Анализ экспрессии онкогенов с изменениями pH в линии протоковых клеток поджелудочной железы

В этом исследовании описан протокол изучения влияния измененного pH на экспрессию онкогена с помощью анализа РНК-секвенирования линии протоковых клеток поджелудочной железы.

Четвертая по значимости причина смертности, связанной с раком, протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), имеет 12% пятилетнюю выживаемость. Это заболевание имеет плохой прогноз и характеризуется жестким стромальным микроокружением, что представляет собой ощутимую проблему в его лечении. Пациенты с хроническим панкреатитом имеют в 10 раз больший риск развития PDAC; У этих пациентов рН протоков снижается с рН 8,0 до рН 6,0 из-за недостаточности бикарбоната и воспалительной среды. Наша цель состояла в том, чтобы понять роль кислой среды, наблюдаемой при хроническом панкреатите, на экспрессию онкогенов в линии протоковых клеток поджелудочной железы.

Таким образом, 80% сливающихся эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы человека инкубировали при pH от 6,0 до pH 7,2 в течение 6 ч. Общая РНК из клеток была обработана для обогащения общей мРНК в образцах. Экспрессия генов оценивалась с помощью секвенирования нового поколения (NGS) биологических репликатов. С помощью онлайн-инструмента был проведен анализ РНК-секвенирования и идентифицированы дифференциально экспрессируемые гены (ФК < ± 2.0); было 90, 148 и 109 повышенных генов и 20, 14 и 23 пониженных гена при pH 6,0, 6,5 и 7,0 соответственно. Четыре онкогена были повышены при pH 6,0, семь — при pH 6,5 и семь — при pH 7,0. Общими генами, которые были повышены при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0, были специфичный для клеток лимфоцитов белоктирозинкиназа (LCK) [pH 6,0, FC: 2,93; pH 6,5, FC: 2,93; pH 7,0, FC: 3,32], протоонкоген FGR, тирозинкиназа семейства Src (FGR) [pH 6,0, FC: 4,17; pH 6,5, FC: 5,25; pH 7,0, FC: 5,09], и ArfGAP с доменом SH3, анкириновый повтор и домен PH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. Кислая среда вызывает активацию протоонкогенов, что может спровоцировать начало образования опухоли при хроническом панкреатите.

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из основных видов рака и занимает четвертое место среди онкологических заболеваний по количеству связанных смертей¹. Более высокий уровень смертности очевиден среди пациентов с PDAC, и, согласно последним исследованиям, пятилетняя выживаемость составляет всего 12%. Пациенты с документально подтвержденным хроническим панкреатитом, заболеванием, приводящим к воспалению поджелудочной железы², более склонны (примерно в 15-16 раз) к развитию PDAC³. Существуют различные типы ЦП с разной этиологией, такие как алкогольный, наследственный и идиопатический ЦП⁴. Известно, что состояния, которые существуют во время ДЦП, приводят к образованию кальцинированных камней, развитию раковых клеток и даже диабету. Распространенность PDAC высока у пациентов с наследственным хроническим панкреатитом⁵.

Некоторые физиологические состояния поджелудочной железы у пациентов с ДЦП могут быть полезны для возникновения других заболеваний; к ним относятся воспалительная среда, активные пищеварительные ферменты и кислый pH панкреатического сока⁶. В области воспаления проводится широкий спектр исследований, так как воспаление создает хаос в нормальном функционировании органа ^7,8,9. Тем не менее, дисбаланс в регуляции pH является еще одним явлением, которое может вызвать начало неконтролируемого^{роста клеток.} Сок поджелудочной железы здоровых людей является щелочным, что помогает нейтрализовать кислый химус, вырабатываемый желудком. Напротив, сок поджелудочной железы остается кислым у пациентов с ДЦП из-за недостаточной секреции бикарбоната. Низкий уровень бикарбоната не может полностью нейтрализовать сок, что приводит к образованию слабокислой среды внутри протока¹¹.

Более ранние исследования показывают, что раковые клетки адаптируются к кислой среде и процветают в ней¹². В таких случаях условия, существующие в процессе хронического панкреатита, предполагают благоприятную среду для пролиферации и метастазирования этих клеток¹³. Таким образом, наше исследование было направлено на оценку морфологических изменений в протоковых клетках поджелудочной железы человека и оценку экспрессии онкогенов в слабокислых условиях.

