata osservata con α-Lamina A / C anticorpi coniugati con TRITC e una serie TRITC filtro. Le immagini si fondono rivelano che alcune delle proteine ​​GFP-6E2 è associato con la matrice nucleare (in basso a destra del pannello). Le immagini sono state ottenute come descritto nella Figura 2.

Problemi comuni e suggerimenti:

Tutti o la maggior parte delle cellule sono persi durante il lavaggio. Durante le fasi di lavaggio deve essere aggiunto lentamente al lato del 6-pozzetti evitando il coprioggetto. Allo stesso modo i liquidi devono essere rimossi con attenzione inclinando la piastra e lentamente pipettaggio l'eccesso di liquido. L'adesione cellulare può essere aumentata mediante coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina.

DNA genomico non è del tutto digerito. Per alcuni tipi di cellule la digestione DNAsi io passo potrebbe essere necessario essere estese e / o la concentrazione di DNAsi ho aumentato al fine di ottenere la rimozione completa del DNA genomico.

Fissazione e manufatti di frazionamento. E 'importante notare che alcune proteine ​​possono rilocalizzare durante la fissazione o frazionamento ^6. Proteine ​​rilasciate dalla disgregazione del nucleo a seguito della membrana nucleare, ad esempio, possono legarsi ai siti che altrimenti sarebbero situate in compartimenti ben separati. Questi effetti possono essere minimizzati confrontando i risultati ottenuti con diversi metodi di fissazione per esempio con paraformaldeide al posto di formaldeide. L'imaging cellulare dal vivo può anche essere utile per le cellule intere almeno ^3.

Questa tecnica è particolarmente adatta al rilevamento di proteine ​​di fusione GFP. Tuttavia, è importante verificare che la proteina di fusione si comporta in modo simile alla proteina senza tag. E 'anche importante confermare con la titolazione che le proteine ​​sono espressi a livelli paragonabili in quanto le proteine ​​sovra-espressione può alterare drammaticamente localizzazione sub-cellulare.

Le applicazioni della tecnica:

Questa tecnica permette sottoutilizzate localizzazione delle proteine ​​da definire con riferimento ai marcatori ben caratterizzata di diversi domini o strutture subcellulari e ha applicazioni in molti settori della biologia cellulare. Per esempio, molti fattori di trascrizione visualizzare un complesso di distribuzione con la localizzazione nel citoplasma, nucleoplasma liberamente dichiarato, cromatina e / o nucleari matrice ^1,2,4. Localizzazione in ognuno di questi domini possono influenzare la funzione delle proteine ​​e turnover proteico e modificazioni post-traduzionali.

Proteine ​​co-localizzazione a domini specifici quali la matrice nucleare può fornire intuizioni funzione delle proteine. Ri-localizzazione delle proteine ​​in risposta a segnali specifici e / o l'espressione di proteine ​​partner può anche far luce su ^1,4 funzione delle proteine.

Anyaporn Sawasdichai e Nazefah Abdul Hamid grati al governo tailandese e il Governo della Malaysia, rispettivamente per dottorato di ricerca Borse di studio. Questo lavoro è stato finanziato da un progetto Wellcome Trust sovvenzione concessa a PSJ e KG. Siamo anche grati per l'Università di Bristol Fondo Bioimmagini Wolfson.