췌장 관 세포주에서 pH 변화를 이용한 종양유전자 발현 분석

이 연구는 췌관 세포주의 RNA-seq 분석을 통해 변경된 pH가 종양유전자 발현에 미치는 영향을 조사하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

암 관련 사망의 네 번째 주요 원인인 췌관 선암종(PDAC)은 5년 생존율이 12%입니다. 이 질병은 예후가 좋지 않으며 경직된 기질 미세환경이 특징이며, 이는 치료에 있어 실질적인 도전을 나타냅니다. 만성 췌장염 환자는 PDAC 발병 위험이 10배 더 높습니다. 이러한 환자의 경우 중탄산염 부족과 염증성 환경으로 인해 덕트 pH가 pH 8.0에서 pH 6.0으로 감소합니다. 우리의 목표는 만성 췌장염에서 관찰되는 산성 환경이 췌관 세포주에서 종양유전자 발현에 미치는 역할을 이해하는 것이었습니다.

따라서 80%의 인간 췌관 상피 세포가 합류하여 pH 6.0에서 pH 7.2에서 6시간 동안 배양했습니다. 세포로부터의 총 RNA를 처리하여 샘플의 총 mRNA를 농축했습니다. 유전자 발현은 생물학적 복제물의 차세대 염기서열분석(NGS)을 통해 평가되었습니다. RNA-seq 분석은 온라인 도구의 도움으로 수행되었으며 차등적으로 발현된 유전자(FC < ± 2.0)가 확인되었습니다. pH 6.0, 6.5, 7.0에서 각각 90개, 148개, 109개의 상향조절유전자와 20개, 14, 23개의 하향조절유전자가 있었다. 4개의 종양유전자는 pH 6.0에서, 7개는 pH 6.5에서, 7개는 pH 7.0에서 상향 조절되었습니다. pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0에서 상향 조절된 공통 유전자는 림프구 세포 특이적 단백질-티로신 키나아제(LCK)[pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], FGR 원발암유전자, Src 패밀리 티로신 키나아제(FGR)[pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09] 및 SH3 도메인이 있는 ArfGAP입니다. 안키린 반복 및 PH 도메인 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC : 2.37; pH 6.5, FC : 3.84; pH 7.0, FC : 2.51]. 산성 환경은 원발암유전자(proto-oncogenes)의 활성화를 유발하며, 이는 만성 췌장염에서 종양 시작을 유발할 수 있습니다.

췌관 선암종(PDAC)은 원시암 중 하나이며 관련 사망 건수¹에서 암 중 4위를 차지합니다. PDAC 환자의 사망률이 더 높은 것은 분명하며, 최근 연구에 따르면 5년 생존율은 12%에 불과합니다. 췌장에 염증을 일으키는 질환인 만성 췌장염(chronic pancreatitis)이 있는 것으로 기록된 환자는 PDAC²가 발병할 가능성이 약 15-16배 더 높다(약 15-16배). 알코올 관련, 유전성 및 특발성 CP⁴와 같이 다양한 병인을 가진 다양한 유형의 CP가 있습니다. 뇌성마비 중에 존재하는 조건은 석회화된 결석의 형성, 암세포 발달, 심지어 당뇨병으로 이어지는 것으로 알려져 있습니다. PDAC의 유병률은 유전성 만성 췌장염 환자에서 높다⁵.

CP 환자의 췌장 내의 일부 생리적 상태는 다른 질병의 시작에 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 염증성 환경, 활성 소화 효소 및 췌장액의 산성 pH가 포함됩니다⁶. 염증은 기관의 정상적인 기능에 혼란을 일으키기 때문에 염증 분야에 대한 광범위한 연구가 수행되고 있습니다 ^7,8,9. 그러나, pH 조절의 불균형은 세포의 통제되지 않은 성장의 시작을 유발할 수 있는 또 다른 현상입니다¹⁰. 건강한 사람의 췌장액은 알칼리성으로 위에서 생성되는 산성 유액을 중화하는 데 도움이 됩니다. 대조적으로, 췌장액은 CP 환자에서 불충분한 중탄산염 분비로 인해 산성으로 남아 있습니다. 낮은 수준의 중탄산염은 주스를 완전히 중화할 수 없으며, 이로 인해 덕트¹¹ 내에서 약산성 환경이 생성됩니다.

