Analisi dell'espressione di oncogeni con alterazioni del pH in una linea cellulare duttale pancreatica

Questo studio descrive un protocollo per esplorare gli effetti dell'alterazione del pH sull'espressione dell'oncogene attraverso l'analisi RNA-seq di una linea cellulare duttale pancreatica.

La quarta causa di morte correlata al cancro, l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), ha un tasso di sopravvivenza a cinque anni del 12%. Questa malattia ha una prognosi infausta ed è caratterizzata da un microambiente stromale rigido, che rappresenta una sfida tangibile nel suo trattamento. I pazienti con pancreatite cronica hanno un rischio 10 volte maggiore di sviluppare PDAC; in questi pazienti, il pH duttale diminuisce da pH 8,0 a pH 6,0 a causa dell'insufficienza di bicarbonato e dell'ambiente infiammatorio. Il nostro obiettivo era comprendere il ruolo dell'ambiente acido osservato nella pancreatite cronica sull'espressione di oncogeni in una linea cellulare duttale pancreatica.

Pertanto, l'80% delle cellule epiteliali duttali pancreatiche umane confluenti sono state incubate a pH 6,0-7,2 per 6 ore. L'RNA totale delle cellule è stato elaborato per arricchire l'mRNA totale nei campioni. L'espressione genica è stata valutata tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS) di repliche biologiche. L'analisi dell'RNA-seq è stata effettuata con l'ausilio di uno strumento online e sono stati identificati i geni differenzialmente espressi (FC < ± 2.0); c'erano 90, 148 e 109 geni sovraregolati e 20, 14 e 23 geni sottoregolati a pH 6,0, 6,5 e 7,0, rispettivamente. Quattro oncogeni sono stati sovraregolati a pH 6,0, sette sono stati sovraregolati a pH 6,5 e sette sono stati sovraregolati a pH 7,0. I geni comuni che erano sovraregolati a pH 6.0, pH 6.5 e pH 7.0 erano la proteina-tirosin-chinasi (LCK) specifica per le cellule linfocitarie [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], il proto-oncogene FGR, la tirosin-chinasi della famiglia Src (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09] e ArfGAP con dominio SH3, ankyrin repeat, e il dominio PH 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC: 2.37; pH 6.5, FC: 3.84; pH 7.0, FC: 2.51]. L'ambiente acido innesca l'attivazione di proto-oncogeni, che possono innescare l'inizio del tumore nella pancreatite cronica.

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tumori principali ed è al quarto posto tra i tumori in termini di numero di decessi correlati¹. Un tasso di mortalità più elevato è evidente tra i pazienti con PDAC e, secondo studi recenti, il tasso di sopravvivenza a cinque anni è solo del 12%. I pazienti con pancreatite cronica documentata, una malattia che provoca infiammazione del pancreas², hanno una probabilità maggiore (circa 15-16 volte) di sviluppare PDAC³. Esistono vari tipi di CP con diverse eziologie, come CP⁴ correlata all'alcol, ereditaria e idiopatica. È noto che le condizioni che esistono durante la paralisi cerebrale portano alla formazione di calcoli calcificati, allo sviluppo di cellule tumorali e persino al diabete. La prevalenza del PDAC è elevata nei pazienti con pancreatite cronica ereditaria⁵.

Alcune condizioni fisiologiche all'interno del pancreas dei pazienti con paralisi cerebrale potrebbero essere utili per l'inizio di altri disturbi; questi includono l'ambiente infiammatorio, gli enzimi digestivi attivi e il pH acido del succo pancreatico⁶. È in corso un'ampia gamma di studi nell'area dell'infiammazione, poiché l'infiammazione crea caos nel normale funzionamento dell'organo ^7,8,9. Tuttavia, uno squilibrio nella regolazione del pH è un altro fenomeno che potrebbe innescare l'inizio della crescita incontrollata delle cellule¹⁰. Il succo pancreatico degli individui sani è alcalino, il che aiuta a neutralizzare il chimo acido prodotto dallo stomaco. Al contrario, il succo pancreatico rimane acido nei pazienti con CP a causa dell'insufficiente secrezione di bicarbonato. Bassi livelli di bicarbonato non possono neutralizzare completamente il succo, il che si traduce in un ambiente leggermente acido all'interno del dotto¹¹.

Studi precedenti indicano che le cellule tumorali si adattano e prosperano in ambienti acidi¹². In questi casi, le condizioni che esistono durante il processo di pancreatite cronica suggeriscono un ambiente favorevole per la proliferazione e la metastasi di queste cellule¹³. Pertanto, il nostro studio mirava a valutare i cambiamenti morfologici nelle cellule duttali pancreatiche umane e a valutare l'espressione dell'oncogene in condizioni leggermente acide.

