Análise da Expressão de Oncogenes com Alterações no pH em uma Linhagem Celular Ductal Pancreática

Este estudo descreve um protocolo para explorar os efeitos do pH alterado na expressão de oncogenes por meio da análise de RNA-seq de uma linhagem de células ductais pancreáticas.

A quarta principal causa de morte relacionada ao câncer, o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), tem uma taxa de sobrevida de 12% em cinco anos. Esta doença tem um prognóstico ruim e é caracterizada por um microambiente estromal rígido, o que representa um desafio tangível em seu tratamento. Pacientes com pancreatite crônica têm um risco 10 vezes maior de desenvolver PDAC; nesses pacientes, o pH ductal diminui de pH 8,0 para pH 6,0 devido à insuficiência de bicarbonato e ao meio inflamatório. Nosso objetivo foi entender o papel do ambiente ácido observado na pancreatite crônica na expressão de oncogenes em uma linhagem de células ductais pancreáticas.

Portanto, 80% de células epiteliais ductais pancreáticas humanas confluentes foram incubadas em pH 6,0 a pH 7,2 por 6 h. O RNA total das células foi processado para enriquecer o mRNA total nas amostras. A expressão gênica foi avaliada por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) de réplicas biológicas. A análise de RNA-seq foi realizada com o auxílio de uma ferramenta online, e os genes diferencialmente expressos (FCs < ± 2.0) foram identificados; havia 90, 148 e 109 genes regulados positivamente e 20, 14 e 23 genes regulados negativamente em pH 6,0, 6,5 e 7,0, respectivamente. Quatro oncogenes foram regulados positivamente em pH 6,0, sete foram regulados positivamente em pH 6,5 e sete foram regulados positivamente em pH 7,0. Os genes comuns que foram regulados positivamente em pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 foram proteína tirosina quinase (LCK) específica para células de linfócitos [pH 6,0, FC: 2,93; pH 6,5, FC: 2,93; pH 7,0, FC: 3,32], proto-oncogene FGR, tirosina quinase da família Src (FGR) [pH 6,0, FC: 4,17; pH 6,5, FC: 5,25; pH 7,0, FC: 5,09] e ArfGAP com domínio SH3, repetição de anquirina e domínio PH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. O ambiente ácido desencadeia a ativação de proto-oncogenes, que podem desencadear a iniciação do tumor na pancreatite crônica.

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um dos primecancros e ocupa o quarto lugar entre os cânceres em termos de número de mortes relacionadas¹. Uma taxa de mortalidade mais alta é evidente entre os pacientes com PDAC e, de acordo com estudos recentes, a taxa de sobrevida em cinco anos é de apenas 12%. Pacientes com pancreatite crônica documentada, uma doença que resulta em inflamação do pâncreas², têm maior probabilidade (aproximadamente 15-16 vezes) de desenvolver PDAC³. Existem vários tipos de PC com diferentes etiologias, como a PC relacionada ao álcool, hereditária e idiopática⁴. Sabe-se que as condições que existem durante a PC levam à formação de cálculos calcificados, ao desenvolvimento de células cancerígenas e até mesmo ao diabetes. A prevalência de PDAC é alta em pacientes com pancreatite crônica hereditária⁵.

Algumas condições fisiológicas no pâncreas de pacientes com PC podem ser benéficas para o início de outras doenças; estes incluem o meio inflamatório, enzimas digestivas ativas e o pH ácido do suco pancreático⁶. Uma ampla gama de estudos está sendo realizada na área da inflamação, pois a inflamação cria caos no funcionamento normal do órgão ^7,8,9. No entanto, um desequilíbrio na regulação do pH é outro fenômeno que pode desencadear o início do crescimento descontrolado das células¹⁰. O suco pancreático de indivíduos saudáveis é alcalino, o que ajuda a neutralizar o quimo ácido produzido pelo estômago. Em contraste, o suco pancreático permanece ácido em pacientes com PC devido à secreção insuficiente de bicarbonato. Baixos níveis de bicarbonato não podem neutralizar completamente o suco, o que resulta em um ambiente levemente ácido dentro do ducto¹¹.

