Nanoplazmon la geliştirilmiş saçılma veya nPES, klinik ayarlara ekzozom analizi uygulamasını genişleterek, zaman alıcı ve emek yoğun ekzosome arınma adımları atlayabilirsiniz cerrahi biyopsi için basit ve noninvaziv bir alternatiftir. Bu nPES testi, ayrı izolasyon ve arınma adımları gerektirmeyen ekzozomların dış zarındaki spesifik biyobelirteçleri analiz etmek için hızlı bir işlemdir. Bu test için sadece çok küçük bir klinik örneğe ihtiyacımız var.
Bu nedenle, bu yöntem nPES kullanımını genetik olarak tasarlanmış veya PDX fare modellerini incelemeye genişletebilir. Bu protokolde korkutucu görünebilecek birkaç adım vardır. Ancak, birkaç uygulama çalışır, temel ıslak laboratuvar becerileri olan herkes başarıyla nPES gerçekleştirmek için öğrenebilirsiniz.
İşleme başlamak için, NeutrAvidin-fonksiyonel altın nanorods bir süspansiyon 40 mikrolitre soğuk 200 mikrolitre ile birleştirmek, pH yedi fosfat tamponlu salin. Karışımı 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 8500 kez g'de santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın ve 40 mikrolitre soğuk PBS'de nanorodları yeniden askıya alın.
Daha sonra, süspansiyona uygun biyotinylated antikorların mililitre başına 0,5 miligramlık çözeltisinin 150 mikrolitre soğuk PBS ve 10 mikrolitreekleyin. Antikor konjuge altın nanorods elde etmek için iki saat boyunca dört derece santigrat karıştırın. Nanorodları her biri 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 6500 kez 6500 kez soğuk PBS'nin 200 mikrolitrelik kısımlarında santrifüj le üç kez yıkayın.
Daha sonra, yıkanmış antikor konjuge nanorodları 200 mikrolitre soğuk PBS'de yeniden askıya alın ve 24 saate kadar dört santigrat derecede saklayın. Slaytı hazırlamaya başlamak için, PBS'de mililitre başına 025 miligram ait istenilen ekzozom yakalama antikorlarını seyreltin. Pipet optik sınıf cam ile desteklenen bir protein A / G-tedavi slayt her kuyuiçine bu çözeltinin bir mikrolitre.
Daha sonra, kuyuların kuluçka sırasında kurumadığından emin olmak için kaydırağı nemlendirici bir kutuya aktarın. Yakalanan antikorları etkisiz hale getirmek için kaydırağı 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bağlı olmayan antikorları kaldırmak için kalan çözeltiaspire.
Bir mikrolitre PBS ekleyerek ve üç kez su sayılarak kuyuları yıkayın. Ardından, her kuyuyu bir mikrolitre PBS tabanlı engelleme arabelleği yle hızlı bir şekilde yükleyin ve kaydırağı iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Yaklaşık 15 numune çalıştırırken, engelleme aracısının buharlaşmasını önlemek için engelleme tamponu beş dakikadan kısa bir sürede 120 kuyuya yüklemek için tek kanallı bir pipet kullanmalıyız.
Slayt engelleme sırasında antikor konjuge altın nanorods bir çözüm hazırlamaya başlayın. Kapatma dan yaklaşık 30 dakika önce, oda sıcaklığındaki su banyosunda plazma veya serum örneklerini hızla eritin. Süspansiyonların homojen olduğundan emin olmak için çözülmüş numuneleri 30 saniye boyunca girdap layın.
Daha sonra, protein agregaları ve diğer enkaz çökelti için 15 dakika boyunca 500 kez g olarak numuneleri santrifüj. Süpernatantın 10 mikrolitrelik aliquotlarını taze tüplere aktarın ve PBS ile bire bir seyreltmeyapın. Seyreltilmiş numuneleri nazik girdap veya ters çevirme ile uygun şekilde karıştırın.
Slayt engelleme bittiğinde, engelleme tamponu aspire ve PBS bir mikrolitre porsiyon ile kuyuları üç kez yıkayın. Numuneleri hemen kuyu başına bir mikrolitre ve numune başına sekiz kopya ile kuyulara yükleyin. Ekzozom standartlarını uygun kuyulara aynı şekilde yükleyin.
Kaydırağı 12 ila 18 saat buzdolabında 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kuyuaspire ve pbs bir mikrolitre ile her iyi bir kez yıkayın. Her kuyuya bir mikrolitre antikor konjuge altın nanorod süspansiyon yükleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede slayt kuluçka.