1. Rinascita della linea cellulare

1. Procurare la linea cellulare duttale pancreatica normale umana (HPDEC/ H6C7) e ravvivare le cellule in terreno fresco.
   1. Scongelare le celle a 37 °C a bagnomaria.
   2. Preparare al momento il terreno completo e filtrarlo con un filtro per siringa.
      NOTA: Il terreno completo contiene il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS).
   3. Aggiungere 6 mL del terreno completo a una provetta conica fresca da 15 mL, aggiungere la sospensione cellulare scongelata e mescolare accuratamente.
   4. Centrifugare la sospensione a 1.800 × g per 6 min. Scartare il surnatante, aggiungere 1 mL di terreno di coltura al pellet e mescolare delicatamente.
      NOTA: Il terreno di coltura contiene DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotici pen/streptococco.
   5. Aggiungere le cellule goccia a goccia in un matraccio T-25 contenente 4 mL di terreno di coltura e incubare a 37 °C, 5% CO₂.

2. Modifica del pH del terreno di coltura

1. Preparare 100 mL di soluzioni madre tampone fosfato di sodio 0,5 M con valori di pH di 6,0, 6,5 e 7,0 come indicato nella Tabella 1.
2. Controllare il pH con un pHmetro e regolarlo con 1 N HCl/1 M NaOH.
3. Sterilizzare i tamponi con filtro in una cappa a flusso d'aria laminare con un filtro per siringa da 0,45 μm.
   NOTA: Il tampone può essere conservato a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
4. Preparare i terreni di coltura con valori di pH di 6,0, 6,5 e 7,0 aggiungendo 20 mL di tampone fosfato di sodio sterile 0,5 M con il rispettivo pH a 80 mL di terreno di coltura.
5. Aggiungere il terreno con il pH alterato all'85-90% di cellule duttali pancreatiche umane confluenti e verificare i cambiamenti morfologici al microscopio a campo chiaro a intervalli di 1 ora per 6 ore.

3. Isolamento dell'RNA

NOTA: Per l'isolamento dell'RNA dalle cellule devono essere utilizzati guanti sterili e la superficie deve essere decontaminata utilizzando etanolo al 100%.

1. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Posizionare la piastra sul ghiaccio, aggiungere PBS al pozzetto, quindi raschiare le cellule con un raschietto per cellule.
   NOTA: La quantità di PBS aggiunta dovrebbe essere sufficiente a coprire le celle per lo scraping. Non è necessario aggiungere un volume elevato di PBS.
3. Raccogliere la sospensione in una provetta nuova e centrifugarla a 8.000 ×g per 10 minuti. Scartare il surnatante.
4. Aggiungere al pellet un tampone di lisi contenente β-mercaptoetanolo e pipettarlo su e giù per 5-10 minuti con ghiaccio.
5. Aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% al lisato e mescolare accuratamente. Non vortice.
6. Aggiungere la soluzione alla colonna della membrana di silice, centrifugare a >8.000 ×g per 30 s ed eliminare il flusso.
7. Aggiungere il tampone di lavaggio al campione e centrifugare a >8.000 ×g per 30 s. Centrifugare la provetta vuota per 1 minuto a >8.000 ×g.
8. Aggiungere 30-50 μL di acqua priva di nucleasi alla colonna e lasciarla per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna a >8.000 ×g per 5 min.
   NOTA: I campioni di RNA possono essere conservati a -20 °C fino a un nuovo utilizzo.

