Этот продукт оптимизирован для выравнивания белков с помощью флуоресцентной белковой метки, а также для визуализации местоположения и экспрессии белка интересной лабораторной особи данио-рерио. Это особенно полезно для визуализации белков, экспрессируемых в малом количестве. Наш метод упрощает и ускоряет процесс донорского строительства.
Эти компоненты, за исключением CDS, заранее включаются в магистраль. Донор также был оптимизирован для повышения эффективности. Рабочий процесс трансмиссионного грохота накапливает наследуемое ядро при минимальных затратах времени и усилий.
Рыбки данио являются модельным организмом, широко используемым в исследованиях инфекций и иммунитета. Нас особенно интересуют механизмы, лежащие в основе сепсиса. Поскольку теперь мы можем легко выполнять флуоресцентное мечение с помощью нашего протокола, мы попытаемся пометить изображение, белки сепсиса и клетки у рыбок данио.
Для начала поместите одну здоровую самку данио-рерио и двух здоровых самцов данио-рерио в брачный аквариум. Используйте разделитель, чтобы отделить самцов от самок, чтобы подготовить их к спариванию. В день микроинъекции приготовьте смесь для микроинъекций на льду в среде, свободной от РНКазы.
С помощью наконечника для пипетки, не содержащего Rnase, загрузите раствор для микроинъекций в иглу. Поместите заряженную иглу в микроманипулятор, прикрепленный к микроинжектору. Под микроскопом с помощью заостренного пинцета разрежьте кончик иглы, аккуратно защипнув его до тех пор, пока он не сломается.
Регулируйте давление впрыска до тех пор, пока игла не будет равномерно выбрасывать каплю объемом в один нанолитр. Далее снимите разделитель с брачного резервуара, и дайте рыбкам размножиться в течение шести минут. Соберите и перенесите эмбрионы одной клеточной стадии в чашку Петри, содержащую буфер для эмбрионов.
Изучите здоровье эмбрионов под световым микроскопом и удалите неоплодотворенные яйцеклетки или мусор. Отложите 20 здоровых эмбрионов в отдельную чашку Петри в качестве неинъекционного контроля и пометьте чашку. С помощью небольшой кисточки перенесите и аккуратно выстройте здоровые эмбрионы одной клеточной стадии на бороздки микроинъекционной пластины, нагретой до комнатной температуры.
Удалите излишки буфера с пластины. С помощью кончика иглы аккуратно отрегулируйте положение каждого эмбриона так, чтобы полюс животного был обращен к игле. Введите один нанолитр смешанного раствора в столб животного.
После инъекции аккуратно промойте эмбрионы в 6-луночный планшет с буфером для эмбрионов. Поместите пластину в инкубатор с постоянной температурой 28,5 градусов Цельсия. Через 10 часов после оплодотворения исследуйте эмбриональное развитие под стереомикроскопом и удалите мертвые эмбрионы.
Через 24 часа после оплодотворения соберите эмбрионы в пробирки объемом 1,5 миллилитра для генотипирования и осторожно слейте лишнюю воду. Добавьте в каждую пробирку по 100 микролитров буфера для лизиса, содержащего протеиназу К. Инкубируйте пробирки при температуре 56 градусов Цельсия в течение одного часа, а затем при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут.
После инкубации добавьте 200 микролитров этанола и хорошо перемешайте. Центрифугируйте пробирку при 19 000 G в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать гранулу 500 микролитрами 70% этанола. Снова центрифугируйте и высушите гранулу на воздухе, прежде чем растворить ее в 50 микролитрах дважды дистиллированной воды.
Используйте один микролитр экстракта для приготовления реакционной смеси для ПЦР. После ПЦР запустите агарозные гели с двумя микролитрами продуктов ПЦР для подтверждения успешной амплификации. Выполните ферментативное расщепление для оценки эффективности sgРНК.