1. Возрождение клеточной линии

1. Получить нормальную линию протоковых клеток поджелудочной железы человека (HPDEC/H6C7) и оживить клетки в свежей среде.
   1. Разморозьте ячейки при 37 °C на водяной бане.
   2. Свежеприготовленную готовую среду и процедите ее с помощью шприцевого фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовая среда содержит модифицированную среду Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
   3. Добавьте 6 мл готовой среды в свежую коническую пробирку объемом 15 мл, добавьте размороженную клеточную суспензию и тщательно перемешайте.
   4. Центрифугируйте суспензию при 1 800 × г в течение 6 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в гранулу 1 мл питательной среды и аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда содержит DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пен/стрептококковыми антибиотиками.
   5. Добавьте клетки по каплям в колбу Т-25, содержащую 4 мл питательной среды, и инкубируйте при 37 °С, 5%_СО2.

2. Изменение рН питательной среды

1. Приготовьте 100 мл 0,5 М буферных растворов фосфата натрия со значениями pH 6,0, 6,5 и 7,0, как указано в таблице 1.
2. Проверьте pH с помощью pH-метра и отрегулируйте его с помощью 1 N HCl/1 M NaOH.
3. Фильтруйте и стерилизуйте буферы в ламинарном колпаке с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
4. Питательные среды готовят со значениями рН 6,0, 6,5 и 7,0 путем добавления 20 мл стерильного 0,5 М буфера фосфата натрия с соответствующим рН к 80 мл питательной среды.
5. Добавьте среду с измененным pH к 85-90% сливающихся протоковых клеток поджелудочной железы человека и проверьте морфологические изменения под светлопольным микроскопом с интервалом в 1 ч в течение 6 ч.

3. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения РНК из клеток необходимо использовать стерильные перчатки, а поверхность должна быть обеззаражена с использованием 100% этанола.

1. Удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS).
2. Поставьте тарелку на лед, добавьте в лунку PBS, а затем соскребите ячейки скребком для клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного PBS должно быть достаточным для покрытия ячеек для скребка. Нет необходимости добавлять большой объем PBS.
3. Соберите суспензию в свежую пробирку и центрифугируйте ее при давлении 8 000 ×г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
4. Добавьте в гранулу буфер для лизиса, содержащий β-меркаптоэтанол, и пипеткой вверх и вниз в течение 5-10 минут на льду.
5. Добавьте в лизат равный объем 70% этанола и тщательно перемешайте. Не делайте вихрей.
6. Добавьте раствор в колонну с кремнеземной мембраной, центрифугируйте при >8 000 ×g в течение 30 с и сбросьте поток.
7. Добавьте промывочный буфер в образец и центрифугируйте при >8 000 ×г в течение 30 с. Центрифугируйте пустую пробирку в течение 1 минуты при >8 000 ×г.
8. Добавьте в колонку 30-50 μл воды, не содержащей нуклеаз, и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Центрифугируйте колонку при >8 000 ×g в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы РНК можно хранить при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

