В этом протоколе подробно описывается выделение живых иммунных и неиммунных популяций из легких мышей в стабильном состоянии и после гриппозной инфекции. Он также предоставляет стратегии гейтинга для идентификации субпопуляций эпителиальных и миелоидных клеток.

Легкие постоянно подвергаются воздействию патогенов и других вредных раздражителей окружающей среды, что делает его уязвимым к повреждениям, дисфункции и развитию заболеваний. Исследования с использованием мышиных моделей респираторных инфекций, аллергии, фиброза и рака сыграли решающую роль в выявлении механизмов прогрессирования заболевания и определении терапевтических мишеней. Тем не менее, большинство исследований, сосредоточенных на легких мышей, отдают приоритет выделению либо иммунных клеток, либо эпителиальных клеток, а не обеих популяций одновременно. В данной работе мы описываем метод получения комплексной суспензии одиночных клеток как иммунных, так и неиммунных популяций, пригодных для проточной цитометрии и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. Эти популяции включают эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и различные субпопуляции миелоидных клеток. Этот протокол влечет за собой бронхоальвеолярный лаваж и последующее раздувание легких с диспаузой. Затем легкие перевариваются в смеси либеразы. Этот метод обработки высвобождает множество различных типов клеток и приводит к получению суспензии одиночных клеток, которая не требует ручной диссоциации против фильтра, способствуя выживанию клеток и получая большое количество живых клеток для последующего анализа. В этом протоколе мы также определяем схемы стробирования для субпопуляций эпителиальных и миелоидных клеток как в наивных, так и в инфицированных гриппом легких. Одновременная изоляция живых иммунных и неиммунных клеток является ключом к исследованию межклеточных перекрестных помех и более глубокому пониманию биологии легких в здоровье и болезнях.

Легкое состоит из дыхательных путей, альвеол и интерстиция. Иммунные и неиммунные клетки находятся в этих компартментах, способствуя как гомеостатической функции легких (газообмену), так и защите организма от вредных факторов окружающей среды, таких как вирусная инфекция. Большие и малые дыхательные пути, или бронхи и бронхиолы, выстланы эпителиальными клетками. Преобладающими эпителиальными клетками в этих областях являются булавы и реснитчатые клетки, которые отвечают за секрецию защитных молекул и облегчение мукоцилиарного клиренса¹. Альвеолы являются наиболее дистальными структурами в легких, выстланными двумя типами эпителиальных клеток: альвеолярными клетками I типа (ATI) и альвеолярными клетками II типа (ATII). ATI отвечают за газообмен, а ATII выделяют и перерабатывают поверхностно-активные вещества для обеспечения соответствующего поверхностного натяжения ^2,3. ATII являются самообновляющимися и могут также дифференцироваться в ATI, что особенно актуально после повреждения легких⁴. Кроме того, ATII обеспечивают поддерживающую нишу для основного типа иммунных клеток, населяющих альвеолярную нишу, альвеолярных макрофагов (АМ)^5,6. Помимо эпителия, фибробласты, эндотелиальные клетки и интерстициальные макрофаги (ИМ) (которые могут быть связаны как с нервами, так и с сосудами) составляют интерстиций 7,8,9,10. В ответ на инфекцию и повреждение многочисленные клетки легких погибают, а иммунные клетки, включая моноциты и нейтрофилы, проникают в ткань^11,12. Моноциты, инфильтрирующие легкие, дифференцируются в макрофаги и могут вносить свой вклад в компартмент макрофагов в долгосрочной перспективе¹³.

Современные методы получения суспензий одиночных клеток из легкого мыши, как правило, основаны на коллагеназе и требуют физической диссоциации ткани¹⁴. Это может привести к низкому количеству жизнеспособных неиммунных клеточных популяций. Некоторые протоколы выделения эпителиальных клеток основаны на диспазе и позволяют получить более высокие доли живых эпителиальных клеток; Тем не менее, эти протоколы, как правило, не исследуют выход и жизнеспособность иммунных клеток 15,16,17. Проточная цитометрия является распространенным методом, используемым для различения клеточных популяций в переваренной ткани. На исходном уровне проточное цитометрическое стробирование для АМ, ИМ, моноцитов и нейтрофилов четко очерчено. Однако во время воспаления процесс гейтирования становится изменчивым и сложным для интерпретации из-за континуума экспрессии поверхностных маркеров инфильтрирующих моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги. Таким образом, представленный здесь протокол также описывает стратегии гейтирования для идентификации популяций миелоидных клеток, представляющих интерес после инфицирования.

