Диссоциация образцов опухолевой ткани человека и мыши для секвенирования РНК одиночных клеток

В этом протоколе описана процедура быстрой диссоциации образцов опухолей человека и мыши для секвенирования РНК одиночных клеток.

Образцы опухолей человека содержат множество информации об их микроокружении и иммунном репертуаре. Эффективная диссоциация образцов тканей человека в жизнеспособные клеточные суспензии является необходимым входом для конвейера секвенирования РНК одиночных клеток (scRNAseq). В отличие от подходов к объемному секвенированию РНК, scRNAseq позволяет нам сделать вывод о транскрипционной гетерогенности в образцах опухолей на уровне отдельных клеток. Внедрение этого подхода в последние годы привело ко многим открытиям, таким как идентификация иммунных и опухолевых клеточных состояний и программ, связанных с клиническими ответами на иммунотерапию и другие виды лечения. Кроме того, одноклеточные технологии, применяемые к диссоциированным тканям, могут быть использованы для идентификации доступных областей хроматина, Т- и В-клеточного рецепторного репертуара, а также экспрессии белков с использованием антител со штрих-кодом ДНК (CITEseq).

Жизнеспособность и качество диссоциированного образца являются критическими переменными при использовании этих технологий, поскольку они могут существенно повлиять на перекрестное загрязнение отдельных клеток окружающей РНК, качество данных и интерпретацию. Более того, длительные протоколы диссоциации могут привести к элиминации чувствительных клеточных популяций и повышению сигнатуры гена реакции на стресс. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол быстрой универсальной диссоциации, который был валидирован на нескольких типах опухолей человека и мышей. Процесс начинается с механической и ферментативной диссоциации, за которой следует фильтрация, лизис эритроцитов и обогащение живых мертвецов, пригодных для образцов с низким содержанием клеток (например, биопсия ядра иглой). Этот протокол обеспечивает чистую и жизнеспособную одноклеточную суспензию, имеющую первостепенное значение для успешного создания гелевых эмульсий (GEMs), штрих-кодирования и секвенирования.

Несмотря на то, что многие достижения в исследованиях рака привели к разработке и одобрению FDA препаратов, нацеленных на ингибиторные рецепторы, экспрессируемые на иммунных и опухолевых клетках, известных как ингибиторы блокады контрольных точек, устойчивость к терапии и выявление механизмов, которые стимулируют реакцию пациента^, остаются сложной задачей. Сложная задача характеристики гетерогенности опухоли по ее молекулярному разнообразию и сложному взаимодействию между опухолевыми клетками и иммунным микроокружением требует новых подходов к анализу этой сложной экосистемы с разрешением для одной клетки. Понимание молекулярных сложностей в опухолях и их микроокружении имеет решающее значение для продвижения терапевтических стратегий и расшифровки сложной биологии, лежащей в основе прогрессирования рака². Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) становится все более популярным, поскольку оно обеспечивает анализ отдельных клеток с высоким разрешением в сложных образцах опухолей ^3,4.

Гетерогенность опухолей, охватывающая генетические, эпигенетические и фенотипические различия, представляет собой проблему для раскрытия тонкостей биологии^рака. Традиционные методы массового секвенирования РНК имеют тенденцию скрывать уникальные профили экспрессии и фенотипы гетерогенных клеточных популяций, присутствующих в опухолях, поскольку эти методы усредняют^{сигналы по} целым клеточным популяциям. В отличие от этого, scRNA-seq позволяет препарировать отдельные типы клеток, выявляя различные экспрессии генов, паттерны репрессии и клеточные состояния, которые в противном случае были бы упущены из виду ^4,6. Предпосылка scRNA-seq заключается в его способности расшифровывать генетические и молекулярные сигнатуры отдельных клеток, что открывает огромные перспективы в открытии новых методов лечения^рака.

