تم تحسين هذا المنتج لتسوية البروتينات بعلامة البروتين الفلوري ، ولتصور الموقع والتعبير عن بروتين فرد مختبر الزرد المثير للاهتمام. إنه مفيد بشكل خاص لتصوير البروتينات المعبر عنها بوفرة منخفضة. تعمل طريقتنا على تبسيط وتسريع عملية بناء المانحين.
يتم دمج هذه المكونات ، باستثناء CDS ، في العمود الفقري مسبقا. كما تم تحسين المتبرع لزيادة الكفاءة. يتراكم سير عمل شاشة الإرسال نواة وراثية بأقل تكلفة للوقت والجهد.
أسماك الزرد هي الكائن الحي النموذجي المستخدم على نطاق واسع في الأبحاث حول العدوى والمناعة. نحن مهتمون بشكل خاص بالآليات الكامنة وراء الإنتان. نظرا لأننا قادرون الآن على إجراء علامات مضان بسهولة باستخدام البروتوكول الخاص بنا ، فسنحاول تسمية صورة وبروتينات الإنتان والخلايا في أسماك الزرد.
للبدء ، ضع أنثى واحدة من أسماك الزرد السليمة واثنين من ذكور الزرد الأصحاء في حوض التزاوج. استخدم فاصلا لفصل الذكور عن الإناث لإعدادهم للتزاوج. في يوم الحقن المجهري ، قم بإعداد مزيج الحقن المجهري على الثلج في بيئة خالية من RNase.
باستخدام طرف ماصة خال من الرين، قم بتحميل محلول الحقن الدقيق في الإبرة. ضع الإبرة المحملة في مناور دقيق متصل بحاقن صغير. تحت المجهر ، استخدم ملاقط مدببة لقطع طرف الإبرة عن طريق قرصها برفق حتى تنكسر.
اضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة باستمرار قطرة نانولتر واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة الحاجز من خزان التزاوج ، واترك الأسماك تتكاثر لمدة ست دقائق. اجمع وانقل أجنة المرحلة الواحدة من الخلية الواحدة إلى طبق بتري يحتوي على عازلة الجنين.
افحص صحة الأجنة تحت المجهر الضوئي وقم بإزالة البويضات أو الحطام غير المخصب. ضع جانبا 20 جنينا سليما في طبق بتري منفصل كعناصر تحكم غير محقونة ، وقم بتسمية الطبق. باستخدام فرشاة صغيرة ، قم بنقل الأجنة السليمة في مرحلة الخلية الواحدة واصطفها برفق على أخاديد لوحة الحقن المجهري التي تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من اللوحة. بمساعدة طرف إبرة ، اضبط موضع كل جنين برفق بحيث يواجه عمود الإبرة. حقن نانولتر واحد من المحلول المختلط في القطب الحيواني.
بعد الحقن ، اشطف الأجنة برفق في صفيحة من 6 آبار مع عازلة للجنين. ضع اللوحة في حاضنة درجة حرارة ثابتة 28.5 درجة مئوية. بعد 10 ساعات من الإخصاب ، افحص التطور الجنيني تحت مجهر استريو وقم بإزالة الأجنة الميتة.
بعد 24 ساعة من الإخصاب ، اجمع الأجنة في أنابيب سعة 1.5 مليلتر للتنميط الجيني ، وتخلص من الماء الزائد بعناية. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل المحتوي على البروتيناز K إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب عند 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول واخلط جيدا. الطرد المركزي الأنبوب عند 19 ، 000 جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى وجفف الحبيبات بالهواء قبل إذابتها في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.
استخدم ميكرولتر واحد من المستخلص لتحضير مزيج التفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتشغيل المواد الهلامية الاغاروز مع ميكرولترين من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد التضخيم الناجح. إجراء الهضم الأنزيمي لتقييم كفاءة sgRNAs.
اخلطي محلول الهضم برفق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل مواد هلام الاغاروز للمنتجات المهضومة جنبا إلى جنب مع أدوات التحكم في تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المهضومة لتأكيد الهضم. لتحليل كفاءة sgRNA ، افتح موقع TIDE على الويب وانقر فوق بدء TIDE.