이전 연구에서는 암세포가 산성 환경에 적응하고 번성하는 것으로 나타났습니다¹². 이러한 경우, 만성 췌장염 과정에서 존재하는 질환은 이러한 세포의 증식과 전이에 유리한 환경을 암시한다¹³. 따라서 본 연구는 인간 췌관 세포의 형태학적 변화를 평가하고 약산성 조건에서 종양유전자 발현을 평가하는 것을 목표로 했습니다.

1. 세포주의 부활

1. human normal pancreatic ductal cell line (HPDEC/ H6C7)을 확보하고 새로운 배지에서 세포를 되살립니다.
   1. 수조에서 37 ° C에서 셀을 해동합니다.
   2. 갓 완전한 매체를 준비하고 주사기 필터를 사용하여 걸러냅니다.
      참고: 완전한 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)가 포함되어 있습니다.
   3. 새로운 15mL 코니컬 튜브에 완전한 배지 6mL를 추가하고 해동된 세포 현탁액을 추가한 후 완전히 혼합합니다.
   4. 현탁액을 1,800×g에서 6 분 동안 원 심분리합니다. 상등액을 버리고 펠렛에 배양 배지 1mL를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
      참고: 배양 배지에는 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 펜/연쇄상구균 항생제가 함유된 DMEM이 포함되어 있습니다.
   5. 4mL의 배양 배지가 들어 있는 T-25 플라스크에 세포를 적가하고 37°C, 5% CO₂에서 배양합니다.

2. 배양액의 pH 변경

1. 표 1에 언급된 바와 같이 pH 값이 6.0, 6.5 및 7.0인 0.5M 인산나트륨 완충액 원료 용액 100mL를 준비합니다.
2. pH 측정기로 pH를 확인하고 1N HCl/1M NaOH를 사용하여 조정합니다.
3. 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 층류 후드의 버퍼를 필터 멸균합니다.
   알림: 버퍼는 더 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 80mL의 배양 배지에 해당 pH와 함께 20mL의 멸균 0.5M 인산나트륨 완충액을 첨가하여 pH 값이 6.0, 6.5 및 7.0인 배양 배지를 준비합니다.
5. pH가 변경된 배지를 85-90% 융합 인간 췌관 세포에 첨가하고 6시간 간격으로 1시간 간격으로 명시야 현미경으로 형태학적 변화를 확인합니다.

3. RNA 분리

참고: 세포에서 RNA를 분리하려면 멸균 장갑을 사용해야 하며 표면은 100% 에탄올을 사용하여 오염을 제거해야 합니다.

1. 배양 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 헹굽니다.
2. 플레이트를 얼음에 놓고 PBS를 우물에 첨가한 다음 셀 스크레이퍼로 세포를 긁어냅니다.
   알림: 추가된 PBS의 양은 긁어낼 셀을 덮을 수 있을 만큼 충분해야 합니다. 많은 양의 PBS를 추가할 필요가 없습니다.
3. 새 튜브에 현탁액을 넣고 8,000×g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
4. β-메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액을 펠릿에 추가하고 얼음 위에서 5-10분 동안 위아래로 피펫팅합니다.
5. 동일한 부피의 70% 에탄올을 용해물에 넣고 철저히 혼합합니다. 소용돌이치지 마십시오.
6. 용액을 실리카 멤브레인 컬럼에 추가하고 >8,000×g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 흐름을 버립니다.
7. 샘플에 세척 버퍼를 추가하고 >8,000 ×g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 빈 튜브를 >8,000 ×g으로 1분 동안 원심분리합니다.
8. 30-50μL의 뉴클레아제가 없는 물을 컬럼에 추가하고 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. >8,000×g 에서 5분 동안 컬럼을 원심분리합니다.
   참고: RNA 샘플은 나중에 사용할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