Надежная диссоциация эпителиальных и миелоидных клеток легких имеет важное значение для определения их гомеостатических и воспалительных функций. Метод параллельной изоляции этих клеточных компартментов позволит проводить последующий анализ ключевых типов клеток, которые поддерживают здоровье и вызывают заболевания. Схематический обзор рабочего процесса этого протокола можно найти на рисунке 1.

Этот протокол соответствует рекомендациям Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию в Гарвардской медицинской школе (номера грантов: R35GM150816 и P30DK043351). Для экспериментов использовали самок мышей C57BL/6J в возрасте 8-12 недель. Этот протокол подходит и для самцов мышей. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов

1. Разморозьте на льду необходимые ферменты, в том числе диспазу, либеразу и ДНК.
2. Подготовьте другие необходимые реактивы. Наполните шприц объемом 10 мл 5 мл 2 мМ ЭДТА в DPBS и установите на него иглу 27 G. Наполните шприц объемом 1 мл DPBS и прикрепите катетер.

2. Забор легких

1. Усыпите мышь путем внутрибрюшинного введения 400-500 мг/кг и 25-100 мг/кг смеси кетамина/ксилазина (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Приступайте к вскрытию, когда мышь перестает реагировать на защемление подушечки ноги (~5 минут).
   Примечание: Смесь кетамина и ксилазина используется для эвтаназии вместо углекислого газа, чтобы предотвратить вызванное удушьем кровотечение и инфильтрацию иммунных клеток, которая может исказить результаты.
2. Опрыскайте мышь 70% этанолом. Препарируйте мышь с помощью тонких хирургических ножниц и щипцов #7. Сделайте надрез в области живота с помощью ножниц и разрежьте сбоку через брюшину.
   1. Сделайте небольшой надрез в диафрагме, чтобы выпустить вакуум. Вырежьте диафрагму и нижнюю грудную клетку из полости тела, чтобы обнажить легкие и сердце.
3. Перфузируют легкие 5 мл 2 мМ ЭДТА в DPBS в шприц объемом 10 мл с иглой 27 G. Перфузия выполняется путем введения иглой в основание сердца, направленной справа в левый желудочек, и медленного дозирования жидкости из шприца¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия должна выполняться медленно, чтобы предотвратить разрыв сосудистой системы.
4. Вскройте грудную клетку на грудине, отрезав боковые стороны грудной клетки, затем разрежьте вертикально через грудину, чтобы обнажить трахею¹⁹. Отрежьте как можно больше мышц и соединительной ткани с помощью тонких ножниц и щипцов #7, не прокалывая трахею или легкие.
5. Оберните трахею швом (размер 2-0) как бы перевязывайте ее, но не затягивая. Процедите трахею латерально и вставьте катетер. Плотно закрепите шов вокруг катетера, плотно натянув шовный материал. Не вводите катетер более чем на 1 см в легкое.
6. Накачайте легкие 1 мл DPBS. Извлеките DPBS, медленно потянув за шприц. Повторно накачайте легкие тем же DPBS и еще раз оттяните шприц для сбора бронхоальвеолярного лаважа жидкости (BALF).
7. Отсоедините шприц от катетера, оставив катетер вставленным. Выдавите BALF в микроцентрифужную пробирку.
8. Наполните тот же шприц объемом 1 мл 1 мл жидкостью и снова приложите его к катетеру. Дозируйте шприц для надувания легких с диспажем. Во время удаления катетера затяните шов вокруг трахеи, чтобы предотвратить вытекание отхождения.
9. Разрежьте трахею сбоку. Удалите легкие из полости тела, разрезав соединительную ткань вдоль задней части грудной клетки, при этом с помощью щипцов вытяните легкие и трахею вверх.
10. Удалите сердце из легких. Поместите легкие в 5 мл DPBS на лед.
11. На этом этапе возьмите отделенный BALF и отжимайте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Надосадочная жидкость может быть аликвотирована и сохранена по мере необходимости. Должна быть видимая клеточная гранула, которую можно ресуспендировать в 100 мкл RPMI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно подождать до 2 часов, чтобы приступить к пищеварению, что позволяет собирать несколько мышей одновременно.