4. РНК-секвенирование/транскриптом

1. Оценка целостности РНК
   1. Проверьте целостность РНК в биоанализаторе, взяв 1 мкл (25-500 нг) и смешав его с 5 мкл буфера для красителя.
   2. Перемешайте раствор при давлении 500 ×g в течение 1 минуты и кратковременно вращайте.
   3. Запустите одноэтапную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для каждого образца при температуре 72 °C в течение 3 минут, а затем возьмите пробирки и инкубируйте их на льду в течение 2 минут перед анализом с помощью биоанализатора.
2. Обедненная рРНК
   1. Добавьте 5 г общей РНК, 50 мл буфера для гибридизации и 1-3 л смеси зондов в свежую пробирку для ПЦР.
   2. Выполните следующие этапы: первый этап, денатурация при 70 °C в течение 10 минут; второй этап, гибридизация при 37 °C в течение 20 мин; и инкубация при 37 °C до использования.
   3. В свежую пробирку добавьте 500 мкл магнитных шариков и образец; Поместите смесь на магнитную подставку на 1 минуту, пока раствор не станет прозрачным.
   4. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Извлеките тюбик, промойте шарики, добавив 500 μл воды, не содержащей нуклеаз, и поместите смесь обратно на магнитную подставку на 1 минуту. Удалите надосадочную жидкость, как только раствор станет прозрачным.
   5. Повторите процесс 5-7 раз. Добавьте 200 μL буфера для гибридизации и тщательно перемешайте. Держите пробирки при температуре 37 °C в течение 5 минут.
   6. Добавьте к вышеуказанной смеси 100 μL РНК-зонда, аккуратно перемешайте и инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 минут.
   7. Кратковременно покрутите трубку, прежде чем поместить ее на магнитную подставку на 1 минуту.
   8. Соберите прозрачную надосадочную жидкость, содержащую обедненную рРНК РНК, в свежую пробирку.
3. Фрагментация РНК
   1. В свежую пробирку для ПЦР добавьте 8-10 мкл обедненной рРНК общей РНК (500 нг/г), 1 мкл 10-кратного буфера и 1 мкл РНКазы III.
   2. Перемешайте раствор, постукивая и быстро вращая.
   3. Поместите пробирки в термоамплификатор на 10 минут при температуре 37 °C.
   4. В свежую пробирку добавьте 5 μL гранул, связывающих нуклеиновые кислоты, а затем добавьте 90 μL концентрата связующего раствора.
   5. Добавьте в указанную смесь 30 мкл фрагментов РНК и 150 мкл 100% этанола. Перемешайте образец с помощью пипетирования 10 раз и инкубируйте его в течение 5 минут при комнатной температуре.
   6. Поместите пробирки на магнитную подставку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   7. Промойте шарики 150 μл этанола, пока трубки находятся на магнитной подставке; Дайте смеси постоять 30 секунд, а затем удалите надосадочную жидкость.
   8. Оставьте пробирки на магнитной подставке на 1-2 минуты, чтобы оставшийся этанол испарился.
   9. Добавьте в гранулы 12 мкл предварительно подогретой воды, не содержащей нуклеаз, и перемешайте образец пипетированием 10 раз.
   10. Инкубируйте образец в течение 1 минуты при комнатной температуре. Поместите трубки на магнитную подставку и соберите надосадочную жидкость, как только она станет прозрачной.
4. Подготовка библиотеки и кДНК
   1. Добавьте 3 мкл фрагментированного образца РНК в ПЦР-пробирку, а затем добавьте 5 мкл гибридизационной смеси. Перемешайте образец с помощью пипетирования несколько раз, а затем кратковременно открутите образец.
   2. Держите пробирки в термоамплификаторе в течение 10 минут при температуре 65 °C, а затем 5 минут при 30 °C.
   3. Добавьте в указанный раствор 10 μл буфера для лигирования и 2 μл смеси ферментов лигирования. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе в течение 1 ч при 30 °C.
   4. Добавьте мастер-смесь обратной транскриптазы в смесь для лигирования и инкубируйте при 70 °C в течение 10 мин с последующей инкубацией на льду.
5. Амплификация кДНК
   1. Добавьте 6 мкл кДНК (500 нг) в свежую ПЦР-пробирку, а затем добавьте 46 мкл смеси для ПЦР со штрих-кодом из пробирки, содержащей 46 мкл высокоточного фермента полимеразы и 1 мкл 3'-праймеров со штрих-кодом.
   2. Установите следующие условия ПЦР: первый этап, держать при температуре 94 °C в течение 2 минут; вторая ступень - циклы при 94°С в течение 30 с и 50°С в течение 30 с; третья ступень, 16 циклов при 94 °C в течение 30 с, 62 °C в течение 30 с и 68 °C в течение 30 с. Держите реакцию при температуре 68 °C в течение 5 минут.
   3. Очистите амплифицированную кДНК путем повторения этапов с 4.3.5 по 4.3.10 и замените фрагментированный образец РНК продуктом ПЦР, полученным на предыдущем этапе.
   4. Проанализируйте очищенный образец РНК на секвенсоре (NGS) для генерации данных в виде файлов FASTq.