Расшифровывая профили экспрессии генов опухолевых клеток и окружающих стромальных и иммунных клеток, исследователи могут идентифицировать новые терапевтические мишени и разработать стратегии точной генетической медицины, адаптированные к индивидуальным^{пациентам.} Кроме того, анализ иммунного репертуара в опухолевом микроокружении позволяет получить важнейшее представление о взаимодействии между опухолевыми клетками и иммунными эффекторами, прокладывая путь к иммунотерапевтическим^{вмешательствам.} Несмотря на достижения в использовании scRNAseq на клинических образцах, некоторые проблемы на этапах обработки могут нанести ущерб целостности РНК клетки, жизнеспособности и качеству генерируемых данных. Кроме того, обработка тканей с низкой жизнеспособностью клеток может повышать уровни окружающей РНК в каплях, образующихся при инкапсуляции отдельных клеток, что приводит к перекрестному загрязнению и неправильной аннотации типов клеток, в то время как длительные протоколы диссоциации, выполняемые при 37 °C, могут привести к повышению сигнатуры гена реакции на стресс в нескольких типах клеток ^{8,9. 10}.

Поэтапная процедура (рис. 1A), описанная в данном протоколе, начинается с быстрой механической и ферментативной диссоциации опухолей с последующей фильтрацией и удалением мертвых клеток, в зависимости от жизнеспособности каждого образца опухоли. В настоящее время эта процедура верифицирована на образцах опухолей меланомы¹¹, толстой кишки¹², плоскоклеточного рака головы и шеи¹³, опухолей поджелудочной железы и легких (неопубликованные данные). Эти методы обеспечивают получение высококачественных жизнеспособных клеточных суспензий, имеющих решающее значение для последующих анализов¹⁴. В частности, удаление эритроцитов, лишенных синтезированной РНК, становится обязательным условием для очистки образца¹⁵. Последующая оценка количества клеток и элиминация мертвых клеток служат предпосылкой для успешного получения 10-кратной гелевой эмульсии (GEM) Genomics Gel, штрих-кодирования и увеличения восстановления транскриптов и секвенированных клеток без риска исключения чувствительных популяций (например, нейтрофилов и эпителиальных клеток)¹⁶. Эти шаги имеют основополагающее значение для раскрытия потенциала анализа разрешения одиночных клеток в образцах^{опухолей 9,10}, выявления новых профилей экспрессии генов и иммунных сигнатур, необходимых для проведения инновационных терапевтических вмешательств, а также выявления новых уязвимостей опухолей.

Это исследование соответствовало всем институциональным рекомендациям по забору образцов тканей человека. От пациентов было получено информированное согласие, а идентифицируемые данные образцов были анонимизированы. Образцы собираются в операционной, помещаются в раствор RPMI, физиологического раствора или PBS и подтверждаются на злокачественность в отделении патологии перед использованием в исследованиях. Все шаги, за исключением случаев, когда указано указание, должны выполняться при температуре 4 °C или на льду. Работа внутри биозащитного колпака при обработке тканей человека. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Получение образца

1. Возьмите образец твердой опухоли в пробирке со средой и поместите его на лед.
   1. Проинструктируйте персонал операционной о необходимости транспортировать образец в пробирке, содержащей достаточное количество RPMI, физиологического раствора или PBS для полного погружения ткани во избежание обезвоживания образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно убедиться, что образец не высох, так как это снизит жизнеспособность.
2. Охладите все центрифуги до 4 °C и доведите термомиксер до 37 °C.
3. Достаньте подготовленные ферменты диссоциации опухолей человека или мыши (Таблица материалов), разморозьте на термомиксере при температуре 37 °C и после оттаивания переместите на лед.
4. Извлеките аликвоту RPMI объемом 20 мл.
5. Записывайте соответствующую информацию об образце (например, идентификатор пациента, деидентификатор, тип образца).
6. Перенесите образец в чашку для культуры тканей диаметром 60 мм (помещенную на лед), несколько раз перевернув пробирку и вылив содержимое в чашку, чтобы убедиться, что весь материал образца перенесен. Если образец не был доставлен в фильтрующем материале по прибытии, добавьте в блюдо свежий фильтрующий материал RPMI.
   1. Если образец фрагментирован, вращайте пробирку, содержащую образец, при 450 × г 4 °C в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте образец в 420 мкл RPMI и перейдите к разделу 2.

