Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области оптической микроскопии, такие как, как принимать изображения супер-разрешения, а также изображения FRET с помощью того же микроскопа. Основным преимуществом этой техники является то, что мы могли бы объединить три различных модуля визуализации в один микроскоп, что значительно снижает общую стоимость. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку сборка пути возбуждения трудно узнать.
Они требуют правильного выбора деталей и чувствительных оптических выравниваний. Для начала установите карту сбора данных через интерфейс PCI и используйте ее для подключения лазеров к компьютеру. Управление поведением лазеров и выключение с помощью транзистор-транзисторной логики вывода и их регулировки мощности аналоговым выходом этой карты.
Затем подготовьте вибрационный оптический стол с зеркалами и сплиттерами пучка, как показано здесь и описано в сопроводительном текстовом протоколе. Объедините лазерные лучи в одноотмейное оптическое волокно, сначала украсив пластину адаптера волокна в крепление перевода z-оси. Затем смонтировать ахроматический дублет объектив в клетке пластины.
Используйте удлинитель для подключения адаптера и объектива для формирования клетки. Затем используйте оптические столбы толщиной в один дюйм, чтобы смонтировать клетку на оптическом столе. Выровнять 647-нанометровый лазер, регулируя компоненты, чтобы получить максимальную мощность лазера через волокно.
После выравнивания первого лазера делается, временно установить пару ирисов и выровнять остальные лазеры один за другим. Проверьте эффективность выравнивания каждого лазера с помощью счетчика мощности. Не забудьте оставить одну радужную оболочку перед пластиной адаптера, чтобы уменьшить отражения лазеров.
Далее, дизайн и установка объектива увеличения, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Для того, чтобы создать эффект астигматизма, необходимый для извлечения z-координат каждой молекулы, поместите 3D-объектив с 10-метровым фокусным расстоянием в кассету и вставьте его в траекторию пучка излучения. Чтобы свести к минимуму вибрации во время последовательной многоцветной эпифлюоресценции изображения, используйте фильтры излучения, помещенные в колесо барьерного фильтра, подключенное рядом с микроскопом.
Для одновременного многоцветного обнаружения во время одномекулярных экспериментов FRET поместите другой фильтр, установленный в сплиттере выбросов. Чтобы настроить для дифракции ограниченных изображений с помощью эпи-возбуждения, сначала настроить возбуждение лазера случайный угол эпи режиме в руке освещения. Затем отсоедините 3D-объектив и вставьте куб шунтирования в сплиттер выбросов.
Затем вставьте маг-объектив для расширенного освещения. После настройки возьмите многоканайные, z-стек и/или истекли изображения образца на основе желаемых результатов. Чтобы настроить многоцветное одноямекулярное обнаружение поверхностно-иммобилизованных молекул, сначала переместите колесо фильтра в пустое положение.
Это позволит лазерам пройти. Затем отрегулируйте случайный угол возбуждения лазеров к углу дерна и отсоединийте как магнитные, так и 3D-объективы. Затем ввемите трехканаленный режим в сплиттере выбросов, сначала заменив куб шунтирования кубом калибровки, который позволяет всему свету проходить через все каналы.
Затем включите камеру под DIC и отрегулируйте диафрагму сплиттера выбросов до тех пор, пока на экране не появятся три полностью разделенных канала. Включите вертикально-горизонтальные ручки управления регулировкой на сплиттере выбросов и примерно выровнять три канала. Затем выключите камеру и замените куб калибровки тройным кубом.
Поместите образец 100-нанометровых многокананновых бусин. После возбуждения на 488 нанометров, 100-нанометровые многоканаленовые бусины излучают различные длины волн света, что позволяет трехканаленного выравнивания. Затем включите камеру и 488-нанометровый лазер, увеличьте масштаб одного из ярких бусинок и, наконец, выровняйте три канала, снова повернув ручки регулировки управления.
Теперь, когда образец находится на месте, используя слабый лазер, перейдите в область с разумной плотностью пятна и отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции для достижения приемлемого уровня сигнала к шуму и фотоотчета. Затем используйте программное обеспечение для визуализации, чтобы сделать снимки замедленного действия. Для визуализации в супер-разрешении начните с вставки 3D-объектива и удалите магнитный объектив.
Затем определите оптимальный угол возбуждения лазера, чтобы быть угол дерна. Для того, чтобы найти правильную объективную высоту для sr изображений, используйте DIC изображения, чтобы найти среднюю плоскость клеток. Определите плоскость по высоте, с которой клетки становятся прозрачными.
Как только желаемая фокусная плоскость будет определена, начните визуализацию супер-разрешения. При визуализации измените мощность 405-нанометрового лазера, чтобы поддерживать разумную плотность мигающих пятен. Начните визуализацию без фиолетовой лазерной мощности.
Подсчитайте количество мигающих пятен в определенный период и увеличьте мощность фиолетового лазера, чтобы количество мигающих пятен держалось выше определенного пользователем порога подсчета голосов в поле зрения. Проанализируйте данные, обнаружив центроиды каждого пятна в кадрах изображений и извлекайте z-значения для каждого пятна из ширины X и Y. Создайте реконструированное изображение и визуализуйте объекты в 3D.
Эта установка микроскопа позволяет гибкое и воспроизводимое переключение между различными методами визуализации, включая обычные эпифлуоресцентные изображения, одномекулевую визуализацию на основе обнаружения супер-разрешения и многоцветное одноямекулярное обнаружение. Для того, чтобы выявить более мелкие детали в молекулярной сборке, микроскопия супер-разрешения сочетает в себе тысячи изображений, таких как этот. Эти изображения затем реконструируются для создания окончательного изображения супер-разрешения.
Методы супер-разрешения обеспечивают высокое пространственное разрешение, предоставляя детали, которые не могут быть видны с другими методами. Это подчеркивается на двух изображениях, показанных здесь. Изображение супер-разрешения показывает тот же бактериальный регулятивный RNase как изображение эпифлуоресценции, но позволяет для обнаружения одной молекулы.
SmFRET является еще одним методом, способным ангстрем к нанометровому разрешению. Здесь сложенные молекулы РНК были помечены зеленым донорским красителем и красным красителем-приемником. Траектории интенсивности флуоресценции могут быть извлечены из отдельных отдельных молекул, генерируя эффективность FRET как функцию времени.
Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасным, и такие меры предосторожности, как ношение защиты глаз или снижение лазерной силы всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