5. Биоинформатика

1. Откройте доступный в Интернете инструмент «Галактика», скопировав и вставив ссылку: https://usegalaxy.org во вкладку поиска браузера.
2. При первом посещении этого сайта зарегистрируйтесь для получения профиля, нажав на кнопку входа или опцию регистрации в правом верхнем углу.
3. После создания учетной записи войдите в учетную запись, заполнив публичное имя/логин и пароль.
4. Загрузите файлы FASTq, полученные после анализа РНК-секвенирования, нажав на опцию загрузки на левой боковой панели.
5. Выберите инструмент cutadapt в разделе инструментов на левой боковой панели. Этот инструмент будет обрезать некачественные последовательности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь этот файл можно использовать для сопоставления.
6. Нажмите на кнопку инструмента на левой боковой панели и найдите инструмент «Звезда РНК». Заполните детали следующим образом: Используйте выходной файл cutadapt, выберите референсный геном как референсный геном человека (hg38) и измените длину геномной последовательности вокруг аннотированных соединений на 36. Выберите выходные данные в виде количества генов и нажмите на опцию «Запустить инструмент» в правом верхнем углу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент сгенерирует файл BAM.
7. Выберите инструмент featurecounts из опций инструмента и загрузите файлы BAM, полученные после анализа РНК-звезд. Установите минимальное качество сопоставления на чтение в параметрах фильтрации чтения на 10 и нажмите на опцию запустить инструмент в правом верхнем углу.
8. Откройте выходной файл featurecount на правой панели и скопируйте данные в электронную таблицу. Вычислите изменение свертки относительно элемента управления, разделив количество полученных в тесте счетчиков прочтений на количество прочитанных счетчиков, полученных в контроле с помощью команды =log (изменение свертки, 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение складки <-2.0 считается указанием на понижение регуляции, а изменение складки > 2.0 считается повышающей регуляцией.

Морфологические изменения
Инкубация протоковых клеток поджелудочной железы человека в кислой среде изменяла морфологию клеток. Слияние и плотно упакованный клеточный паттерн приводил к дисперсию клеток в кислых условиях, и клеточная гибель со временем становится заметной. По сравнению с нормальными клетками, содержащими среду, протоковые клетки уменьшались и уменьшались в размерах. Резкое изменение смертности наблюдалось после 6 ч инкубации. Через 24 ч количество клеток уменьшилось, и клетки, казалось, находились в напряженном состоянии (рис. 1, рис. 2 и рис. 3). Таким образом, инкубационный период продлевали до 6 ч в кислой среде перед дальнейшим анализом.

Анализ РНК-секвенирования
Исходные файлы транскриптома доступны на сайте Mendeley Data (https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1) с DOI: 10.17632/kd994sftcs.1. Данные NGS выявили в общей сложности 1389 генов при pH 6,0, 1346 генов при pH 6,5 и 1427 генов при pH 7,0 (дополнительная таблица S1). Когда учитывалось изменение кратности для нерегулируемых генов, количество повышенных генов составляло 90, 148 и 109 при pH 6,0, 6,5 и 7,0 соответственно. Кроме того, 20, 14 и 23 гена были подавлены при pH 6,0, 6,5 и 7,0 соответственно (рис. 4). Онкогены и гены-супрессоры опухолей, которые были повышены при различных уровнях pH, показаны в Таблице 2 и Таблице 3. Три онкогена, которые были повышены на всех трех уровнях pH (рис. 5), — это специфичный для клеток лимфоцитов белок-тирозинкиназа (LCK), протоонкоген FGR, тирозинкиназа семейства Src (FGR) и ArfGAP с доменом SH3, анкириновым повтором и доменом PH 3 (ASAP3). Известно, что LCK участвует в регуляции миграции опухолевых клеток и участвует в самообновлении раковых стволовых клеток¹⁴. Активация киназы семейства Src участвует в развитии и прогрессировании рака¹⁵. Было обнаружено, что сверхэкспрессия FGR связана с быстрым прогрессированием опухоли, что приводит к низким показателям выживаемости пациентов с такими видами рака, как лейкемия¹⁶, лимфома¹⁷ и мультиформная глиобластома¹⁸. Документально подтверждено, что ASAP3 играет роль в клеточной пролиферации гепатоцеллюлярной карциномы¹⁹ , а также в миграции и инвазии^{клеток20}.