Daha sonra, nanorod süspansiyon aspire, ve PBS slayt yıkamak 1% polisorbat ile takviye 20 bir mikser kullanarak 10 dakika. Daha sonra, kuyuları aspire edin ve dönen bir mikser üzerinde 10 dakika deiyonize suda slayt yıkayın. Suyu çıkarın ve kaydırağı karanlık alan mikroskobuna getirmeden önce temiz bir Petri kabında kaydırağının kurumasını bekleyin.
Karanlık alan yağ daldırma kondansatör, 4x hedefi ve motorlu bir sahne ile donatılmış ters bir mikroskop ayarlayın. Mikroskobu dijital kamera aracılığıyla bilgisayara bağlayın ve görüntüleme yazılımını açın. Daha sonra, örnek slaytı mikroskop aşamasına ters yerleştirin ve kondansatör merceğinin kaydırağa temas ettiği küçük bir daldırma yağı damlatın.
Görünümü görüntüleme yazılımındaki mikroskop aracılığıyla görüntüleyin. Görüntünün doygun olmamasını sağlamak için pozlama süresini yüksek konsantrasyonlu bir standarda göre ayarlayın. Ardından, büyük görüntüleri taramak için aracı açın ve nesnel büyütmeyi 10x olarak ayarlayın.
Sahne hareketi sırasında etkin deklanşöre kapatmayı ve her yakalamadan önce 20 milisaniye beklemeyi seçin. Dikiş üst üste kadar ayarlayın 20% ve optimum yol ile dikiş seçin. Teşpten büyük bir görüntü oluşturmayı seçin.
Kamerayı tamanın başlangıcında manuel olarak odaklanacak şekilde ayarlayın ve her 20 alanda otomatik adım adım odaklamayı etkinleştirin. Ardından, hedef taramaya alan için sol, sağ, üst ve alt sınırları ayarlamayı seçin ve mikroskop aşamasını istenilen sınırların her birine taşıyarak taramaya yönelik alanı tanımlayın. Ardından, net ve iyi aydınlatılmış bir görüntü elde etmek için odağı, kondansatörve alan aydınlatmasını ayarlayın.
Oluşturulacak resim dosyasını adlandırın ve tarayıp başlatın. Bittiğinde, görüntüyü açın ve 1/8 ölçekte kaydedin. Görüntü analizi yazılımını açın.
Ardından, Eklentiler menüsünü açın, DSM Tarama'yı tıklatın, sütun ve satır sayısını tanımlayın, yüzdeyi 25'e ayarlayın, nokta çapını pikselolarak 190-200'e ayarlayın, çap aralığını 32'ye ayarlayın ve piksellerde artış çapını sekize ayarlayın. Düşük ve yüksek DSM sınırlarını sıfır ve 62'ye, bitişik mesafeyi 100'e ve çıkarma önyargısını sıfıra ayarlayın. DSM algoritmasını çalıştırın ve elde edilen verileri kaydedin.
DSM analiz tekniği, mikrolitre başına 0,24 ile 1,2 mikrogram arasında değişen seri olarak seyreltilmiş PANC-1 ekzozom örnekleri arasında iyi tekrarlanabilirlik gösterdi. Altın nanorodlardan gelen dağılım tepkisi ile ekzozom protein konsantrasyonu arasında güçlü bir doğrusal korelasyon gözlendi. Pankreas kanseri olan hastalar ile sağlıklı hastalar arasında kansere bağlı biyomarker EphA2'yi ifade eden serum ekzozomlarının bolluğunda önemli bir fark gözlendi.
Blokaj maddesinin eklenmesinden itibaren, hızlı ve doğru pipetleme numunelerin buharlaşmasını önlemek, çapraz kontaminasyon uyramak ve slayt yüzeyinin çizilmesi için çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilginin ekzozomal biyobelirteci ekspresyonu ile çalışılan hastalığın farklı evresi arasındaki ilişkiyi araştırmak için istatistik analizi yapıyoruz. Bu teknolojiyi kurduktan sonra, ve erken evre pankreas kanserleri için ekzozomal biyobelirteçler bulabiliyoruz.
Şu anda, bu keşfi diğer kanser türlerine ve enfeksiyon hastalıklarına genişletiyoruz. Genellikle, bu testte ele alınan örnekler ya hasta örnekleri ya da özel güvenlik eğitimi gerektiren kanser hücresi hatlarından arınmış ekzozom örnekleridir.
