이 제품은 형광 단백질 태그로 단백질을 레벨링하고 흥미로운 제브라피시 실험실 개체의 단백질 위치와 발현을 시각화하도록 최적화되어 있습니다. 낮은 농도로 발현되는 단백질을 이미징하는 데 특히 유용합니다. 우리의 방법은 기부자 건설 프로세스를 단순화하고 가속화합니다.
CDS를 제외한 이러한 구성 요소는 사전에 백본에 통합됩니다. 또한 도너(donor)는 효율성을 높이기 위해 최적화되었습니다. 투과 화면 워크플로우는 가장 적은 시간과 노력 비용으로 상속 가능한 핵을 축적합니다.
제브라피쉬는 감염 및 면역에 대한 연구에 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 우리는 특히 패혈증의 기저에 있는 메커니즘에 관심이 있습니다. 이제 프로토콜을 사용하여 형광 태깅을 쉽게 수행할 수 있으므로 제브라피시의 이미지, 패혈증 단백질 및 세포에 라벨을 지정하려고 합니다.
시작하려면 건강한 암컷 제브라피시 한 마리와 건강한 수컷 제브라피시 두 마리를 짝짓기 탱크에 넣습니다. 칸막이를 사용하여 수컷과 암컷을 분리하여 짝짓기를 준비하십시오. 미세주입 당일, RNase가 없는 환경에서 얼음에 미세주입 혼합물을 준비합니다.
Rnase-free 피펫 팁을 사용하여 마이크로 주입 용액을 바늘에 로드합니다. 로드된 바늘을 마이크로 인젝터에 부착된 마이크로 매니퓰레이터에 놓습니다. 현미경으로 뾰족한 핀셋을 사용하여 바늘 끝이 부러질 때까지 부드럽게 꼬집어 자릅니다.
바늘이 1나노리터 방울을 지속적으로 배출할 때까지 주입 압력을 조정합니다. 다음으로, 짝짓기 탱크에서 칸막이를 제거하고 물고기가 6 분 동안 번식하도록합니다. 단일 세포 단계 배아를 수집하여 배아 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 이식합니다.
광학 현미경으로 배아의 건강 상태를 검사하고 수정되지 않은 난자나 파편을 제거합니다. 20개의 건강한 배아를 주입되지 않은 대조군으로 별도의 페트리 접시에 따로 보관하고 접시에 라벨을 붙입니다. 작은 브러시를 사용하여 건강한 1세포 단계 배아를 실온으로 데운 미세주입판의 홈에 옮기고 부드럽게 정렬합니다.
플레이트에서 초과 버퍼를 제거합니다. 바늘 끝을 사용하여 동물 기둥이 바늘을 향하도록 각 배아의 위치를 부드럽게 조정하십시오. 1나노리터의 혼합 용액을 동물 기둥에 주입합니다.
주입 후, 배아 완충액이 있는 6웰 플레이트에 배아를 부드럽게 헹굽니다. 플레이트를 섭씨 28.5도의 항온 인큐베이터에 넣습니다. 수정 후 10시간이 지나면 실체 현미경으로 배아 발달을 검사하고 죽은 배아를 제거합니다.
수정 후 24시간이 지나면 유전형 분석을 위해 배아를 1.5ml 튜브에 수집하고 여분의 물은 조심스럽게 버립니다. 각 튜브에 Proteinase K를 함유한 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 튜브를 섭씨 56도에서 1시간 동안 배양한 다음 섭씨 95도에서 15분 동안 배양합니다.
배양 후 에탄올 200 마이크로 리터를 넣고 잘 섞는다. 19, 000 G에서 튜브를 10 분 동안 원심 분리하고 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올로 펠릿을 재현 탁하기 전에 상등액을 버립니다. 다시 원심분리기를 만들고 펠릿을 자연 건조시킨 후 50마이크로리터의 이중 증류수에 용해시킵니다.
추출물 1마이크로리터를 사용하여 PCR에 대한 반응 혼합물을 준비합니다. PCR 후 2마이크로리터의 PCR 산물로 아가로스 겔을 실행하여 성공적인 증폭을 확인합니다. sgRNA의 효율성을 평가하기 위해 효소 분해를 수행합니다.