Estudos anteriores indicam que as células cancerígenas se adaptam e prosperam em ambientes ácidos¹². Nesses casos, as condições existentes durante o processo de pancreatite crônica sugerem um ambiente favorável para a proliferação e metástase dessas células¹³. Assim, nosso estudo teve como objetivo avaliar as alterações morfológicas nas células ductais pancreáticas humanas e avaliar a expressão de oncogenes em condições levemente ácidas.

1. Renascimento da linha celular

1. Adquira a linha de células ductais pancreáticas normais humanas (HPDEC / H6C7) e reviva as células em meio fresco.
   1. Descongelar as células a 37 °C em banho-maria.
   2. Prepare o meio completo e filtre-o usando um filtro de seringa.
      NOTA: O meio completo contém meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
   3. Adicione 6 mL do meio completo a um tubo cônico novo de 15 mL, adicione a suspensão de células descongeladas e misture bem.
   4. Centrifugue a suspensão a 1.800 × g por 6 min. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de meio de cultura ao pellet e misture delicadamente.
      NOTA: O meio de cultura contém DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibióticos caneta/estreptococos.
   5. Adicionar as células gota a gota a um balão T-25 contendo 4 ml de meio de cultura e incubar a 37 °C, 5% de CO₂.

2. Alterando o pH do meio de cultura

1. Prepare 100 mL de soluções de estoque tampão de fosfato de sódio 0,5 M com valores de pH de 6,0, 6,5 e 7,0, conforme mencionado na Tabela 1.
2. Verifique o pH com um medidor de pH e ajuste-o usando 1 N HCl/1 M NaOH.
3. Filtre e esterilize os tampões em uma capela de fluxo de ar laminar com um filtro de seringa de 0,45 μm.
   NOTA: O tampão pode ser armazenado a 4 °C até nova utilização.
4. Prepare meios de cultura com valores de pH de 6,0, 6,5 e 7,0 adicionando 20 mL de tampão fosfato de sódio estéril 0,5 M com o respectivo pH a 80 mL de meio de cultura.
5. Adicione o meio com o pH alterado a 85-90% de células ductais pancreáticas humanas confluentes e verifique as alterações morfológicas em um microscópio de campo claro em intervalos de 1 h por 6 h.

3. Isolamento de RNA

NOTA: Luvas estéreis devem ser usadas para isolamento de RNA das células e a superfície deve ser descontaminada com etanol 100%.

1. Remova o meio de cultura e enxágue as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Coloque a placa no gelo, adicione PBS ao poço e, em seguida, raspe as células com um raspador de células.
   NOTA: A quantidade de PBS adicionada deve ser suficiente para cobrir as células para raspagem. Não há necessidade de adicionar um grande volume de PBS.
3. Recolha a suspensão num tubo novo e centrifugue a 8.000 ×g durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
4. Adicione tampão de lise contendo β-mercaptoetanol ao pellet e pipete-o para cima e para baixo por 5-10 min no gelo.
5. Adicione um volume igual de etanol a 70% ao lisado e misture bem. Não vórtice.
6. Adicionar a solução à coluna de membrana de sílica, centrifugar a >8 000 × g durante 30 s e rejeitar o fluxo.
7. Adicione tampão de lavagem à amostra e centrifugue a >8.000 ×g por 30 s. Centrifugue o tubo vazio por 1 min a >8.000 ×g.
8. Adicione 30-50 μL de água livre de nuclease à coluna e deixe por 5 min em temperatura ambiente. Centrifugue a coluna a >8.000 ×g por 5 min.
   NOTA: As amostras de RNA podem ser armazenadas a -20 °C até uso posterior.