4. RNA-seq/trascrittoma

1. Valutazione dell'integrità dell'RNA
   1. Verificare l'integrità dell'RNA in un bioanalizzatore prelevando 1 μL (25-500 ng) e mescolandolo con 5 μL di tampone colorante.
   2. Agitare la soluzione a 500 ×g per 1 minuto e centrifugare brevemente.
   3. Eseguire una reazione a catena della polimerasi (PCR) in un'unica fase per ciascun campione a 72 °C per 3 minuti, quindi prelevare le provette e incubarle su ghiaccio per 2 minuti prima dell'analisi con un bioanalizzatore.
2. RNA totale impoverito di rRNA
   1. Aggiungere 5 μg di RNA totale, 50 μl di tampone di ibridazione e 1-3 μl di miscela di sonde a una provetta PCR nuova.
   2. Eseguire i seguenti passaggi: prima fase, denaturazione a 70 °C per 10 min; secondo step, ibridazione a 37 °C per 20 min; e incubazione a 37 °C fino all'uso.
   3. In una provetta nuova, aggiungere 500 μl di microsfere magnetiche e il campione; Mettere la miscela su un supporto magnetico per 1 minuto fino a quando la soluzione diventa limpida.
   4. Eliminare con cautela il surnatante. Rimuovere la provetta, lavare le perle aggiungendo 500 μL di acqua priva di nucleasi e riposizionare la miscela sul supporto magnetico per 1 minuto. Rimuovere il surnatante una volta che la soluzione diventa limpida.
   5. Ripeti il processo 5-7 volte. Aggiungere 200 μl di tampone di ibridazione e mescolare correttamente. Mantenere le provette a 37 °C per 5 minuti.
   6. Aggiungere 100 μL di sonda di RNA alla miscela di cui sopra, mescolare delicatamente e incubare la miscela a 37 °C per 15 minuti.
   7. Far girare brevemente il tubo prima di posizionarlo sul supporto magnetico per 1 minuto.
   8. Raccogliere il surnatante chiaro contenente l'RNA impoverito di rRNA in una provetta nuova.
3. Frammentazione dell'RNA
   1. In una provetta PCR fresca, aggiungere 8-10 μL di RNA totale impoverito di rRNA (500 ng/g), 1 μL di tampone 10x e 1 μL di RNasi III.
   2. Mescolare la soluzione picchiettando e girando brevemente.
   3. Immergere le provette in un termociclatore per 10 minuti a 37 °C.
   4. In una provetta nuova, aggiungere 5 μl di perle leganti l'acido nucleico, quindi aggiungere 90 μl di concentrato di soluzione legante.
   5. Aggiungere 30 μl di frammenti di RNA e 150 μl di etanolo al 100% alla miscela di cui sopra. Miscelare il campione pipettandolo 10 volte e incubarlo per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Posizionare i tubi sul supporto magnetico fino a quando la soluzione non diventa limpida. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
   7. Lavare le perle con 150 μL di etanolo mentre le provette sono su un supporto magnetico; Lasciare riposare il composto per 30 secondi e poi rimuovere il surnatante.
   8. Lasciare le provette su un supporto magnetico per 1-2 minuti per consentire all'etanolo rimanente di evaporare.
   9. Aggiungere 12 μl di acqua preriscaldata priva di nucleasi alle microsfere e mescolare il campione pipettando 10 volte.
   10. Incubare il campione per 1 minuto a temperatura ambiente. Posizionare le provette su un supporto magnetico e raccogliere il surnatante una volta che è limpido.
4. Preparazione della libreria e preparazione del cDNA
   1. Aggiungere 3 μl del campione di RNA frammentato a una provetta per PCR, quindi aggiungere 5 μl di miscela di ibridazione. Miscelare il campione pipettandolo alcune volte e quindi centrifugare brevemente il campione.
   2. Tenere le provette in un termociclatore per 10 minuti a 65 °C, seguiti da 5 minuti a 30 °C.
   3. Aggiungere 10 μL di tampone di legatura e 2 μL di miscela di enzimi di legatura alla soluzione di cui sopra. Incubare la reazione in un termociclatore per 1 ora a 30 °C.
   4. Aggiungere la master mix di trascrittasi inversa alla miscela di legatura e incubare a 70 °C per 10 minuti, quindi incubare con ghiaccio.
5. Amplificazione del cDNA
   1. Aggiungere 6 μL di cDNA (500 ng) a una provetta PCR nuova, quindi aggiungere 46 μL di miscela PCR con codice a barre da una provetta contenente 46 μL di enzima polimerasi ad alta fedeltà e 1 μL di primer per codici a barre da 3'.
   2. Impostare le condizioni PCR come segue: primo stadio, mantenere a 94 °C per 2 min; secondo stadio, cicli a 94 °C per 30 s e 50 °C per 30 s; terzo stadio, 16 cicli a 94 °C per 30 s, 62 °C per 30 s e 68 °C per 30 s. Mantenere la reazione a 68 °C per 5 minuti.
   3. Purificare il cDNA amplificato ripetendo i passaggi da 4.3.5 a 4.3.10 e sostituire il campione di RNA frammentato con il prodotto PCR ottenuto nel passaggio precedente.
   4. Analizza il campione di RNA purificato su un sequenziatore (NGS) per generare dati sotto forma di file FASTq.

