Этот протокол позволяет изучать регенерацию спинного мозга у лягушек. Полученные знания могут дать новое понимание, чтобы понять, как люди реагируют на травму спинного мозга. Основным преимуществом этого протокола является легкость в выполнении травмы, а также то, что по сравнению с парадигмой ампутации хвоста, эта техника лучше имитирует то, что происходит у людей.
Этот метод позволяет бросить вызов регенеративному процессу, чтобы лучше понять участие различных генов, белков, молекул и сигнальных путей, тем самым идентифицируя новые терапевтические мишени, найти правильное место для генерации травмы, а также ее расширения, сложно. Возможность видеть эти шаги имеет решающее значение для того, чтобы сделать эту процедуру простой и воспроизводимой. Через три-четыре недели после оплодотворения поместите головастиков в чашку Петри и проверьте морфологию и внешний вид передних и задних конечностей.
Ищите следующие анатомические характеристики животных стадии-50, передние конечности, которые только появляются и являются сферическими, и задние конечности, которые являются выступающими и сферическими. Перед операцией обезбольте головастиков, поместив их в 0,02% трицин мезилат в 0,1 раза больше раствора Барта, и проверьте, что животные не реагируют, перевернув их вверх дном. Чтобы выполнить операцию по трансекции спинного мозга, используйте столовую ложку и щипцы, чтобы поместить обезболенную спинную сторону головастика стадии 50 вверх на влажный кусок марли в верхней половине стеклянной чашки Петри.
Затем, используя микродиссекционные пружинные ножницы, делают разрез кожи и спинных мышц на среднегрудном уровне. Для контроля фиктивных животных убедитесь, что размер разреза составляет всего 0,2 миллиметра и не повреждает спинной мозг. У трансецированных животных делают второй разрез в 0,2 миллиметра, чтобы полностью трансецировать спинной мозг.
После операции переведите головастиков в резервуар, содержащий 500 миллилитров в 0,1 раза раствор Барта с однократным введением пенициллина и стрептомицина при плотности от 10 до 12 головастиков на резервуар. Поддерживайте трансективных и управляйте фиктивными головастиками в отдельных танках. Поддерживают головастиков с аэрацией при температуре от 20 до 21 градуса Цельсия.
Меняйте раствор Барта антибиотиками через день до конца эксперимента. Начните кормить головастиков через день после операции и устраните мертвых животных. Для анализа плавания приобретите коробку со светодиодной подсветкой изнутри, покрытую прозрачным полистирольным листом, пропускающим свет, и установите камеру над светодиодным ящиком.
Затем поместите чашку Петри диаметром 15 сантиметров поверх коробки, заполненной 100 миллилитрами 0,1-кратного раствора Барта. Однажды после трансекции поместите головастика в чашку Петри и оставьте ее на пятиминутный адаптационный период. После адаптации запустите видео, отслеживающее поведение свободного плавания с помощью эталонного программного обеспечения в течение пяти минут.
После того, как видео будет завершено, перенесите головастика обратно в его резервуар. Этот репрезентативный точечный график показывает восстановление двигательной функции во времени. Через пять дней после трансекции головастики проплыли в среднем 0,7 метра за пять минут, показав снижение плавательной способности.
Эта емкость увеличивалась с переходными днями, показывая в среднем 2,1 метра за пять минут через 10 дней и 3,1 метра за пять минут после 15 дней после трансекции. Полное восстановление плавательных способностей наблюдалось через 20 дней после трансекции, в среднем 5,7 метра за пять минут. Средний показатель плавания может варьироваться в зависимости от каждой партии животных.
Таким образом, экспериментальную группу всегда следует сравнивать с соответствующими контрольными группами, а не с ранее полученными данными. После операции животные могут быть использованы для глобального анализа, включая транскриптомику, протеомику и метаболомику, а также для скрининга соединений, которые ингибируют или способствуют регенерации спинного мозга, с целью разработки новых терапевтических подходов.