4. RNA-seq/transcriptoma

1. Avaliação da integridade do RNA
   1. Verifique a integridade do RNA em um bioanalisador tomando 1 μL (25-500 ng) e misturando-o com 5 μL de tampão de corante.
   2. Vortex a solução a 500 ×g por 1 min e gire brevemente.
   3. Execute uma reação em cadeia da polimerase (PCR) de uma etapa para cada amostra a 72 ° C por 3 min e, em seguida, pegue os tubos e incube-os no gelo por 2 min antes da análise com um bioanalisador.
2. RNA total depletado de rRNA
   1. Adicione 5 μg de RNA total, 50 μL de tampão de hibridização e 1-3 μL de mistura de sonda a um novo tubo de PCR.
   2. Execute as seguintes etapas: primeiro passo, desnaturação a 70 °C por 10 min; segunda etapa, hibridização a 37 °C por 20 min; e incubação a 37 °C até o uso.
   3. Em um tubo novo, adicione 500 μL de esferas magnéticas e a amostra; Coloque a mistura em um suporte magnético por 1 min até que a solução fique límpida.
   4. Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo, lave as esferas adicionando 500 μL de água livre de nuclease e coloque a mistura de volta no suporte magnético por 1 min. Remover o sobrenadante assim que a solução estiver límpida.
   5. Repita o processo 5-7x. Adicione 200 μL de tampão de hibridização e misture corretamente. Mantenha os tubos a 37 °C durante 5 min.
   6. Adicione 100 μL de sonda de RNA à mistura acima, misture suavemente e incube a mistura a 37 °C por 15 min.
   7. Gire brevemente o tubo antes de colocá-lo no suporte magnético por 1 min.
   8. Colete o sobrenadante claro contendo o RNA empobrecido de rRNA em um tubo novo.
3. Fragmentação de RNA
   1. Em um tubo de PCR novo, adicione 8-10 μL de RNA total empobrecido de rRNA (500 ng/g), 1 μL de tampão 10x e 1 μL de RNase III.
   2. Misture a solução batendo e girando brevemente.
   3. Coloque os tubos em um termociclador por 10 min a 37 °C.
   4. Em um tubo novo, adicione 5 μL de grânulos de ligação de ácidos nucleicos e, em seguida, adicione 90 μL de concentrado de solução de ligação.
   5. Adicione 30 μL dos fragmentos de RNA e 150 μL de etanol 100% à mistura acima. Misture a amostra pipetando 10x e incube-a por 5 min em temperatura ambiente.
   6. Coloque os tubos no suporte magnético até que a solução fique límpida. Remova e descarte o sobrenadante.
   7. Lave as esferas com 150 μL de etanol enquanto os tubos estão em um suporte magnético; Deixe a mistura repousar por 30 segundos e depois remova o sobrenadante.
   8. Deixe os tubos em um suporte magnético por 1-2 min para permitir que o etanol restante evapore.
   9. Adicione 12 μL de água livre de nuclease pré-aquecida às esferas e misture a amostra pipetando 10 vezes.
   10. Incubar a amostra por 1 min em temperatura ambiente. Coloque os tubos em um suporte magnético e colete o sobrenadante assim que estiver claro.
4. Preparação da biblioteca e preparação do cDNA
   1. Adicione 3 μL da amostra de RNA fragmentada a um tubo de PCR e, em seguida, adicione 5 μL de mistura de hibridização. Misture a amostra pipetando algumas vezes e, em seguida, gire brevemente a amostra.
   2. Mantenha os tubos em um termociclador por 10 min a 65 °C, seguido de 5 min a 30 °C.
   3. Adicione 10 μL de tampão de ligação e 2 μL de mistura de enzimas de ligação à solução acima. Incubar a reação em um termociclador por 1 h a 30 °C.
   4. Adicionar a mistura principal da transcriptase reversa à mistura de ligação e incubar a 70 °C durante 10 min, seguida de incubação em gelo.
5. Amplificação do cDNA
   1. Adicione 6 μL de cDNA (500 ng) a um novo tubo de PCR e, em seguida, adicione 46 μL de mistura de PCR com código de barras de um tubo contendo 46 μL de enzima polimerase de alta fidelidade e 1 μL de primers de código de barras 3'.
   2. Defina as condições de PCR da seguinte forma: primeiro estágio, manter a 94 °C por 2 min; segundo estágio, ciclos a 94 °C por 30 s e 50 °C por 30 s; terceiro estágio, 16 ciclos a 94 ° C por 30 s, 62 ° C por 30 s e 68 ° C por 30 s. Mantenha a reação a 68 °C por 5 min.
   3. Purificar o ADN amplificado repetindo os passos 4.3.5 a 4.3.10 e substituir a amostra de ARN fragmentada pelo produto da PCR obtido no passo anterior.
   4. Analise a amostra de RNA purificada em um sequenciador (NGS) para gerar dados na forma de arquivos FASTq.

