Наноплазмон-улучшенное рассеяние, или nPES, является простой и неинвазивной альтернативой хирургической биопсии, которая может пропустить трудоемкие и трудоемкие шаги по очистке экзосомы, расширяя применение экзосомного анализа до клинических условий. Этот анализ nPES является быстрой процедурой для анализа конкретных биомаркеров на внешней мембране экзосом, которая не требует отдельных шагов изоляции и очистки. Нам нужен только очень маленький клинический образец для этого анализа.
Таким образом, этот метод может расширить использование nPES для изучения генетически модифицированных или PDX мышиных моделей. Есть несколько шагов в этом протоколе, которые могут показаться пугающими. Тем не менее, с несколькими практикой работает, каждый с основными навыками мокрой лаборатории можно научиться успешно выполнять nPES.
Для начала процедуры объедините 40 микролитров подвески нанородов NeutrAvidin с 200 микролитров холодного, рН семь фосфатно-буферизированных солевые растворы. Центрифуга смеси при 8500 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, и удалить супернатант. Повторите этот процесс стирки в два раза больше, а затем повторно нанородов в 40 микролитров холодного PBS.
Далее добавьте 150 микролитров холодного PBS и 10 микролитров раствора 0,5 миллиграмма на миллилитр соответствующих биотинилированных антител к суспензии. Смешайте при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы получить антитела спряженных золотых нанородов. Вымойте нанород три раза центрифугации в 200-микролитровых порциях холодного PBS при 6500 раз g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут каждый.
После этого, resuspend промывают антитела спряженных нанородов в 200 микролитров холодного PBS, и хранить их при четырех градусах по Цельсию на срок до 24 часов. Чтобы начать подготовку слайда, разбавить желаемого экзосомы захвата антител до 025 миллиграммов на миллилитр в PBS. Pipette один микролитер этого раствора в каждой колодец белка A / G-обработанные слайд при поддержке оптического класса стекла.
Затем перенесите слайд в увлажняющую коробку, чтобы скважины не высохли во время инкубации. Инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы обездвижить захват антител. Затем, аспирировать оставшийся раствор для удаления несыхух антител.
Вымойте скважины, добавив и аспирируя один микролитер PBS три раза. Затем быстро загрузите каждую колодец одним микролитером блокирующего буфера на основе PBS и инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. При запуске около 15 образцов, мы должны использовать одноканайонный пипетку для загрузки блокирующего буфера на 120 скважин менее чем за пять минут, чтобы избежать испарения блокирующего агента.
Начните готовить раствор конъюгированных антителами золотых нанородов во время блокирования слайдов. Примерно за 30 минут до блокирования отделки, быстро разморозить плазмы или сыворотки образцов в комнатной температуре водяной бане. Vortex размороженных образцов в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что подвески являются однородными.
Затем центрифуга образцов в 500 раз g в течение 15 минут, чтобы вызвать белковые агрегаты и другой мусор. Передача 10-микролитровых алицитов супернатанта на свежие трубки, и сделать один-к-одному разбавления с PBS. Смешайте разбавленные образцы нежным вихрем или инверсией по мере необходимости.
Когда блокировка слайда закончена, аспирировать блокирующий буфер и мыть скважины три раза с помощью одномиберосных частей PBS. Немедленно загрузите образцы в скважины одним микролитером на скважину и восемью тиражами на образец. Загрузите стандарты экзосомы в соответствующие скважины таким же образом.
Инкубировать слайд в течение 12 до 18 часов в холодильнике при четырех градусах по Цельсию. Затем, аспирировать колодцы, и мыть каждый хорошо один раз с одним микролитером PBS. Загрузите один микролитер спрягаемой золотой нанородной подвески в каждую колодец и инкубировать горку при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.
После этого, аспирировать подвеску нанорода, и мыть слайд в PBS дополняется 1%полисорбат 20 в течение 10 минут с помощью смесителя. Затем, аспирировать колодцы, и мыть слайд в деионизированной воде в течение 10 минут на вращающийся смеситель. Удалите воду и дайте слайду высохнуть в чистой чашке Петри перед тем, как донести слайд до темного полевого микроскопа.
Настройка перевернутого микроскопа, оснащенного конденсатором погружения в нефть темного поля, 4x целью и моторизованной ступени. Подключите микроскоп к компьютеру с помощью цифровой камеры и откройте программное обеспечение для визуализации. Затем поместите образец слайда вверх дном на стадии микроскопа, и применить небольшую каплю масла погружения, где конденсатор объектив контактов слайда.
Отображение представления через микроскоп в программном обеспечении для визуализации. Отрегулируйте время экспозиции по отношению к стандарту высокой концентрации, чтобы убедиться, что изображение не будет насыщено. Затем откройте инструмент для сканирования больших изображений и установите объективное увеличение до 10 раз.
Выберите, чтобы закрыть активный затвор во время движения этапа и ждать 20 миллисекунд перед каждым захватом. Установите перекрытие стежка до 20% и выберите сшивание через оптимальный путь. Выберите для создания большого изображения из сканирования.
Установите камеру, чтобы сосредоточиться вручную в начале сканирования, и включить автоматическое пошаговое внимание каждые 20 полей. Затем выберите установить левые, правые, верхние и нижние пределы для целевого поля сканирования и определить область сканирования, перемещая стадию микроскопа к каждому из желаемых пределов. Затем отрегулируйте фокус, конденсатор и освещение области, чтобы получить четкое, хорошо освещенное изображение.
Назовите созданный файл изображения и начните сканирование. Когда он закончит, откройте изображение и сохраните его в масштабе 1/8. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
Затем откройте меню Plugins, нажмите DSM Scan, определите количество столбцов и строк, установите процент размера до 25, установите диаметр пятна в пикселях до 190-200, установите диапазон диаметра до 32 и установите диаметр прироста в пикселях до восьми. Установите низкие и высокие пределы DSM до нуля и 62, прилегающее расстояние до 100 и смещение вычитания до нуля. Запустите алгоритм DSM и сохраните полученные данные.
Метод анализа DSM показал хорошую воспроизводимость в последовательно разбавленных экзосомных образцах PANC-1 в диапазоне от 0,24 до 1,2 микрограмма на микролитер. Наблюдалась сильная линейная корреляция между реакцией рассеяния нанородов золота и концентрацией белка экзосомы. Значительная разница в изобилии экзосом сыворотки, выражаюющих связанный с раком биомаркер EphA2, наблюдалась между пациентами с раком поджелудочной железы и здоровыми пациентами.
С добавлением блокирующего агента вперед, быстрый и точный трубопровод имеет решающее значение, чтобы избежать испарения образцов, введения перекрестного загрязнения, и царапины поверхности слайда. Следуя этой процедуре, мы выполняем статистический анализ, чтобы исследовать любую корреляцию между выражением экзосомального биомаркера интереса и различной стадией исследуемого заболевания. После создания этой технологии, и мы в состоянии найти экзосомные биомаркеры для ранней стадии рака поджелудочной железы.
В настоящее время мы расширяем это открытие на другие виды рака и инфекционных заболеваний. Как правило, образцы обрабатываются в этом анализе либо пациента образцов или очищенных образцов экзосомы из раковых клеток линий, которые требуют специальной подготовки безопасности.