4. RNA 염기서열분석(RNA-seq)/전사체(Transcriptome)

1. RNA 무결성 평가
   1. 1 μL (25-500 ng)를 취하여 5 μL의 염료 완충액과 혼합하여 바이오분석기에서 RNA의 무결성을 확인합니다.
   2. 500×g 에서 용액을 1분 동안 소용돌이치고 잠시 회전합니다.
   3. 72°C에서 3분 동안 각 샘플에 대해 1단계 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실행한 다음 튜브를 가져다가 얼음에서 2분 동안 배양한 후 바이오분석기로 분석합니다.
2. rRNA가 고갈된 총 RNA
   1. 새 PCR 튜브에 총 RNA 5μg, 혼성화 완충액 50μL, 프로브 혼합물 1-3μL를 추가합니다.
   2. 다음 단계를 수행하십시오 : 첫 번째 단계, 70 ° C에서 10 분 동안 변성; 두 번째 단계, 37 °C에서 20 분 동안 혼성화; 사용할 때까지 37 °C에서 배양합니다.
   3. 새 튜브에 500μL의 마그네틱 비드와 샘플을 추가합니다. 용액이 투명해질 때까지 혼합물을 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓습니다.
   4. 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브를 제거하고 뉴클레아제가 없는 물 500μL를 추가하여 비드를 세척한 다음 혼합물을 마그네틱 스탠드에 다시 1분 동안 놓습니다. 용액이 투명해지면 상등액을 제거합니다.
   5. 이 과정을 5-7회 반복합니다. 200μL의 혼성화 완충액을 추가하고 적절하게 혼합합니다. 튜브를 37분 동안 5°C로 유지합니다.
   6. 위의 혼합물에 100μL의 RNA 프로브를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 37°C에서 15분 동안 혼합물을 배양합니다.
   7. 튜브를 잠시 돌리기 전에 마그네틱 스탠드에 1분 동안 올려 놓습니다.
   8. rRNA가 고갈된 RNA를 포함하는 투명한 상층액을 새 튜브에 수집합니다.
3. RNA 단편화
   1. 새로운 PCR 튜브에 8-10 μL의 rRNA가 고갈된 총 RNA(500 ng/g), 1 μL의 10x 완충액 및 1 μL의 RNase III를 추가합니다.
   2. 짧게 탭하고 회전하여 용액을 혼합합니다.
   3. 튜브를 열 순환기에 10°C에서 37분 동안 놓습니다.
   4. 새 튜브에 5μL의 핵산 결합 비드를 첨가한 다음 90μL의 결합 용액 농축액을 첨가합니다.
   5. 위의 혼합물에 RNA 단편 30 μL와 100% 에탄올 150 μL를 첨가합니다. 10회 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   6. 용액이 투명해질 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 상층액을 제거하고 폐기합니다.
   7. 튜브가 자기 스탠드에 있는 동안 150μL의 에탄올로 비드를 세척합니다. 혼합물을 30초 동안 그대로 두었다가 상등액을 제거합니다.
   8. 남은 에탄올이 증발할 수 있도록 튜브를 마그네틱 스탠드에 1-2분 동안 그대로 두십시오.
   9. 12 μL의 예열된 뉴클레아제가 없는 물을 비드에 첨가하고 10회 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
   10. 실온에서 1분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 투명해지면 상층액을 수집합니다.
4. 라이브러리 준비 및 cDNA 준비
   1. 단편화된 RNA 샘플 3μL를 PCR 튜브에 첨가한 다음 5μL의 혼성화 혼합물을 첨가합니다. 몇 차례 피펫팅하여 샘플을 혼합한 다음 샘플을 잠시 회전시킵니다.
   2. 튜브를 65°C에서 10분 동안 열 순환기에 보관한 다음 5°C에서 30분 동안 보관합니다.
   3. 위의 용액에 10 μL의 ligation buffer와 2 μL의 ligation enzyme mix를 첨가한다. 30°C에서 1시간 동안 열 순환기에서 반응을 배양합니다.
   4. 리버스 트랜스크립트레아제 마스터 믹스를 결찰 혼합물에 추가하고 70°C에서 10분 동안 배양한 후 얼음에서 배양합니다.
5. cDNA의 증폭
   1. 6 μL의 cDNA(500 ng)를 새로운 PCR 튜브에 첨가한 다음 46 μL의 고충실도 중합효소와 1 μL의 3' 바코드 프라이머가 포함된 튜브에서 46 μL의 바코드 PCR 혼합물을 추가합니다.
   2. PCR 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : 첫 번째 단계, 94 ° C에서 2 분 동안 유지; 두 번째 단계, 94 ° C에서 30 초 동안 및 50 ° C에서 30 초 동안 사이클; 세 번째 단계, 94°C에서 30초 동안 16회, 62°C에서 30초, 68°C에서 30초 동안 주기. 68°C에서 5분 동안 반응을 유지합니다.
   3. 4.3.5 - 4.3.10 단계를 반복하여 증폭된 cDNA를 정제하고 단편화된 RNA 샘플을 이전 단계에서 얻은 PCR 산물로 교체합니다.
   4. 염기서열분석기(NGS)에서 정제된 RNA 샘플을 분석하여 FASTq 파일 형태로 데이터를 생성합니다.