5. Bioinformática

1. Abra a ferramenta galaxy disponível online copiando e colando o link: https://usegalaxy.org na guia de pesquisa do navegador.
2. Na primeira visita a este site, registre-se para um perfil clicando no login ou na opção de registro no canto superior direito.
3. Depois de criar uma conta, faça login na conta preenchendo o nome/nome de usuário público e senha.
4. Carregue os arquivos FASTq obtidos após a análise de RNA-seq clicando na opção de upload no painel do lado esquerdo.
5. Selecione a ferramenta cutadapt na seção de ferramentas no painel do lado esquerdo. Esta ferramenta cortará sequências de baixa qualidade.
   NOTA: Este arquivo agora pode ser usado para mapeamento.
6. Clique no botão da ferramenta no painel do lado esquerdo e procure a ferramenta RNA star. Preencha os detalhes da seguinte forma: Use o arquivo de saída do cutadapt, selecione o genoma de referência como genoma de referência humano (hg38) e altere o comprimento da sequência genômica em torno das junções anotadas para 36. Selecione a saída como contagem de genes e clique na opção de ferramenta de execução no canto superior direito.
   NOTA: Esta ferramenta irá gerar um arquivo BAM.
7. Selecione a ferramenta featurecounts nas opções da ferramenta e carregue os arquivos BAM obtidos após a análise de estrelas de RNA. Defina a qualidade mínima de mapeamento por opção de leitura nas opções de filtragem de leitura como 10 e clique na opção de ferramenta de execução no canto superior direito.
8. Abra o arquivo de saída de contagem de recursos no painel direito e copie os dados em uma planilha. Calcule a mudança de dobra em relação ao controle dividindo o número de contagens de leitura obtidas no teste pelo número de contagens de leitura obtidas no controle com o comando =log (mudança de dobra, 2).
   NOTA: Uma mudança de dobra <-2.0 é considerada como indicando regulação negativa e uma alteração de dobra > 2.0 é considerada regulação positiva.

Alterações morfológicas
A incubação de células ductais pancreáticas humanas em meio ácido alterou a morfologia das células. Um padrão celular confluente e compactado resultou em células dispersas sob condições ácidas, e a morte celular torna-se proeminente com o tempo. Em comparação com as células normais contendo meio, as células ductais encolheram e diminuíram de tamanho. Uma mudança drástica na taxa de mortalidade foi observada após 6 h de incubação. Após 24 h, o número de células diminuiu e as células pareciam estar em um estado de estresse (Figura 1, Figura 2 e Figura 3). Assim, o período de incubação foi prolongado para 6 h em meio ácido antes de uma análise mais aprofundada.

Análise de RNA-seq
Os arquivos brutos do transcriptoma estão disponíveis no Mendeley Data (https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1) com DOI: 10.17632/kd994sftcs.1. Os dados do NGS revelaram um total de 1.389 genes em pH 6,0, 1.346 genes em pH 6,5 e 1.427 genes em pH 7,0 (Tabela Suplementar S1). Quando a mudança de dobra foi considerada para genes desregulados, o número de genes regulados positivamente foi 90, 148 e 109 em pH 6,0, 6,5 e 7,0, respectivamente. Além disso, 20, 14 e 23 genes foram regulados negativamente em pH 6,0, 6,5 e 7,0, respectivamente (Figura 4). Oncogenes e genes supressores de tumor que foram regulados positivamente em vários níveis de pH são mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3. Os três oncogenes que foram regulados positivamente em todos os três níveis de pH (Figura 5) são proteína tirosina quinase específica de células linfocitárias (LCK), proto-oncogene FGR, tirosina quinase da família Src (FGR) e ArfGAP com domínio SH3, repetição de anquirina e domínio PH 3 (ASAP3). Sabe-se que a LCK está envolvida na regulação da migração de células tumorais e na auto-renovação das células-tronco cancerígenas¹⁴. A ativação da quinase da família Src está envolvida no desenvolvimento e progressão do câncer¹⁵. A superexpressão de FGR foi encontrada em associação com a rápida progressão tumoral, resultando em baixas taxas de sobrevida de pacientes com cânceres como leucemia¹⁶, linfoma¹⁷ e glioblastoma multiforme¹⁸. Está documentado que o ASAP3 tem um papel na proliferação celular do carcinoma hepatocelular¹⁹ , juntamente com a migração e invasão celular²⁰.