5. Bioinformatica

1. Apri lo strumento galassia disponibile online copiando e incollando il link: https://usegalaxy.org nella scheda di ricerca del browser.
2. Alla prima visita a questo sito, registrati per un profilo facendo clic sull'opzione di accesso o sull'opzione di registrazione nell'angolo in alto a destra.
3. Dopo aver creato un account, accedi all'account inserendo il nome/nome utente e la password pubblici.
4. Caricare i file FASTq ottenuti dopo l'analisi RNA-seq facendo clic sull'opzione di caricamento nel pannello laterale sinistro.
5. Seleziona lo strumento cutadapt dalla sezione degli strumenti sul pannello laterale sinistro. Questo strumento taglierà le sequenze di bassa qualità.
   NOTA: Questo file può ora essere utilizzato per la mappatura.
6. Fare clic sul pulsante dello strumento sul pannello laterale sinistro e cercare lo strumento RNA star. Compila i dettagli come segue: Usa il file di output di cutadapt, seleziona il genoma di riferimento come genoma di riferimento umano (hg38) e modifica la lunghezza della sequenza genomica attorno alle giunzioni annotate a 36. Seleziona l'output come conteggio dei geni e fai clic sull'opzione dello strumento di esecuzione nell'angolo in alto a destra.
   NOTA: questo strumento genererà un file BAM.
7. Selezionare lo strumento featurecounts dalle opzioni dello strumento e caricare i file BAM ottenuti dopo l'analisi delle stelle di RNA. Imposta l'opzione di qualità minima di mappatura per lettura nelle opzioni di filtro di lettura su 10 e fai clic sull'opzione dello strumento Esegui nell'angolo in alto a destra.
8. Apri il file di output featurecount dal pannello di destra e copia i dati in un foglio di calcolo. Calcolare la variazione di riduzione relativa al controllo dividendo il numero di conteggi di lettura ottenuti nel test per il numero di conteggi di lettura ottenuti nel controllo con il comando =log (cambio di piegatura, 2).
   NOTA: Un cambio di piega <-2.0 è considerato un'indicazione di regolazione verso il basso e un cambio di piega > 2.0 è considerato una regolazione verso l'alto.

Modificazioni morfologiche
L'incubazione di cellule duttali pancreatiche umane in un mezzo acido ha alterato la morfologia delle cellule. Un modello cellulare confluente e strettamente impacchettato ha portato a cellule disperse in condizioni acide e la morte cellulare diventa prominente con il tempo. Rispetto alle normali cellule contenenti il mezzo, le cellule duttali si sono ridotte e sono diminuite di dimensioni. Un drastico cambiamento nel tasso di mortalità è stato osservato dopo 6 ore di incubazione. Dopo 24 ore, il numero di cellule è diminuito e le cellule sembravano essere in uno stato di stress (Figura 1, Figura 2 e Figura 3). Pertanto, il periodo di incubazione è stato prolungato a 6 ore in mezzo acido prima di ulteriori analisi.

Analisi RNA-seq
I file grezzi del trascrittoma sono disponibili su Mendeley Data (https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1) con DOI: 10.17632/kd994sftcs.1. I dati NGS hanno rivelato un totale di 1.389 geni a pH 6,0, 1.346 geni a pH 6,5 e 1.427 geni a pH 7,0 (Tabella supplementare S1). Quando il cambiamento di piega è stato considerato per i geni disregolati, il numero di geni sovraregolati era 90, 148 e 109 a pH 6,0, 6,5 e 7,0, rispettivamente. Inoltre, 20, 14 e 23 geni sono stati sottoregolati rispettivamente a pH 6,0, 6,5 e 7,0 (Figura 4). Gli oncogeni e i geni oncosoppressori che sono stati sovraregolati a vari livelli di pH sono mostrati nella Tabella 2 e nella Tabella 3. I tre oncogeni che sono stati sovraregolati a tutti e tre i livelli di pH (Figura 5) sono la proteina-tirosin-chinasi specifica delle cellule linfocitarie (LCK), il proto-oncogene FGR, la tirosin-chinasi della famiglia Src (FGR) e ArfGAP con dominio SH3, ripetizione dell'ankirina e dominio PH 3 (ASAP3). LCK è noto per essere coinvolto nella regolazione della migrazione delle cellule tumorali ed è coinvolto nell'autorinnovamento delle cellule staminali tumorali¹⁴. L'attivazione della chinasi della famiglia Src è coinvolta nello sviluppo e nella progressione del cancro¹⁵. La sovraespressione di FGR è stata trovata in associazione con una rapida progressione tumorale, con conseguenti bassi tassi di sopravvivenza dei pazienti con tumori come la leucemia¹⁶, il linfoma¹⁷ e il glioblastoma multiforme¹⁸. È documentato che ASAP3 ha un ruolo nella proliferazione cellulare del carcinoma epatocellulare¹⁹ insieme alla migrazione e all'invasione cellulare²⁰.