3. Переваривание легких

1. Приготовьте смесь для дайджеста. Добавьте 83 мкг/мл либеразы (50 мкл стокового раствора) и 100 мкг/мл ДНКазы (15 мкл стокового раствора) в 3 мл RPMI на легкое.
2. Рассеките пять долей легких и отбросьте всю соединительную ткань^19,20. Разрубите легкое ножницами в течение 1 минуты на предметном стекле.
3. Переложите измельченное легкое в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью ножниц для препарирования. Добавьте гранулу ячейки, извлеченную из BALF и ресуспендированную в RPMI, в центрифужную трубку. Добавьте 3 мл смеси для дигеста в пробирку с образцом с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
4. Пипеткой переваривайте легкую смесь вверх и вниз 2-3 раза. Поместите при температуре 37 °C в орбитальный шейкер со скоростью 140 об/мин с метантеночными трубками, расположенными под углом 45 градусов, на 40 минут.

4. Приготовление одноклеточной суспензии

1. Извлеките пробирки центрифуги объемом 50 мл из орбитального шейкера и положите их на лед. Пипеткой переваривайте легкую смесь вверх и вниз 5-6 раз. Отфильтруйте через сетчатый фильтр 70 μм в новую пробирку объемом 50 мл. Промойте все оставшиеся клетки через фильтр и нейтрализуйте ферменты 10 мл 5% FBS в RPMI.
2. Отжим 5 мин при 4 °C при 600 x g. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора или пипетки. Ресуспендировать в 1 мл буфера для лизиса ACK и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре для лизиса эритроцитов (эритроцитов). Добавьте 9 мл PBS и проводите пипеткой вверх и вниз.
3. Отжим в течение 5 минут при 4 °C при 600 x g. Аспират надосадочная жидкость с помощью вакуумного аспиратора или пипетки. Ресуспендируйте в 1 мл буфера FACS (1% FBS в PBS) и отфильтруйте через меш 64 мкм в микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки p1000.

5. Проточная цитометрия и последующие анализы

1. При выполнении проточной цитометрии или флуоресцентно-активируемой сортировки клеток в 96-луночном планшете окрашивайте примерно 1-2 миллиона клеток на лунку, или 8% фракцию легочной суспензии.
2. Вращаем ячейки вниз. Все вращения в 96-луночном планшете должны выполняться в течение 2,5 мин (4 °C) при 600 x g. Стряхните надосадочную жидкость и промойте ячейки один раз, повторно суспендируя 200 мкл DPBS. Вращайте вниз и проведите пальцем.
3. Если клетки необходимо окрашивать для анализа проточной цитометрии, следует выполнить следующую процедуру окрашивания.
   1. Ресуспендировать клетки в живых/мертвых Zombie stain (1:150) и блоке Fc (1:250) в 25 мкл DPBS на 10 мин при комнатной температуре в темноте.
   2. Приготовьте смесь для окрашивания антител в 2-кратной концентрации в буфере FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивающая смесь должна включать в себя все маркеры миелоидной панели (Таблица 1) или эпителиальной панели (Таблица 2) в их указанных концентрациях.
   3. Добавьте 25 μл красящей смеси к 25 μл легочной суспензии в тарелке и выдерживайте на льду в течение 30 минут в темноте. Общий объем окрашивания теперь должен составлять 50 мкл, а концентрация первичных антител должна составлять 1x красящую.
   4. Добавьте 150 μL буфера FACS, уменьшите в течение 2,5 минут при 4 °C при 600 x g и стряхните надосадочную жидкость. Дважды промойте в 200 мкл буфера FACS.
   5. Если требуется внутриклеточное окрашивание, зафиксируйте клетки с помощью набора для внутриклеточной фиксации. Если внутриклеточное окрашивание не требуется, клетки могут быть зафиксированы в течение 20 мин в 4% PFA в DPBS.
   6. Смойте фиксатор 200 мкл буфера FACS три раза. Образцы могут храниться в ресуспендированном виде в 200 мкл буфера FACS при температуре 4 °C в темноте в течение 2-3 дней. Перед запуском образцов можно добавить счетные бусины для количественной оценки номеров ячеек.
4. Если клетки необходимо отсортировать, проведите следующую процедуру окрашивания.
   1. Ресуспендируйте клетки в 1x окрашивающей смеси антител с Fc-блоком (1:250). Выдерживать 30 минут на льду в темноте.
   2. Добавьте 150 μL буфера FACS, уменьшите в течение 2,5 минут при 4 °C при 600 x g и стряхните надосадочную жидкость. Перед сортировкой трижды промойте 200 мкл буфера FACS и повторно суспендируйте в 200 мкл буфера FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сортировкой рекомендуется добавлять в клетки краситель жизнеспособности, такой как DAPI.