Figura 1: Imagens de ampliação de 10x da linhagem de células ductais pancreáticas humanas incubadas em pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 com incubação em meio alterado por 0 h, 1 h e 2 h. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Imagens de ampliação de 10x da linha de células ductais pancreáticas humanas incubadas em pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 com incubação em meio alterado por 3 h, 4 h e 5 h. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Imagens de ampliação de 10x da linha de células ductais pancreáticas humanas incubadas em pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 com incubação em meio alterado por 6 h e 22 h. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Gráfico de barras do total de genes desregulados em pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 representando o número total de genes regulados positivamente e negativamente nos respectivos valores de pH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Diagrama de Venn representando o oncogene comum determinado em pH 6,0, 6,5 e 7,0. Os oncogenes que foram comumente regulados positivamente em todos os valores de pH foram LCK, FGR e ASAP3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quadro 1: Composição do depósito regulador de fosfato de sódio.

Tabela 2: Lista de oncogenes regulados positivamente em diferentes valores de pH e mudança de dobra do gene.

Tabela 3: Lista dos genes supressores de tumor regulados positivamente em diferentes valores de pH e mudança de dobra do gene.

Tabela Suplementar S1: Genes regulados para cima e para baixo em pH 6 versus 7,2, pH 6,5 versus 7,2 e pH 7 versus pH 7,2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Este método foi desenvolvido para determinar os efeitos de condições ácidas em células epiteliais ductais pancreáticas humanas não cancerosas em repetições biológicas. Uma mudança no pH do meio fez com que as células ficassem em um estado de estresse e uma mudança na morfologia foi observada. As células foram cultivadas em pH 6,0, 6,5 ou 7,0 por 24 h e monitoradas a cada hora para otimizar o período de incubação para novos experimentos. Observamos uma mudança na morfologia após 4 h de incubação, e a taxa de mortalidade celular aumentou após 6 h de incubação em pH ácido. Portanto, incubamos as células por 6 h antes de prosseguir com a análise da expressão gênica.

Genes diferencialmente expressos (DEGs) com alteração de log2 vezes demonstraram os efeitos do pH ácido na expressão gênica das células ductais. O aumento da expressão dos oncogenes LCK, FGR e ASAP3 demonstrou a influência do pH ácido na expressão gênica das células epiteliais ductais. A desregulação da expressão do gene oncogênico e supressor de tumor em condições de pH ácido indica que o pH pode desempenhar um papel na iniciação do tumor em condições inflamatórias ^7,8.

A etapa crítica desse método é o tempo de incubação das células ductais em pH ácido, pois, ao contrário das células cancerígenas, as células não cancerígenas são suscetíveis a mudanças nas condições de cultivo, o que se torna um fator limitante para a realização de experimentos com longos períodos de incubação¹². Uma limitação deste estudo é que usamos uma linha de células ductais pancreáticas humanas. Apesar dessa limitação, avaliamos alterações na expressão gênica em condições de pH ácido para mimetizar a pancreatite crônica.

A principal desvantagem no tratamento do câncer é o microambiente e o estroma que se desenvolvem durante o curso do câncer. Os medicamentos anticancerígenos têm a capacidade de matar as células cancerígenas, mas não conseguem invadir o microambiente, resultando em baixa eficácia do medicamento. Um dos fatores microambientais em qualquer câncer é a condição ácida que é induzida durante o metabolismo e progressão do câncer²⁰. As alterações no comportamento celular e a eficácia do medicamento contra um determinado tipo de câncer podem ser avaliadas por meio desse método. A expressão gênica pode ser avaliada por sequenciamento de próxima geração e potenciais alvos de medicamentos podem ser identificados.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Renuka Goudshelwar é grata ao DBT por lhe fornecer a bolsa. Renuka Goudshelwar agradece a ajuda recebida do Departamento de Bioquímica da Universidade de Osmania (Hyderabad) e do Dr. V. V. Ravikanth por sua orientação durante a análise dos dados do NGS. O Dr. M. Sasikala agradece a assistência financeira recebida do ICMR, Ministério da Saúde, Governo da Índia (Concessão nº 94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).