5. 생물정보학

1. 브라우저에서 사용할 수 있는 은하계 도구를 엽니다. 링크를 복사하여 붙여 넣으십시오 : https://usegalaxy.org 브라우저의 검색 탭에 붙여 넣습니다.
2. 이 사이트를 처음 방문할 때 로그인 또는 오른쪽 상단 모서리에 있는 등록 옵션을 클릭하여 프로필을 등록하십시오.
3. 계정을 만든 후 공개 이름/사용자 이름 및 비밀번호를 입력하여 계정에 로그인합니다.
4. RNA-seq 분석 후 얻은 FASTq 파일을 왼쪽 패널의 업로드 옵션을 클릭하여 업로드합니다.
5. 왼쪽 패널의 도구 섹션에서 cutadapt 도구를 선택합니다. 이 도구는 품질이 낮은 시퀀스를 자릅니다.
   참고: 이제 이 파일을 매핑에 사용할 수 있습니다.
6. 왼쪽 패널의 도구 버튼을 클릭하고 RNA 스타 도구를 찾습니다. 다음과 같이 세부 정보를 입력합니다.cutadapt의 출력 파일을 사용하고, 참조 게놈을 human reference genome(hg38)으로 선택하고, 주석이 달린 접합부 주위의 게놈 염기서열 길이를 36으로 변경합니다. output as gene count를 선택하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 run tool 옵션을 클릭합니다.
   참고: 이 도구는 BAM 파일을 생성합니다.
7. 도구 옵션에서 featurecounts 도구를 선택하고 RNA 별 분석 후 얻은 BAM 파일을 업로드합니다. 읽기 필터링 옵션에서 읽기당 최소 매핑 품질 옵션을 10으로 설정하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 실행 도구 옵션을 클릭합니다.
8. 오른쪽 패널에서 featurecount 출력 파일을 열고 데이터를 스프레드시트에 복사합니다. 테스트에서 얻은 읽기 횟수를 컨트롤에서 얻은 읽기 횟수와 =log (fold change, 2) 명령을 사용하여 컨트롤에서 얻은 읽기 횟수로 나누어 컨트롤에 상대적인 폴드 변경을 계산합니다.
   참고: 폴드 변경 <-2.0은 하향 조절을 나타내는 것으로 간주되고 폴드 변경 > 2.0은 상향 조절로 간주됩니다.

형태학적 변화
산성 매질에서 인간 췌관 세포의 배양은 세포의 형태를 변화시켰습니다. 합류하고 빽빽하게 채워진 세포 패턴으로 인해 산성 조건에서 세포가 분산되었으며 시간이 지남에 따라 세포 사멸이 두드러집니다. 정상적인 배지 함유 세포와 비교했을 때, 관 세포는 줄어들고 크기가 줄었습니다. 부화 6시간 후 사망률의 급격한 변화가 관찰되었습니다. 24시간 후, 세포 수가 감소하고 세포가 스트레스 상태에 있는 것처럼 보였습니다(그림 1, 그림 2 및 그림 3). 따라서, 추가 분석 전에 산성 매질에서 배양 기간을 6시간으로 연장했습니다.

RNA-seq 분석
전사체의 원시 파일은 DOI: 10.17632/kd994sftcs.1의 Mendeley Data(https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1)에서 사용할 수 있습니다. NGS 데이터는 pH 6.0에서 총 1,389개의 유전자, pH 6.5에서 1,346개의 유전자, pH 7.0에서 1,427개의 유전자를 밝혔습니다(보충표 S1). 조절장애유전자에 대한 폴드 변화를 고려했을 때, 상향조절된 유전자의 수는 pH 6.0, 6.5, 7.0에서 각각 90, 148, 109였다. 또한 20, 14 및 23 유전자는 각각 pH 6.0, 6.5 및 7.0에서 하향 조절되었습니다(그림 4). 다양한 pH 수준에서 상향 조절된 종양유전자 및 종양억제인자 유전자를 표 2 및 표 3에 나타내었다. 세 가지 pH 수준(그림 5) 모두에서 상향 조절된 3개의 종양유전자는 림프구 세포 특이적 단백질-티로신 키나아제(LCK), FGR 원발암유전자, Src 계열 티로신 키나아제(FGR) 및 SH3 도메인, 안키린 반복 및 PH 도메인 3(ASAP3)이 있는 ArfGAP입니다. LCK는 종양세포 이동의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 암 줄기세포의 자가 재생에 관여합니다¹⁴. Src 패밀리 키나아제의 활성화는 암 발병 및 진행에 관여한다¹⁵. FGR의 과발현은 빠른 종양 진행과 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 백혈병¹⁶, 림프종¹⁷, 다형성 교모세포종¹⁸과 같은 암 환자의 생존율이 낮아졌습니다. ASAP3는 세포 이동 및 침입²⁰과 함께 간세포 암종¹⁹의 세포 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 문서화되었습니다.