Аккуратно перемешайте раствор для варежки и выдержите при комнатной температуре, следуя инструкциям производителя. Используйте агарозные гели для переваренных продуктов вместе с контролем непереваренной ПЦР для подтверждения пищеварения. Чтобы проанализировать эффективность sgRNA, откройте веб-сайт TIDE и нажмите Start TIDE.
Введите направляющую последовательность sgRNA в рамку направляющей последовательности. Нажмите кнопку Обзор, чтобы загрузить результат секвенирования контрольного элемента дикого типа в поле хроматограммы контрольного образца. Аналогичным образом загрузите результат секвенирования отредактированного образца в поле хроматограммы тестового образца.
Нажмите кнопку Обновить вид для анализа результатов. Для начала используйте независимое клонирование лигирования или LIC с экзонуклеазой III для создания донорской плазмиды. Дизайн грунтовки F1 с наложением последовательности с векторным элементом 1 и частью элемента 2.
Грунтовка R2 с частью элемента 1, элемента 2 и элемента 3. Праймер F2 спроектировать таким образом, чтобы он включал элементы 3 и 4, а также простую последовательность 5 CDS после сайта-мишени sgRNA. Проектируйте грунтовку R1 с последовательностью трех простых чисел последовательности покрытия и перекрывающейся последовательностью с вектором.
Используйте CDNA данио-рерио в качестве шаблона и проведите ПЦР с разработанными праймерами. Очистите продукты ПЦР с помощью осаждения этанола. Расщепляйте донорский вектор с помощью ферментов рестрикции, таких как pCI и Acc65I, и очищайте переваренный донорский вектор.
Количественно оценивают очищенные фрагменты ПЦР и расщепленный донорский вектор с помощью электрофореза в ДНК-геле. Далее готовят смесь LIC с очищенным донорским вектором и выдерживают на льду в течение 60 минут. Добавьте один микролитр 0,5 моляра ЭДТА, чтобы остановить реакцию.
Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать раствор. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 60 градусов Цельсия в течение пяти минут. Охладите продукты LIC на льду.
Затем трансформируйте компетентные клетки DH5-Alpha с помощью продуктов LIC. Поместите трансформированные клетки на планшеты Лурии-Бертани, содержащие ампициллин, и выращивайте их в течение 16 часов. После инкубации отоберите отдельные колонии из планшетов LIC для ферментативного анализа пищеварения и секвенирования ДНК.
Извлекайте и очищайте правильные донорские плазмиды с помощью набора для очистки. Вводите эмбрионы рыбок данио с помощью смеси для микроинъекций для выбивания генов через 12-48 часов после микроинъекции, под стереофлуоресцентным микроскопом, наблюдайте за флуоресценцией личинок рыбок данио. Используя установленный метод скрининга, выберите флуоресцентных личинок и выращивайте их отдельно.
В возрасте одного месяца соберите небольшой кусочек плавника от каждой рыбки данио, находящейся под наркозом, в помеченную ПЦР-пробирку. Поместите соответствующих рыбок данио-рерио под наркозом в 6-луночную тарелку, наполненную УФ-стерилизованной фильтрованной водой в соответствии с этикеткой на пробирке. Извлечь геномную ДНК методом щелочного лизиса.
Спроектируйте прямой капсюль перед левым плечом гомологии и обратный капсюль на пластине. Проведите ПЦР, нацеливаясь на пять простых соединений последовательности. Исследуйте эмбрионы F1, полученные путем скрещивания отобранных рыбок F данио с рыбками данио дикого типа, на предмет паттернов экспрессии GFP.
Генотипировать эмбрионы F1 с помощью ПЦР на переходе. Наследственная специфическая флуоресценция наблюдалась в мышцах всего потомства F1, что указывает на успешное мечение GFP коннекзона 39.9. Наследственная специфическая флуоресценция была обнаружена в хрусталике всех потомков F2, что свидетельствует об успешном мечении mCherry коннексоном 44.1.
Правильный сбой коннексонов 39.9 и 44.1 был проверен с помощью полимеразных цепных реакций.