2. Механическое и ферментативное пищеварение

1. Пипетка 420 мкл среды из чашки для образцов диаметром 60 мм в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Попытайтесь включить любые фрагменты образцов, взвешенные на носителе.
2. Перенесите образец ткани из чашки диаметром 60 мм в пробирку объемом 1,5 мл с средой с помощью пинцета. Разрежьте образец чистыми ножницами внутри пробирки так, чтобы кусочки были максимум 2-3 мм в диаметре.
3. Добавляют ферменты для пищеварения, приготовленные в соответствии со спецификациями производителя (Таблица материалов), в образце в следующих объемах: 42 мкл фермента H (неспецифические протеазы) для образцов человека, фермент D (неспецифические протеазы) для образцов мышей, 21 мкл фермента R (неспецифические протеазы) и 5 мкл фермента A (нуклеазы).
4. Добавьте еще 420 μL среды из чашки или до отметки 1 мл на пробирке. Не превышайте 420 мкл среды.
5. Сделайте трубку вихревой в течение 5 с и поместите ее в термомиксер, расположенный вертикально на боку (рис. 1B). Инкубировать при 37 °C, 450 об/мин, в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации извлеките все 10x материалы Genomics, необходимые для получения GEM, так как им требуется 30 минут для балансировки до комнатной температуры.

3. Фильтрация образцов

1. Поместите фильтр ячейки 50 μм поверх новой конической трубки объемом 15 мл и заполните фильтр, пропустив через него 1 мл свежего фильтрующего материала RPMI внутрь трубки.
2. После разложения переложите образец в пробирку объемом 15 мл с помощью широкого наконечника пипетки объемом 1 000 мкл с низким удержанием. Промойте пробирку объемом 1,5 мл 1 мл свежей среды и переложите среду в фильтр, чтобы убедиться, что весь материал образца прошел через фильтр.
3. Возьмите пластиковый шприц объемом 1 мл и выньте только поршень (оставшуюся часть шприца выбросьте). С помощью задней части поршня шприца измельчите и надавите на образец на фильтр вращательными движениями.
4. Промойте фильтр 5 мл фильтра и остатками фильтрующего материала из чашки, в которой находился образец (раздел 1), чтобы собрать все клетки, которые могли отделиться от ткани.
5. Поместите фильтр ячейки 30 μм поверх новой конической трубки объемом 15 мл, заправьте фильтр 1 мл фильтрующего материала и пропустите содержимое пробирки, содержащей диссоциированный образец, через фильтр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются крупные загрязнения, которые могут засориться или привести к сбою смачивания при обработке образца с использованием микрофлюидных чипов 10x Genomics.

4. Лизис эритроцитов

1. Центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Отсасывайте среду, стараясь не потревожить гранулы.
2. Ресуспендируйте в буфере ACK Lysis для удаления эритроцитов (эритроцитов) и записи использованного объема. Объем будет зависеть от размера гранул и количества эритроцитов в гранулах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендированный раствор образца ACK должен быть бесцветным, когда добавлено достаточное количество буфера для лизиса ACK, так как это приведет к удалению эритроцитов из образца.
3. Центрифугируйте пробирку с образцом при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
4. При необходимости повторяйте шаги 4.2-4.3 до тех пор, пока после центрифугирования гранула образца не потеряет видимый красный цвет (рисунок 2). Запишите все дополнительные объемы буфера ACK Lysis, используемого на этом этапе.
5. Повторно суспендируйте образец гранулы в свежей среде при подготовке к подсчету.

