荧光标记以可视化斑马鱼中的低表达蛋白质

该产品经过优化，可与荧光蛋白标签进行蛋白质同步，并可视化感兴趣的斑马鱼实验室个体的蛋白质位置和表达。它特别适用于对低丰度表达的蛋白质进行成像。我们的方法简化并加速了供体构建过程。

这些组件（CDS 除外）事先已合并到主干网中。供体还进行了优化以提高效率。传输筛选工作流程以最低的时间和精力成本积累可继承的细胞核。

斑马鱼是广泛用于感染和免疫研究的模式生物。我们对脓毒症的潜在机制特别感兴趣。由于我们现在能够使用我们的方案轻松进行荧光标记，因此我们将尝试标记斑马鱼中的图像、脓毒症蛋白和细胞。

首先，将一条健康的雌性斑马鱼和两条健康的雄性斑马鱼放入交配池中。使用隔板将雄性和雌性分开，为它们交配做准备。在显微注射当天，在无 RNase 环境下的冰上制备显微注射混合物。

使用不含 Rnase 的移液器吸头，将微量注射溶液装入针头中。将加载的针头放入连接到微型注射器的微型机械手中。在显微镜下，使用尖头镊子轻轻捏住针尖，直到针尖断裂。

调整注射压力，直到针头始终弹出 1 纳升液滴。接下来，从配对水箱中取出隔板，让鱼繁殖六分钟。收集单细胞期胚胎并将其转移到含有胚胎缓冲液的培养皿中。

在光学显微镜下检查胚胎的健康状况，并去除未受精的卵子或碎屑。在单独的培养皿中留出 20 个健康的胚胎作为未注射的对照，并在培养皿上贴标签。使用小刷子，将健康的单细胞期胚胎转移并轻轻排列到加热至室温的显微注射板的凹槽上。

从板中取出多余的缓冲液。在针尖的帮助下，轻轻调整每个胚胎的位置，使动物杆面向针头。将 1 纳升混合溶液注入动物杆中。

注射后，将胚胎轻轻冲洗到装有胚胎缓冲液的 6 孔板中。将板放入 28.5 摄氏度的恒温培养箱中。受精后 10 小时，在立体显微镜下检查胚胎发育并去除死胚胎。

受精后 24 小时，将胚胎收集到 1.5 毫升试管中进行基因分型，并小心丢弃多余的水。向每个试管中加入 100 μL 含有蛋白酶 K 的裂解缓冲液。将试管在 56 摄氏度下孵育 1 小时，然后在 95 摄氏度下孵育 15 分钟。

孵育后，加入 200 微升乙醇并充分混合。将试管以 19， 000 G 离心 10 分钟，弃去上清液，然后用 500 微升 70% 乙醇重悬沉淀。再次离心并风干沉淀，然后将其溶解在 50 微升双蒸水中。

使用 1 μL 提取物制备用于 PCR 的反应混合物。PCR 后，用 2 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增成功。进行酶消化以评估 sgRNA 的效率。

轻轻混合消化溶液，并按照制造商的说明在室温下孵育。将消化产物的琼脂糖凝胶与未消化的 PCR 对照一起运行，以确认消化。要分析 sgRNA 效率，请打开 TIDE 网站并单击 Start TIDE。

将 sgRNA 的引导序列输入到引导序列帧中。单击 Browse（浏览），将野生型对照的测序结果上传到对照样品色谱图字段中。同样，将编辑后的样品的测序结果上传到测试样品色谱图字段中。

单击 Update View 以分析结果。首先，使用连接非依赖性克隆或带有核酸外切酶 III 的 LIC 来构建供体质粒。设计引物 F1，其序列与载体元素 1 和元素 2 的一部分重叠。

设计包含元素 1、元素 2 和元素 3 部分的引物 R2。设计引物 F2 以包括元件 3 和 4，以及 sgRNA 靶位点之后的 CDS 的 5 个主要序列。使用涂层序列的三个素数序列和与载体的重叠序列设计引物 R1。

使用斑马鱼 CDNA 作为模板，并使用设计的引物进行 PCR。使用乙醇沉淀纯化 PCR 产物。用限制性内切酶（如 pCI 和 Acc65I）消化供体载体，并纯化消化的供体载体。

使用 DNA 凝胶电泳定量纯化的 PCR 片段和消化的供体载体。接下来，用纯化的供体载体制备 LIC 混合物，并在冰上孵育 60 分钟。加入 1 微升 0.5 摩尔 EDTA 以终止反应。

上下移液以混合溶液。将反应混合物在 60 摄氏度下孵育 5 分钟。将 LIC 产品放在冰上冷却。

然后，使用 LIC 产品转化 DH5-Alpha 感受态细胞。将转化的细胞接种在含有氨苄青霉素的 Luria-Bertani 平板上，并培养 16 小时。孵育后，从 LIC 板中挑选单个菌落进行酶消化分析和 DNA 测序。

使用纯化试剂盒提取和纯化正确的供体质粒。显微注射后 12 至 48 小时，在立体荧光显微镜下，用显微注射混合物注射斑马鱼胚胎以进行基因敲除，观察斑马鱼幼虫的荧光。使用既定的筛选方法，选择荧光幼虫并分别饲养它们。

在一个月大时，从每条麻醉斑马鱼中收集一小块鳍放入标记的 PCR 管中。将相应的麻醉斑马鱼放入装满紫外线消毒过滤水的 6 孔板中，与试管上的标签相匹配。使用碱性裂解法提取基因组 DNA。

在左同源臂的上游设计一个正向引物，并在插入片段上设计一个反向引物。进行 PCR，靶向序列的五个主要连接。检查通过将筛选的 F 斑马鱼与野生型斑马鱼交配获得的 F1 胚胎的 GFP 表达模式。

使用连接 PCR 对 F1 胚胎进行基因分型。在所有 F1 后代的肌肉中观察到可遗传的特异性荧光，表明连接子 39.9 的 GFP 标记成功。在所有 F2 后代的晶状体中检测到可遗传的特异性荧光，表明连接子 44.1 的 mCherry 标记成功。

通过连接聚合酶链反应验证了连接子 39.9 和 44.1 的正确敲入。