그림 1: pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0에서 0시간, 1시간 및 2시간 동안 변형된 배지에서 배양하여 배양한 인간 췌관 세포주의 10배 확대 이미지. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0에서 3시간, 4시간 및 5시간 동안 변형된 배지에서 배양하여 배양한 인간 췌관 세포주의 10배 확대 이미지. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0에서 6시간 및 22시간 동안 변형된 배지에서 배양하여 배양한 인간 췌관 세포주의 10배 확대 이미지. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0에서 조절에 실패한 총 유전자의 막대 그래프는 각각의 pH 값에서 상향 조절 및 하향 조절 유전자의 총 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: pH 6.0, 6.5 및 7.0에서 측정된 공통 종양 유전자를 나타내는 벤 다이어그램. 모든 pH 값에서 공통적으로 상향 조절되는 것으로 밝혀진 종양 유전자는 LCK, FGR 및 ASAP3였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 인산나트륨 완충액 원료 조성.

표 2: 다른 pH 값에서 상향 조절되고 유전자의 변화를 접는 종양 유전자 목록.

표 3: 다른 pH 값에서 상향 조절되고 유전자의 변화를 접는 종양 억제 유전자 목록.

보충 표 S1: pH 6 대 7.2, pH 6.5 대 7.2, pH 7 대 pH 7.2에서 상향 및 하향 조절된 유전자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 방법은 생물학적 반복에서 비암성 인간 췌장 관 상피 세포에 대한 산성 조건의 영향을 결정하기 위해 개발되었습니다. 배지의 pH의 변화로 인해 세포가 스트레스 상태가 되고 형태학의 변화가 관찰되었습니다. 세포를 pH 6.0, 6.5 또는 7.0에서 24시간 동안 배양하고 추가 실험을 위한 배양 기간을 최적화하기 위해 매시간 모니터링했습니다. 배양 4시간 후 형태 변화를 관찰했으며, 산성 pH에서 배양 6시간 후 세포 사멸률이 증가했습니다. 따라서 유전자 발현 분석을 진행하기 전에 6시간 동안 세포를 배양했습니다.

log2 fold 변화가 있는 차등 발현 유전자(DEG)는 산성 pH가 관 세포 유전자 발현에 미치는 영향을 보여주었습니다. 종양유전자 LCK, FGR 및 ASAP3의 발현 증가는 산성 pH가 관 상피 세포 유전자 발현에 미치는 영향을 입증했습니다. 산성 pH 조건에서 종양 유전자 및 종양 억제 유전자 발현의 조절 장애는 pH가 염증 조건에서 종양 시작에 역할을 할 수 있음을 나타냅니다 ^7,8.

이 방법의 중요한 단계는 산성 pH에서 관 세포의 배양 시간인데, 암세포와 달리 비암세포는 배양 조건의 변화에 민감하기 때문에 이는 긴 배양 기간으로 실험을 수행하는 데 제한 요소가 됩니다¹². 이 연구의 한계는 인간 췌관 세포주를 사용했다는 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리는 만성 췌장염을 모방하기 위해 산성 pH 조건에서 유전자 발현의 변화를 평가했습니다.

암 치료의 주요 단점은 암이 진행되는 동안 발생하는 미세 환경과 기질입니다. 항암제는 암세포를 사멸시킬 수 있는 능력은 있지만 미세환경에 침투하지 못해 약효가 떨어진다. 모든 암의 미세환경적 요인 중 하나는 암 대사와 진행이 진행되는 동안 유발되는 산성 상태이다²⁰. 특정 유형의 암에 대한 세포 행동 변화 및 약물 효과는 이 방법을 통해 평가할 수 있습니다. 차세대 염기서열분석(sequencing)을 통해 유전자 발현을 평가할 수 있으며, 잠재적인 약물 표적을 식별할 수 있습니다.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

레누카 구드쉘와르(Renuka Goudshelwar)는 펠로우십을 제공해준 DBT에 감사하고 있습니다. Renuka Goudshelwar는 하이데라바드의 오스마니아 대학교(Osmania University) 생화학과와 V. V. Ravikanth 박사의 도움을 받아 NGS 데이터를 분석한 것에 대해 감사를 표합니다. M. Sasikala 박사는 인도 정부 보건부 ICMR(보조금 번호 94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS)로부터 받은 재정 지원을 인정합니다.