В результате успешного переваривания получается примерно 20-25 миллионов клеток с жизнеспособностью 90-95%. Если примерно 25 000 счетных бусин добавляются к 8% легкого, бусины должны поставить под угрозу 1-3% собранных событий. После гейтирования на синглетах примерно 90%-95% клеток должны быть Zombie Aqua отрицательными (что указывает на жизнеспособность) (Рисунок 2А, Рисунок 3А).

Из CD45⁺ клеток CD64⁺F4/80⁺ клетки определяются как макрофаги (рис. 2B). На исходном уровне 80-90% всех макрофагов в легких определяются как АМ (Siglec-F⁺CD11c⁺), а остальные могут быть классифицированы как ИМ (Siglec-F-CD11c^-) (рис. 2C). Однако во время инфекции и воспаления это определение смещается, и IM-гейтинг будет содержать моноцитарные макрофаги (moMacs) в дополнение к IM (Siglec-F-CD11c^lo/hi). Кроме того, это соотношение смещается примерно до 4% AM и 90% IMs/moMac через 9 дней после заражения (dpi) (рис. 2C).

Клетки, которые относятся к CD64-F4/80⁺, могут быть дополнительно гейтированы Siglec-F и Ly6C. Клетки Siglec-F⁺ являются эозинофилами (рис. 2D). Клетки Ly6C⁺Siglec-F-CD11b⁺ могут быть идентифицированы как моноциты (рис. 2D). Клетки, отрицательные как на CD64, так и на F4/80 (рис. 2B), могут быть дополнительно гейтированы как CD11b⁺Ly6G⁺ для идентификации нейтрофилов (рис. 2E).

Чтобы открыть эпителиальные клетки, сначала должны быть выведены CD45⁺ клетки (рис. 3). Затем можно идентифицировать эндотелиальные клетки (CD31⁺) и фибробласты (Pdgfra⁺) (рисунок 3B). Впоследствии CD31-Pdgfra-клетки, которые являются EpCAM⁺, идентифицируются как эпителиальные клетки (рис. 3C). Эпителиальные клетки могут быть дополнительно подразделены на ATII (MHC-II⁺CD104^-), клетки дыхательных путей (клубовые и реснитчатые клетки) (CD104⁺) и другие эпителиальные клетки (MHC-II-CD104^-) (рисунок 3D). Доля клеток ATII уменьшается во время инфекции.

Рисунок 1: Схематическое изображение протокола. Легкие мышей перфузируют, надувают с помощью диспа и препарируют. После измельчения их переваривают в смеси либераза/ДНК с встряхиванием в течение 40 минут. Дигесты пропускаются через клеточное ситечко, а эритроциты лизируются. После ресуспендирования в буфере FACS клетки могут быть покрыты и окрашены перед последующим применением, включая проточную цитометрию. Эта фигура была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Стратегия гейтирования миелоидных клеток. Репрезентативное гейтирование анализов проточной цитометрии легких мышей, которые не инфицированы, через 9 дней или 14 дней после инфицирования (dpi) гриппом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). (А) Гейтирование живых CD45⁺ клеток. (B) CD45⁺ клетки гейтируют CD64 с помощью F4/80. (C) CD64⁺F4/80⁺ клетки (макрофаги), гейтированные в AM и IMs/moMacs с использованием Siglec-F с помощью CD11c. (D) CD64-F4/80⁺ клетки, гейтированные в эозинофилы и моноциты. (E) CD64-F4/^{80-клетки}, гейтированные для идентификации нейтрофилов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Стратегия гейтирования эпителиальных клеток. Репрезентативное гейтирование анализов проточной цитометрии неинфицированных легких мышей с разрешением 9 точек на дюйм или 14 точек на дюйм с гриппом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). (А) Гейтирование живых CD45-клеток. (B) CD45-клетки, сгубированные на CD31 (эндотелиальные клетки) с помощью Pdgfra (фибробласты). (C) CD31-Pdgfra-EpCAM⁺ клетки являются эпителиальными клетками. (D) Гейтирование эпителиальных клеток MHC-II по CD104 идентифицирует ATII (MHC-II⁺, CD104^-), эпителиальные клетки дыхательных путей (включая реснитчатые и клубные клетки) (CD104⁺) и другие эпителиальные клетки (MHC-II-CD104^-). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Индекс антител к миелоидной панели. Антитела, используемые для стратегии миелоидного гейтирования.

