Nanoplasmon-verstärkte Streuung, oder nPES, ist eine einfache und nichtinvasive Alternative zur chirurgischen Biopsie, die zeitaufwändige und arbeitsintensive Exosomenreinigungsschritte überspringen kann, wodurch die Anwendung der Exosomenanalyse auf klinische Umgebungen ausgeweitet wird. Dieser nPES-Assay ist ein schnelles Verfahren zur Analyse spezifischer Biomarker auf der äußeren Membran von Exosomen, die keine separaten Isolations- und Reinigungsschritte erfordern. Wir benötigen für diesen Test nur eine sehr kleine klinische Probe.
Daher kann diese Methode den Einsatz von nPES auf das Studium gentechnisch veränderter oder PDX-Mausmodelle ausdehnen. Es gibt ein paar Schritte in diesem Protokoll, die entmutigend erscheinen könnten. Mit einigen Übungsläufen kann jedoch jeder mit grundlegenden Nasslabor-Fähigkeiten lernen, nPES erfolgreich durchzuführen.
Um das Verfahren zu beginnen, kombinieren Sie 40 Mikroliter einer Suspension von NeutrAvidin-funktionalisierten Gold-Nanostäben mit 200 Mikroliter kalter, pH-sieben phosphatgepufferter Saline. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 8500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zweimal, und setzen Sie dann die Nanostäbe in 40 Mikroliter kalten PBS wieder aus.
Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter kaltes PBS und 10 Mikroliter einer 0,5-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung der entsprechenden biotinylierten Antikörper in die Suspension ein. Mischen Sie bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, um antikörperkonjugierte Gold-Nanostäbe zu erhalten. Waschen Sie die Nanostäbe dreimal durch Zentrifugation in 200-Mikroliter-Portionen kalten PBS bei 6500 mal g bei vier Grad Celsius für jeweils 10 Minuten.
Danach die gewaschenen Antikörperkonjugierten Nanostäbe in 200 Mikroliterkalten PBS wieder aufsetzen und bei vier Grad Celsius bis zu 24 Stunden lagern. Um mit der Vorbereitung des Dias zu beginnen, verdünnen Sie die gewünschten Exosomen-Capture-Antikörper auf 025 Milligramm pro Milliliter in PBS. Pipette einen Mikroliter dieser Lösung in jeden Brunnen eines Proteins A/G-behandelten Dias mit optischem Glas.
Übertragen Sie dann die Rutsche in eine Befeuchtungsbox, um sicherzustellen, dass die Brunnen während der Inkubation nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Aufnahmeantikörper zu immobilisieren. Dann aspirieren Sie die verbleibende Lösung, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Waschen Sie die Brunnen, indem Sie einen Mikroliter PBS dreimal hinzufügen und ansieren. Als nächstes laden Sie jeden Brunnen schnell mit einem Mikroliter PBS-basierten Sperrpuffer und inkubieren Sie die Folie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Wenn wir etwa 15 Proben ausführen, müssen wir eine einkanalige Pipette verwenden, um den Sperrpuffer in weniger als fünf Minuten auf 120 Bohrguts zu laden, um die Verdunstung des Blockierungsmittels zu vermeiden.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Lösung von antikörperkonjugierten Gold-Nanostäben während der Gleitblockierung. Etwa 30 Minuten vor Demendesierung stoltonen Sie Plasma- oder Serumproben in einem Raumtemperatur-Wasserbad. Wirbeln Sie die aufgetauten Proben für 30 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Suspensionen homogen sind.
Zentrifugieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang mit 500-fachm g, um Proteinaggregate und andere Trümmer zu fällen. 10-Mikroliter-Aliquots des Überstandes auf frische Schläuche übertragen und eins zu eins mit PBS verdünnen. Mischen Sie die verdünnten Proben gegebenenfalls durch sanfteS Wirbeln oder Inversion.
Wenn die Schiebeblockung abgeschlossen ist, den Sperrpuffer ansaugen und die Brunnen dreimal mit einem Mikroliter PBS-Portionen waschen. Laden Sie die Proben sofort mit einem Mikroliter pro Bohrgut und acht Replikationen pro Probe in die Brunnen. Laden Sie Exosomenstandards auf die gleiche Weise in die entsprechenden Brunnen.
Inkubieren Sie die Rutsche für 12 bis 18 Stunden im Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Dann die Brunnen ansaugen und jeden Brunnen einmal mit einem Mikroliter PBS waschen. Einen Mikroliter der antikörperkonjugierten Gold-Nanostabsuspension in jeden Brunnen laden und zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Danach die Nanostab-Suspension ansaugen und den Schlitten in PBS mit 1%Polysorbat 20 10 Minuten lang mit einem Mischer waschen. Dann die Brunnen ansaugen und die Rutsche in entionisiertem Wasser 10 Minuten lang auf einem rotierenden Mischer waschen. Entfernen Sie das Wasser, und lassen Sie den Schlitten in einer sauberen Petrischale lufttrocknen, bevor Sie den Dia zum Dunkelfeldmikroskop bringen.