Рисунок 1: Изображения с 10-кратным увеличением линии протоковых клеток поджелудочной железы человека, инкубированных при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0 с инкубацией в измененной среде в течение 0 ч, 1 ч и 2 ч. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Изображения с 10-кратным увеличением линии протоковых клеток поджелудочной железы человека, инкубированных при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0 с инкубацией в измененной среде в течение 3 ч, 4 ч и 5 ч. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изображения с 10-кратным увеличением линии протоковых клеток поджелудочной железы человека, инкубированные при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0 с инкубацией в измененной среде в течение 6 ч и 22 ч. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Гистограмма общего количества нерегулируемых генов при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0, отображающая общее количество повышенных и подавленных генов при соответствующих значениях pH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Диаграмма Венна, представляющая общий онкоген, определенный при pH 6,0, 6,5 и 7,0. Было обнаружено, что онкогены, которые обычно активируются при всех значениях pH, были LCK, FGR и ASAP3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Буферный состав фосфата натрия.

Таблица 2: Список онкогенов, активизированных при различных значениях pH и кратном изменении гена.

Таблица 3: Список генов-супрессоров опухолей, активизированных при различных значениях pH и кратном изменении гена.

Дополнительная таблица S1: Повышающая и понижающая регуляция генов при pH 6 против 7,2, pH 6,5 против 7,2 и pH 7 против pH 7,2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Этот метод был разработан для определения влияния кислотных условий на доброкачественные эпителиальные клетки протоков поджелудочной железы человека в биологических повторах. Изменение рН среды приводило к тому, что клетки находились в стрессовом состоянии, и наблюдалось изменение морфологии. Клетки культивировали при pH 6,0, 6,5 или 7,0 в течение 24 ч и контролировали каждый час для оптимизации инкубационного периода для дальнейших экспериментов. Мы наблюдали изменение морфологии через 4 ч инкубации, а уровень смертности клеток увеличивался после 6 ч инкубации при кислом pH. Поэтому мы инкубировали клетки в течение 6 часов, прежде чем приступить к анализу экспрессии генов.

Дифференциально экспрессируемые гены (DEGs) с log2-кратным изменением продемонстрировали влияние кислого pH на экспрессию генов протоковых клеток. Повышенная экспрессия онкогенов LCK, FGR и ASAP3 продемонстрировала влияние кислого pH на экспрессию генов эпителиальных клеток протоков. Нарушение регуляции экспрессии онкогена и генов-супрессоров опухолей в условиях кислого pH указывает на то, что pH может играть роль в инициации опухоли в условиях воспаления ^7,8.

Критическим этапом в этом методе является время инкубации протоковых клеток при кислом рН, поскольку, в отличие от раковых клеток, нераковые клетки восприимчивы к изменениям условий культивирования, что становится ограничивающим фактором для проведения экспериментов с длительными инкубационными^{периодами}. Ограничением данного исследования является то, что мы использовали линию протоковых клеток поджелудочной железы человека. Несмотря на это ограничение, мы оценили изменения в экспрессии генов в условиях кислого pH, чтобы имитировать хронический панкреатит.

Основным недостатком в лечении рака является микроокружение и строма, которые развиваются в процессе рака. Противоопухолевые препараты обладают способностью убивать раковые клетки, но не вторгаются в микроокружение, что приводит к низкой эффективности лекарств. Одним из факторов микроокружения при любом раке является кислотное состояние, которое индуцируется во время метаболизма и прогрессирования^рака. С помощью этого метода можно оценить изменения в поведении клеток и эффективность лекарств против определенного типа рака. Экспрессия генов может быть оценена с помощью секвенирования нового поколения, а также могут быть определены потенциальные мишени для лекарств.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Ренука Гаудшелвар благодарна DBT за предоставленную ей стипендию. Ренука Гаудшелвар выражает признательность за помощь, полученную от факультета биохимии Университета Османии (Хайдарабад) и доктору В. В. Равиканту за его руководство при анализе данных NGS. Д-р М. Сасикала выражает признательность за финансовую помощь, полученную от ICMR, Министерства здравоохранения, правительства Индии (грант No-94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).