분해 용액을 부드럽게 혼합하고 제조업체의 지침에 따라 실온에서 배양합니다. 소화되지 않은 PCR 대조군과 함께 소화된 제품에 대한 아가로스 젤을 실행하여 소화를 확인합니다. sgRNA 효율성을 분석하려면 TIDE 웹사이트를 열고 TIDE 시작을 클릭합니다.
sgRNA의 guide sequence를 guide sequence frame에 입력합니다. Browse를 클릭하여 wild type control의 염기서열분석 결과를 control sample chromatogram 필드에 업로드합니다. 마찬가지로, 편집된 샘플의 염기서열분석 결과를 테스트 샘플 크로마토그램 필드에 업로드합니다.
보기 업데이트를 클릭하여 결과를 분석합니다. 먼저 결찰 독립 클로닝 또는 LIC와 엑소뉴클레아제 III를 사용하여 공여체 플라스미드를 구성합니다. 벡터 요소 1 및 요소 2의 일부와 겹치는 순서로 프라이머 F1을 설계합니다.
요소 1, 요소 2 및 요소 3의 일부로 프라이머 R2를 설계합니다. 원소 3 및 4를 포함하도록 프라이머 F2를 설계하고 sgRNA 타겟 부위를 따르는 CDS의 5 프라임 염기서열을 포함합니다. 코팅 시퀀스의 3 프라임 시퀀스와 벡터와의 중첩 시퀀스로 프라이머 R1을 설계합니다.
제브라피시 CDNA를 템플릿으로 사용하고 설계된 프라이머로 PCR을 수행합니다. 에탄올 침전을 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. pCI 및 Acc65I와 같은 제한 효소로 donor 벡터를 분해하고 절단된 donor 벡터를 정제합니다.
DNA 겔 전기영동을 사용하여 정제된 PCR 단편과 분해된 donor 벡터를 정량화합니다. 다음으로, 정제된 donor 벡터와 함께 LIC mix를 준비하고 얼음에서 60분 동안 배양합니다. 반응을 중지하기 위해 0.5 몰 EDTA 1 마이크로 리터를 첨가하십시오.
용액을 혼합하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다. 반응 혼합물을 섭씨 60도에서 5분 동안 배양합니다. LIC 제품을 얼음으로 식히십시오.
그런 다음 LIC 제품을 사용하여 DH5-알파 수용 세포를 형질전환시킵니다. 암피실린이 함유된 Luria-Bertani 플레이트에 형질전환된 세포를 플레이트화하고 16시간 동안 성장시킵니다. 배양 후 효소 분해 분석 및 DNA 염기서열분석을 위해 LIC 플레이트에서 단일 콜로니를 선택합니다.
정제 키트로 올바른 donor plasmid를 추출하고 정제합니다. 제브라피시 배아에 미세주입 혼합물을 주입하여 미세주입 후 12-48시간 후에 실체 형광 현미경으로 제브라피시 유충의 형광을 관찰합니다. 확립된 선별 방법을 사용하여 형광 유충을 선택하고 별도로 사육합니다.
생후 1개월이 되면 마취된 각 제브라피시의 작은 코들 핀 조각을 라벨이 붙은 PCR 튜브에 모읍니다. 해당 마취된 제브라피시를 튜브의 라벨과 일치하는 UV 살균 여과수로 채워진 6웰 플레이트에 넣습니다. 알칼리 용해법(alkaline lysis)을 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.
왼쪽 상동성 암의 업스트림에 포워드 프라이머를 설계하고 인서트에 리버스 프라이머를 설계합니다. 염기서열의 5개 프라임 접합을 표적으로 하여 PCR을 수행합니다. 선별된 F 제브라피시를 야생형 제브라피시와 교배하여 얻은 F1 배아를 GFP 발현 패턴에 대해 조사합니다.
접합 PCR을 사용하여 F1 배아를 유전형화합니다. 모든 F1 자손의 근육에서 유전 가능한 특정 형광이 관찰되었으며, 이는 커넥슨 39.9의 성공적인 GFP 라벨링을 나타냅니다. 모든 F2 자손의 수정체에서 유전 가능한 특정 형광이 검출되어 connexon 44.1의 성공적인 mCherry 태깅을 시사합니다.
커넥손 39.9 및 44.1의 올바른 knockin'은 접합 중합효소 연쇄 반응을 통해 검증되었습니다.