أدخل تسلسل الدليل الخاص ب sgRNA في إطار تسلسل الدليل. انقر فوق استعراض لتحميل نتيجة التسلسل لعنصر تحكم النوع الجامد في حقل نموذج التحكم chromatogram. وبالمثل، قم بتحميل نتيجة التسلسل للعينة التي تم تحريرها في حقل نموذج الكروماتوغرام الاختباري.
انقر فوق تحديث العرض لتحليل النتائج. للبدء ، استخدم الاستنساخ المستقل عن الربط أو LIC مع نوكلياز خارجي III لبناء البلازميد المانح. تصميم التمهيدي F1 بتسلسل متداخل مع عنصر المتجه 1 وجزء من العنصر 2.
صمم التمهيدي R2 بجزء من العنصر 1 والعنصر 2 والعنصر 3. صمم التمهيدي F2 ليشمل العنصرين 3 و 4 ، والتسلسل الأساسي 5 ل CDS بعد موقع هدف sgRNA. تصميم التمهيدي R1 مع التسلسل الأولي الثلاثة لتسلسل الطلاء وتسلسل متداخل مع المتجه.
استخدم سمك الزرد CDNA كقالب وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال المصممة. تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام ترسيب الإيثانول. هضم الناقل المتبرع بإنزيمات التقييد مثل pCI و Acc65I ، وتنقية ناقل المتبرع المهضوم.
تحديد شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى وناقل المتبرع المهضوم باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج LIC مع ناقل متبرع منقى واحتضانه على الجليد لمدة 60 دقيقة. أضف ميكرولتر واحد من 0.5 مولار EDTA لإيقاف التفاعل.
الماصة لأعلى ولأسفل لخلط المحلول. احتضان مزيج التفاعل عند 60 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتبريد منتجات LIC على الثلج.
بعد ذلك ، قم بتحويل الخلايا المختصة DH5-Alpha باستخدام منتجات LIC. ضع الخلايا المحولة على ألواح Luria-Bertani التي تحتوي على الأمبيسلين ، وقم بزراعتها لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة ، اختر مستعمرات مفردة من ألواح LIC لتحليل الهضم الأنزيمي وتسلسل الحمض النووي.
استخرج وتنقية البلازميدات المانحة الصحيحة باستخدام مجموعة تنقية. حقن أجنة الزرد بمزيج حقن مجهري للجين Knockin'12 إلى 48 ساعة بعد الحقن المجهري ، تحت مجهر مضان ستيريو ، لاحظ تألق يرقات الزرد. باستخدام طريقة غربلة معمول بها ، حدد يرقات الفلورسنت وقم بتربيتها بشكل منفصل.
في عمر شهر واحد ، اجمع قطعة صغيرة من زعنفة الكددل من كل سمكة زرد مخدرة في أنبوب PCR مسمى. ضع سمكة الزرد المخدرة المقابلة في صفيحة من 6 آبار مملوءة بالماء المصفى المعقم بالأشعة فوق البنفسجية المطابق للملصق الموجود على الأنبوب. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام طريقة التحلل القلوي.
صمم برايمر أمامي في المنبع من ذراع التماثل الأيسر وبرايمر عكسي على الإدراج. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مستهدف التقاطع الرئيسي الخمسة للتسلسل. افحص أجنة F1 التي تم الحصول عليها عن طريق تزاوج سمكة الزرد F التي تم فحصها مع سمكة الزرد من النوع البري لأنماط تعبير GFP.
النمط الجيني للأجنة F1 باستخدام تقاطع PCR. لوحظ تألق محدد وراثي في عضلات جميع ذرية F1 ، مما يشير إلى نجاح وضع العلامات GFP ل connexon 39.9. تم الكشف عن مضان محدد وراثي في عدسة جميع ذرية F2 ، مما يشير إلى نجاح وضع علامات mCherry على connexon 44.1.
تم التحقق من الضربة الصحيحة للاتصالات 39.9 و 44.1 من خلال تفاعلات البوليميراز المتسلسلة.