5. Подсчет ячеек

1. Поместите 10 μл трипанового синего в пробирку объемом 1,5 мл. Аккуратно перемешайте диссоциированные клетки, возьмите 10 μл образца и смешайте (1:1) с трипановым синим. Загрузите по 10 мкл с каждой стороны гемоцитометра и подсчитайте клетки.
2. Регистрируйте концентрацию клеток, общее количество живых клеток, процент жизнеспособности и конечный объем среды после подсчета.
3. Убедитесь, что количество клеток находится в диапазоне от 700 до 1 200 клеток/л (7 × 10, 5-1,2 × 10⁶/мл) для оптимального 10-кратного запуска геномики.
   1. Если проба слишком концентрированная, разбавьте ее средой и пересчитайте.
   2. Если образец слишком разбавлен, центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и повторно суспендируйте в меньшем объеме среды.
   3. Если жизнеспособность клеток ниже 80%, проведите процедуру удаления мертвых клеток.
   4. Если их меньше одного миллиона клеток, см. раздел 6.
   5. Если количество клеток превышает миллион и жизнеспособность > 10%, см. раздел 6.
   6. Если имеется более миллиона клеток и жизнеспособность < 10%, см. раздел 7.
   7. Если жизнеспособность клеток превышает 80%, держите обработанные клетки на льду и немедленно приступайте к генерации GEM в соответствии с инструкциями производителя.

6. Удаление мертвых клеток - Набор 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте внутри колпака биобезопасности при использовании реагентов для удаления мертвых клеток, так как они могут легко загрязниться.

1. Центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут.
2. В конической пробирке объемом 15 мл приготовьте изоляционную среду и храните ее при комнатной температуре: 9,8 мл PBS, 10 мкл CaCl₂ и 200 мкл термоинактивированной FCS (добавленной в биозащитный колпак).
3. После центрифугирования отсасывайте среду из гранулы и повторно суспендируйте в 1 мл изоляционной среды.
4. Снова центрифугируйте пробирку при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл изоляционной среды.
5. Перелейте 100 мкл образца в изоляционной среде в одну лунку ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл.
6. В биозащитный колпак добавьте 10 мкл коктейля Аннексин V и 10 мкл биотинового коктейля в лунку, содержащую 100 мкл образца в изоляционной среде. Пипеткой перемешайте раствор и дайте ему настояться при комнатной температуре в течение 4 минут.
7. Через 4 минуты наведите магнитные частицы с покрытием декстрана на 30 с. Добавьте в образец 20 μL гранул и 60 μL изоляционной среды (общий объем 200 μL). Если жизнеспособность ниже 40%, масштабируйте количество шариков до 40 μL при этом регулируйте объем изоляционной среды (до 40 μL), сохраняя общий объем 200 μL. Перемешайте пипетку и дайте раствору настояться при комнатной температуре в течение 3 минут.
8. Поместите полосковую пробирку на магнитный сепаратор 10x Genomics (на высоких настройках) на 5 минут при комнатной температуре.
9. Переложите жидкость из полосковой пробирки, не потревожив шарики, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл lo-bind. Не снимайте полоску-трубку с магнита.
10. Центрифугируйте пробирку объемом 1,5 мл, содержащую образец, при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме среды RPMI в зависимости от размера и количества клеток гранулы, как описано в разделе 5. Повторите процедуру удаления мертвых клеток, если жизнеспособность остается ниже 80% (Рисунок 3 и Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не ресуспендируйте клетки в изоляционной среде для последующего получения GEM, так как хлорид кальция будет мешать процессу инкапсуляции и этапу обратной транскрипции (RT).
11. Держите обработанные клетки на льду, если жизнеспособность клеток превышает 80%, и немедленно приступайте к получению GEM в соответствии с инструкциями производителя.

7. Удаление мертвых клеток - Набор 2

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте внутри биозащитного колпака при использовании реагентов набора.