Таблица 2: Индекс антител для эпителиальной панели. Антитела, используемые для стратегии эпителиального гейтирования.

Этот протокол описывает процесс переваривания легких мыши, который выделяет примерно 20-25 миллионов клеток на мышь с жизнеспособностью 90-95%. Кроме того, он позволяет собирать BALF для дальнейшего анализа. Полученная клеточная суспензия совместима с различными лабораторными методами, включая проточную цитометрию и флуоресцентно-активируемую сортировку клеток для выделения клеток для секвенирования или культивирования клеток. Кратковременно, после перфузии, БАЛЬФ собирают, и надувают легкие с диспажем. Затем легкие измельчают и переваривают в растворе либеразы/ДНКазы. После лизиса и фильтрации можно приступать к последующим применениям, включая анализ проточной цитометрии миелоидных и эпителиальных субпопуляций при вирусной инфекции гриппа.

Если BALF не может быть извлечен и/или легкие не остаются должным образом надутыми, это может быть связано с неправильной установкой катетера. Если катетер будет размещен слишком глубоко в трахее/бронхах, он может прорвать ткань в брюшину. Это приведет к отсутствию накачивания и невозможности извлечения BALF. Если легкие раздулись, но жидкость не может быть вытянута из одной или нескольких долей легкого, это может быть связано с тем, что катетер направлен в один бронх. Вытягивание катетера немного дальше должно решить эту проблему. Требуется достаточная перфузия для устранения контаминации циркулирующих иммунных клеток²¹. При сильно поврежденных легких кровоизлияния и снижение целостности барьера могут сделать альвеолы более восприимчивыми к разрыву под давлением перфузии²². Поэтому крайне важно проводить перфузию мышам с поврежденными легкими очень медленно.

Ниже приведены некоторые рекомендации по передовым методам окрашивания проточной цитометрией. Что касается миелоидного гейтинга, если популяция Siglec-F⁺CD11c^- присутствует в макрофагальных воротах (CD45⁺CD64⁺F4/80⁺), это, вероятно, контаминация эозинофилами. Мы обнаружили, что эозинофилы являются аутофлуоресцентными как в каналах PE, так и в каналах BV605, поэтому крайне важно избегать использования антител CD64, конъюгированных с этими флуорофорами. Кроме того, хотя этот метод расщепления может изолировать живые лимфоциты, многие поверхностные маркеры, специфичные для лимфоцитов, такие как CD4 и CD8, расщепляются в процессе. В результате этот протокол не подходит для анализа популяций Т-клеток методом проточной цитометрии. В таких случаях подход, основанный на коллагеназе, может быть более эффективной альтернативой ^23,24.

Существует множество экспериментальных вопросов, требующих анализа как иммунных, так и неиммунных фракций от одной мыши^25,26. Например, при изучении взаимодействий между различными типами клеток крайне важно собирать и анализировать популяции внутри одной мыши, чтобы свести к минимуму потенциальные артефакты, которые могут возникнуть из-за биологической изменчивости между отдельными животными. Кроме того, сравнение популяций иммунных и неиммунных клеток из одного и того же микроокружения позволяет получить более полное представление о динамике тканей и их роли как в поддержании гомеостаза, так и в управлении патологическими процессами.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R35GM150816 и P30DK043351), Фонда Чарльза Х. Худа и Гарвардского института стволовых клеток. Мы благодарим Александра Манна и всех других сотрудников лаборатории Франклина за их помощь и советы в разработке и совершенствовании схем и анализов проточной цитометрии. Мы также благодарим Ядро проточной цитометрии иммунологии в Гарвардской медицинской школе. Анализ проточной цитометрии проводили с помощью FlowJo. Схемы фигур были созданы с помощью BioRender.