Richten Sie ein invertiertes Mikroskop ein, das mit einem Dunkelfeld-Öl-Immersion-Kondensator, einem 4-fachen Objektiv und einer motorisierten Stufe ausgestattet ist. Schließen Sie das Mikroskop über eine Digitalkamera an einen Computer an, und öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware. Legen Sie dann den Probenschlitten auf den Kopf auf die Mikroskopstufe und tragen Sie einen kleinen Tropfen Tauchöl auf, bei dem die Kondensatorlinse den Dia kontaktiert.
Zeigen Sie die Ansicht durch das Mikroskop in der Bildgebungssoftware an. Passen Sie die Belichtungszeit gegenüber einem hochkonzentrierten Standardbrunnen an, um sicherzustellen, dass das Bild nicht gesättigt wird. Öffnen Sie dann das Tool zum Scannen großer Bilder, und legen Sie die objektive Vergrößerung auf das 10-fache fest.
Entscheiden Sie sich dafür, den aktiven Verschluss während der Bühnenbewegung zu schließen und 20 Millisekunden vor jeder Aufnahme zu warten. Stellen Sie die Nähüberlappung auf 20 % ein, und wählen Sie die Nähte über den optimalen Pfad aus. Wählen Sie aus, ob Sie ein großes Bild aus dem Scan erstellen möchten.
Stellen Sie die Kamera zu Beginn des Scans manuell auf den Fokus ein, und aktivieren Sie alle 20 Felder den automatischen Schritt-für-Schritt-Fokus. Legen Sie dann die linken, rechten, oberen und unteren Grenzwerte für das Zielscanfeld fest, und definieren Sie den Scanbereich, indem Sie die Mikroskopstufe auf die gewünschten Grenzwerte verschieben. Passen Sie als Nächstes den Fokus, den Kondensator und die Flächenbeleuchtung an, um ein klares, gut beleuchtetes Bild zu erhalten.
Benennen Sie die zu erstellende Bilddatei, und starten Sie den Scan. Wenn es abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bild und speichern Sie es im Maßstab 1:8. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware.
Öffnen Sie dann das Plugins-Menü, klicken Sie auf DSM-Scan, definieren Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen, legen Sie den Prozentsatz der Größenänderung auf 25 fest, legen Sie den Spotdurchmesser in Pixel auf 190 bis 200 fest, legen Sie den Durchmesserbereich auf 32 fest, und legen Sie den Inkrementdurchmesser in Pixel auf acht fest. Legen Sie die niedrigen und hohen DSM-Grenzwerte auf Null und 62, den angrenzenden Abstand auf 100 und die Subtraktionsverzerrung auf Null fest. Führen Sie den DSM-Algorithmus aus, und speichern Sie die resultierenden Daten.
Die DSM-Analysetechnik zeigte eine gute Reproduzierbarkeit in seriell verdünnten PANC-1-Exosomenproben zwischen 0,24 und 1,2 Mikrogramm pro Mikroliter. Es wurde eine starke lineare Korrelation zwischen der Streuungsreaktion der Gold-Nanostäbe und der Exosomenproteinkonzentration beobachtet. Ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit von Serumexosomen, die den krebsassoziierten Biomarker EphA2 exdrückten, wurde zwischen Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs und gesunden Patienten beobachtet.
Ab dem Zusatz des Sperrmittels ist eine schnelle und genaue Pipettierung von entscheidender Bedeutung, um die Verdunstung von Proben zu vermeiden, Kreuzkontaminationen einzuführen und die Oberfläche des Schlittens zu zerkratzen. Nach diesem Verfahren führen wir statistische Analysen durch, um einen Zusammenhang zwischen der Expression des exosomalen Biomarkers von Interesse und dem verschiedenen Stadium der untersuchten Krankheit zu untersuchen. Nach der Etablierung dieser Technologie, und wir sind in der Lage, exosomale Biomarker für Bauchspeicheldrüsenkrebs im Frühstadium zu finden.
Derzeit erweitern wir diese Entdeckung auf andere Arten von Krebs und Infektionskrankheiten. In der Regel handelt es sich bei den bei diesem Test behandelten Proben entweder um Patientenproben oder um gereinigte exosomenproben aus Krebszelllinien, die ein spezielles Sicherheitstraining erfordern.