1. Поместите микрогранулы и 20-кратный раствор связующего буфера в колпак для биобезопасности.
2. Суспензию образца центрифугируют при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин.
3. Приготовьте 1x буферный раствор в стерильных условиях, используя 1 мл 20x стокового раствора Binding Buffer, помещенного пипеткой в 19 мл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы.
4. После завершения центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте микрогранулы, аккуратно перемешайте образец и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
   1. Когда количество клеток составит 10-7 или меньше, добавьте 100 мкл микрогранул.
   2. При количестве более 10⁷ клеток отрегулируйте микрогранулы до конечной концентрации 100 мкл на 10⁷ живых клеток.
5. Во время инкубации получите одну колонку положительного отбора MACS, мультистенд MACS и соответствующий магнитный сепаратор. Убедитесь, что сепаратор выровнен на многоклеточном стенде и рядом с ним нет других металлических или магнитных предметов, так как магнитная сила очень велика и может повлиять на эффективность удаления мертвых ячеек. Плотно поместите колонну в держатель сепаратора крыльями наружу.
6. После инкубации образца, если общий объем ресуспендирования составляет менее 500 мкл, добавьте 1x связывающий буфер до тех пор, пока общий объем не составит 500 мкл.
7. Поместите коническую трубку объемом 15 мл под колонку и загрунтуйте колонку 3 мл 1x связующего буфера.
8. Замените коническую трубку на новую коническую на 15 мл для сбора образцов клеток и добавьте образец в колонку, чтобы он мог полностью протекать через колонку.
9. Промойте колонку 4 x 3 мл 1x связующего буфера, добавляя только одну промывку за раз после того, как предыдущая промывка полностью протекла через колонку.
10. После четвертой промывки коническую пробирку, содержащую выделенные клетки, центрифугируют в течение 5 мин при 450 × г, 4 °С. Отбросьте столбец и оставшийся 1x буфер привязки.
11. Повторно суспендируйте раствор образца в соответствующем количестве среды RPMI в зависимости от размера гранул и подсчитайте выделенные клетки способом, описанным в разделе 5 (рис. 3 и рис. 5).
    1. Если жизнеспособность остается ниже 80%, а общее количество клеток составляет 10⁶ или меньше, повторите раздел 6.
    2. Если жизнеспособность клеток превышает 80%, держите обработанные клетки на льду и немедленно приступайте к генерации GEM в соответствии с инструкциями производителя.

Была получена биопсия меланомы во взвешенном состоянии в RPMI и немедленно помещена на лед. Образец переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 420 мкл RPMI и ферментов для разложения, измельчали на мелкие кусочки с помощью ножниц и подвергали последующему ферментативному разложению в течение 15 мин в вертикально расположенном термомиксере при температуре 37 °C (рис. 1). После разложения образец фильтровали через стерильный одноразовый фильтр толщиной 50 мкм, а фильтр промывали свежим RPMI для увеличения выхода клеток (рис. 1). Оставшиеся после промывки части ткани были выброшены, так как это нежелательные биологические материалы (например, жировая ткань).

Исходя из цвета полученной клеточной гранулы, для удаления эритроцитов потребовалось 15 мл буфера для лизиса ACK (рис. 2). После ресуспендирования в 3 мл среды RPMI общее количество клеток составило 1 × 10⁶/мл, а жизнеспособность составила <80% (рис. 3A). Это указывало на то, что необходим один цикл обогащения живых клеток с использованием набора 1 (раздел 6 протокола), прежде чем переходить к 10-кратной загрузке геномики (рисунок 4). Если бы этот образец содержал более 1 миллиона клеток и имел жизнеспособность менее 10%, то вместо этого был бы использован набор для удаления мертвых клеток (Рисунок 5). Образец промывали изоляционной средой и добавляли 10 мкл аннексина V и селекционного коктейля биотина, а затем 20 мкл магнитных гранул и 60 мкл изоляционной среды, как описано в разделе 6 протокола (рис. 4). После этой процедуры образец повторно суспендировали в 500 мкл среды и пересчитывали. Количество живых клеток составило 4,9 × 10⁵/мл с жизнеспособностью выше 90% (рис. 3В), и образец был немедленно приступил к получению GEM в соответствии с инструкциями производителя.

