Этот метод может быть полезен для ответа на ключевые вопросы в нейробиологических областях, таких как, как функции пресинаптических терминалов in vivo. Основным преимуществом этого набора методов является то, что мы показываем бесплатные подходы к ослов функции обонятельных путей с использованием tadpoles Xenopus в качестве модели животных. Демонстрацией этой процедуры будет я, Беатрис Терни и Паоло Паччолла.
Начните процедуру трансекции, смачивая два куска целлюлозной качественной фильтровальной бумаги в 0,02%MS2 22 обезболивающее решение, и поместив их под вскрытый прицел. Затем выберите головастика из бака и погрузите его в блюдо из обезболивающего раствора. Головастик должен прекратить плавание в течение двух-четырех минут.
Проверьте наличие надлежащей анестезии при отсутствии реакции на механические стимулы, применяемые на уровне хвоста с помощью пинцета. Поместите обезболивающее головастика на фильтровальную бумагу под прицел. Распоить животное с его спинной стороны лицом вверх, чтобы структуры мозга могут быть визуализированы.
Для поведенческих экспериментов, использовать вени ножницы для трансектирования обоих нервов, чтобы подавить всю информацию одорантов, прибывающих в обонятельной лампы. Загрузите польированную стеклянную пипетку с двумя микролитров кальция зеленый один декстрин раствор, и поместите его в микроинъектор. Поместите обезболивающее под рассеченный микроскоп на фильтровальную бумагу, затем перемести кончик пипетки в основную полость носовой капсулы и доставите от 0,15 до 0,3 микролитров красителя.
Оставьте головастика на месте на две-три минуты. Используя трубку Pasteur, капайте 0.02%MS2 22 раствор на более coddle части животного, чтобы избежать высыхания. Перенесите животное в восстановительный резервуар, где головастик должен восстановить нормальное плавание в течение 10 минут или около того.
Наблюдайте за флуоресцентностью на уровне гломерулярного слоя обонятельной луковицы на следующий день после инъекции. Подготовка анестезированной головастика для визуализации, сначала удалив кожу над обонятельной луковицы. Используйте ножницы вени, чтобы сделать боковой разрез на коже головастика на краю центральной нервной системы на уровне обонятельной луковицы.
Избегайте расширения разреза на тектум, который может быть легко идентифицирован по расположению зрительного нерва. Держите животное влажным, применяя капли 0,02%MS2 22 раствор с помощью пастер пипетки затем ущипнуть вырезать кожу с помощью пинцета и потяните его за нервную систему. Проверить успешное удаление при отсутствии меланоцитов над обонятельной луковицей.
Поместите головастика в колодец клеточной гвардии покрытием блюдо. Распоистите стеклянную крышку, покрытую высокой вакуумной смазкой, чтобы покрыть верхнюю часть тектума до конца хвоста. Убедитесь, что обонятельные лампы и placodes остаются подвержены внеклеточной среде.
Заполните блюдо питри раствором Xenopus Ringer, содержащим 100 микромоляных тубулярин для предотвращения мышечных сокращений. Поместите блюдо, держащее головастика под вертикальным микроскопом. Соедините резервуар, содержащий раствор Xenopus Ringer, с блюдом с использованием полиэтиленовой трубки для непрерывного изобилия раствора Xenopus Ringer.
Начните перелив решения Xenopus Ringer. Поддерживать уровень раствора в блюде постоянно на протяжении всего эксперимента. Непрерывно оценить головастика жизнеспособности путем наблюдения кровообращения через сосуды.
Начните живую визуализацию с помощью низкой цели увеличения, чтобы визуализировать головастика. Перемещение оси микроманипулятора, чтобы поместить капилляр доставки раствора запаха на верхней части одной носовой капсулы, образуя 90 градусов угол с обонятельным нервом. Найти обонятельную лампу расположен ipsilaterally к носовой капсулы.
Переключитесь на цель воды с высоким увеличением с большой рабочей дистанцией. Проверить выбросы флорескции I.Glomerular структур должно быть очевидно. Начните с пипетки 20 миллилитров свежего аминокислотного раствора в повышенный резервуар.
Затем возьмите шесть продуктов питания лишенных головастиков из их жилья бак, и поместите их в два литра чистой воды головастика, чтобы свести к минимуму воздействие одорантов. Поместите модифицированное шесть хорошо блюдо на белый светодиодный трансиллюминатор. Заполните каждый колодец 10 миллилитров головастика воды.
Поместите один головастик за колодец, а затем оставить на отдых, по крайней мере три минуты. Начните приобретение изображений и приобретайте фильмы, содержащие базальные, стимулирующие и восстановительные периоды. Привлекательный ответ может быть обнаружен как движение к сопла доставки раствор аминокислот.
Верните животных в свой резервуар после визуализации. Отслеживание позиций головастика в пределах 35 миллиметров на 35 миллиметров, или эквивалентного размера в пикселях, позволяет количественно оценить обонятельное поведение. Пунктирная линия представляет проксимальную область к входу раствора запаха.
Отдельные участки головастикных движений строятся с использованием координат X Y, полученных с помощью анализа изображений. Извлеченные участки подвижности должны точно воспроизводить видео изображения. Область интереса радиусом 8,75 миллиметра, сосредоточенная на входе раствора, используется для классификации близости животных к источнику запаха.
Больше времени, проведенное в непосредственной близости от сопла запаха указывает на положительный тропизм. Время, проведенное головастиков вблизи сопла в определенные периоды, например, 15-секундные интервалы, позволяет определить способность обнаруживать аминокислотные растворы. Общее поведение популяции головастиков можно получить путем построения распределения отдельных данных.
Положительный тропизм может быть обнаружен, когда аминокислотный раствор готовится на одном миллимолярне или 160 микромолях. Звери не реагируют на применение воды. После этой процедуры, другие методы, такие как гистологические методы или электрофизиология, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как изменение синаптических свойств после травмы.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области нейробиологии, чтобы исследовать обработку обонятельной информации в головастик Xenopus.