Figura 1: Immagini con ingrandimento 10x di una linea cellulare duttale pancreatica umana incubata a pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 con incubazione in terreni alterati per 0 ore, 1 ora e 2 ore. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini con ingrandimento 10x di una linea cellulare duttale pancreatica umana incubata a pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 con incubazione in terreni alterati per 3 ore, 4 ore e 5 ore. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini con ingrandimento 10x di una linea cellulare duttale pancreatica umana incubata a pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 con incubazione in terreno alterato per 6 ore e 22 ore. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Grafico a barre del totale dei geni disregolati a pH 6,0, pH 6,5 e pH 7,0 che rappresenta il numero totale di geni sovraregolati e sottoregolati ai rispettivi valori di pH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Diagramma di Venn che rappresenta l'oncogene comune determinato a pH 6,0, 6,5 e 7,0. Gli oncogeni che sono risultati comunemente sovraregolati a tutti i valori di pH erano LCK, FGR e ASAP3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione del tampone fosfato di sodio.

Tabella 2: Elenco degli oncogeni sovraregolati a diversi valori di pH e variazione di piegamento del gene.

Tabella 3: Elenco dei geni oncosoppressori sovraregolati a diversi valori di pH e variazione di piega del gene.

Tabella supplementare S1: Geni up- e downregolati a pH 6 rispetto a 7,2, pH 6,5 rispetto a 7,2 e pH 7 rispetto a pH 7,2. Clicca qui per scaricare questo file.

Questo metodo è stato sviluppato per determinare gli effetti delle condizioni acide sulle cellule epiteliali duttali pancreatiche umane non cancerose nelle ripetizioni biologiche. Un cambiamento nel pH del terreno ha causato uno stato di stress delle cellule ed è stato osservato un cambiamento nella morfologia. Le cellule sono state coltivate a pH 6,0, 6,5 o 7,0 per 24 ore e monitorate ogni ora per ottimizzare il periodo di incubazione per ulteriori esperimenti. Abbiamo osservato un cambiamento nella morfologia dopo 4 ore di incubazione e il tasso di mortalità cellulare è aumentato dopo 6 ore di incubazione a pH acido. Pertanto, abbiamo incubato le cellule per 6 ore prima di procedere con l'analisi dell'espressione genica.

I geni differenzialmente espressi (DEG) con variazione log2 hanno dimostrato gli effetti del pH acido sull'espressione genica delle cellule duttali. L'aumento dell'espressione degli oncogeni LCK, FGR e ASAP3 ha dimostrato l'influenza del pH acido sull'espressione genica delle cellule epiteliali duttali. La disregolazione dell'espressione genica dell'oncogene e del gene oncosoppressore in condizioni di pH acido indica che il pH può svolgere un ruolo nell'inizio del tumore in condizioni infiammatorie ^7,8.

Il passaggio critico di questo metodo è il tempo di incubazione delle cellule duttali a pH acido perché, a differenza delle cellule tumorali, le cellule non tumorali sono suscettibili ai cambiamenti delle condizioni di coltura, il che diventa un fattore limitante per l'esecuzione di esperimenti con lunghi periodi di incubazione¹². Una limitazione di questo studio è che abbiamo utilizzato una linea cellulare duttale pancreatica umana. Nonostante questa limitazione, abbiamo valutato le alterazioni dell'espressione genica in condizioni di pH acido per imitare la pancreatite cronica.

Il principale svantaggio nel trattamento del cancro è il microambiente e lo stroma che si sviluppano durante il decorso del cancro. I farmaci antitumorali hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali ma non riescono a invadere il microambiente, con conseguente bassa efficacia del farmaco. Uno dei fattori microambientali in qualsiasi cancro è la condizione acida che viene indotta durante il metabolismo e la progressione del cancro²⁰. I cambiamenti del comportamento cellulare e l'efficacia dei farmaci contro un particolare tipo di cancro possono essere valutati con questo metodo. L'espressione genica può essere valutata mediante sequenziamento di nuova generazione e possono essere identificati potenziali bersagli farmacologici.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Renuka Goudshelwar è grata a DBT per averle fornito la borsa di studio. Renuka Goudshelwar riconosce l'aiuto ricevuto dal Dipartimento di Biochimica dell'Università di Osmania (Hyderabad) e dal Dr. V. V. Ravikanth per la sua guida durante l'analisi dei dati NGS. Il Dr. M. Sasikala riconosce l'assistenza finanziaria ricevuta dall'ICMR, Ministero della Salute, Governo dell'India (Grant no-94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).