Рисунок 1: Обзор обработки образцов опухоли. (А) Иллюстрация пошагового процесса протокола диссоциации тканей. (B) Разложение образца с помощью вертикально расположенного термомиксера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Лечение до и после АКК образца меланомы со слабо пигментированной пигментацией. (A) На изображении показан образец меланомы, который был отфильтрован и гранулирован после этапа разложения перед лизисом эритроцитов (RBC) с использованием ACK. (B) На изображении показан тот же образец меланомы после удаления эритроцитов с помощью буфера ACK. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Вид клеток на гемоцитометре под трипановым синим увеличением с 200-кратным увеличением. (A) Изображение, показывающее внешний вид синих клеток до обогащения живых клеток, представляющих мертвые клетки с жизнеспособностью ниже 80%. (B) Изображение, показывающее образец после обогащения живых клеток с использованием протокола Kit 1 (этап протокола 6), показывающий повышенную жизнеспособность выше 90%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Обзор выделения живого и мертвого образца клеток с использованием набора 1. Этот шаг выполняется, когда после подсчета клеток обнаруживается менее одного миллиона или более одного миллиона клеток с жизнеспособностью >10% (этап протокола 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Обзор выделения живых и мертвых клеток с использованием микрогранул для удаления мертвых клеток в наборе 2. Этот шаг выполняется, когда имеется более одного миллиона клеток и жизнеспособность составляет <10%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Валидация анализа одиночных клеток необработанного образца после одного цикла обогащения живыми клетками с использованием модифицированного протокола Kit 1. В верхней части представлен анализ UMAP, демонстрирующий согласованность групп и типов клеток до и после обогащения живых клеток. В нижней части обобщены выходные данные секвенирования, сгенерированные Cell Ranger. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Этот протокол описывает диссоциацию образцов опухолей человека или мыши в одиночную клеточную суспензию для секвенирования скРНК с использованием микрофлюидной системы 10x Genomics. При обработке тканей, которые часто происходят из редких видов рака или являются частью текущих клинических испытаний или длительных экспериментов по мышиным опухолям, образец должен быть оптимально и бережно сохранен между всеми этапами. Все шаги следует проводить быстро на льду или при 4 °C для сохранения профилей нативной клеточной РНК и предотвращения деградации, так как работа при комнатной температуре в течение длительного времени повлияет на транскриптомное качество^17,18.

Необходимо предпринять несколько шагов для того, чтобы потеря клеток на протяжении всей процедуры была минимальной, особенно при обработке биопсии с маленьким игольчатым стержнем¹⁷. Обеспечение того, чтобы все фрагменты образца опухоли были включены в процесс разложения, приведет к наиболее успешному результату, так как большее количество клеток, извлеченных из образца, улучшит будущую инкапсуляцию и секвенирование 10x Genomics, а также общее количество клеток и транскриптов, восстановленных для анализа. Если образец застрял в пробирке, в которую он попал, можно добавить среду, перевернуть пробирку и перенести в чашку для обработки. Если исходный образец фрагментирован или раствор мутный, что указывает на наличие клеток в суспензии, убедитесь, что весь образец собран для ферментативного разложения путем центрифугирования образца с раствором, в котором он прибыл, и ресуспендирования его в объеме среды для разложения (раздел 1 протокола).

При аспирации следите за тем, чтобы гранула не была потревожена на протяжении всей процедуры. При аспирации оставляйте лишний объем, который можно удалить с помощью пипетки P200. Если гранула нарушена, объем может быть выдан обратно в пробирку и повторно центрифугирован. После лизиса ACK или после удаления живого мертвеца образец может иметь объем не более 25 мкл. Таким образом, очень важно не потерять надосадочную жидкость, содержащую клетки. Правильное механическое сбраживание необходимо для того, чтобы интересующие клетки подвергались ферментативному перевариванию. Более длительное ферментативное разложение с использованием соответствующих ферментов и термосмесителя может потребоваться для образцов^{больших} размеров ^9,19,20. В то время как конкретные названия ферментов являются собственностью, производитель отмечает фермент A как нуклеазу, а ферменты H, D и R как неспецифические протеазы. Прохождение как можно большего количества образца опухоли через фильтр имеет жизненно важное значение для обеспечения максимально возможного выхода клеток. Успешная фильтрация приведет к тому, что в фильтре не будет ни одного видимого образца или будет пойман только крошечный видимый образец. Некоторые части образца могут быть не отфильтрованы, если в нем большое количество жировой или соединительной ткани. Если на верхней части фильтра видны кусочки образца, продолжайте растирать с помощью задней части поршня шприца и протолкните весь образец с помощью вращательного движения, одновременно промывая верхнюю часть фильтра большим количеством материала.

Успешность этапа лизиса эритроцитов определяется путем просмотра образца под микроскопом после того, как образец загружен на гемоцитометр для подсчета и жизнеспособности^15,21. Если в образец добавить достаточное количество ACK для удаления эритроцитов, в грануле не будет эритроцитов или видимого покраснения. Если в образце видны эритроциты, следует добавить дополнительный ACK и повторно центрифугировать образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. После этого надосадочную жидкость следует аспирировать, а гранулу клеток можно ресуспендировать в среде RPMI для визуализации и подсчета.

Чтобы обеспечить оптимальный 10-кратный прогон геномики, количество клеток должно составлять от 700 до 1200 клеток/мл (7 × 10 5-1,2 × 10⁶/мл). Высокая концентрация увеличивает скорость дуплета (две клетки в одной капле) во время образования капель. Если количество слишком велико, в образец можно добавить соответствующее количество среды и повторно загрузить его на гемоцитометр для повторного подсчета. Если концентрация слишком низкая, образец можно повторно центрифугировать при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин, отсасывать надосадочную жидкость и ресуспендировать в меньшем объеме среды перед пересчетом. Образец готов к загрузке для 10x Genomics, если жизнеспособность живых клеток превышает 80% (Рисунок 3).

Если жизнеспособность образца ниже 80%, то перед 10-кратной загрузкой геномики¹⁶ требуется процедура «живо-мертвый». Если один раунд удаления живых мертвецов не привел к тому, что процент жизнеспособности превышает 80%, следует провести еще один раунд, если всего насчитывается более 1 × 10⁵ клеток. Более высокая жизнеспособность предотвратит засорение в последующем протоколе 10x Genomics, повысит восстановление клеток и уменьшит присутствие окружающей РНК. Протокол набора 1 был оптимизирован и миниатюризирован для быстрой диссоциации небольших образцов тканей с меньшим количеством клеток. Уменьшенный объем реагентов и сокращение времени инкубации увеличивают выход клеток и предотвращают сигнатуру гена реакции на стресс (FOS, JUN и JUNB) на различных клетках ^9,22. К альтернативным методам обогащения живых клеток относятся окрашивание и сортировка. Однако это приведет к снижению выхода клеток, длительной инкубации окрашивания, что может повлиять на состояние клеток (например, антитела aCD3e активируют Т-клетки), и стрессу, вызванному давлением машины на клетки во время сортировки ^9,22. Пример, показанный на рисунке 6, иллюстрирует UMAP, сгенерированный после секвенирования 10X Genomics Gene Expression (GEX) и преобразования сгенерированных штрих-кодов клеток в файлы FASTQ, которые затем были объединены и выровнены с помощью CellRanger. Были построены графики последующих результатов секвенирования и сравнения удаления живых и мертвых веществ, демонстрирующих популяции клеток в образце до и после удаления живых и мертвых животных, а также улучшенное качество секвенирования. Образец легкого, показанный на рисунке 6, показал проблему с фракцией прочтений, так как она была ниже 70%. Это предупреждение было сгенерировано из-за высокого уровня окружающей среды РНК в популяции лизированных или мертвых клеток. Однако после удаления мертвых клеток эта ошибка больше не отсутствовала, что приводило к более высокому проценту прочтений фракций в ячейках²³.

Секвенирование РНК одиночных клеток является дорогостоящим и опасным процессом, который значительно продвинул вперед область иммунологии рака и исследований рака. Это позволяет проводить дальнейшие исследования генов, клеточных состояний и программ, экспрессируемых и подавляемых в конкретных типах клеток, раскрывая больше информации о поведении и гетерогенности раковых опухолей. Неоптимальная или низкожизнеспособная ткань с большей вероятностью приведет к получению данных низкого качества, которые могут создать артефакты, уводящие от реальности биологии опухоли, подчеркивая критическую важность правильной диссоциации опухоли и подготовки образцов.

М.С-Ф. получал финансирование от Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology и был консультантом Galvazine Therapeutics.

Это исследование было поддержано Фондом медицинских исследований Адельсона (AMRF), Альянсом по исследованию меланомы (MRA) и U54CA224068. Рисунки 1, 4 и 5 были созданы с помощью BioRender.com.