דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לניתוק מהיר של דגימות גידולים אנושיים ועכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי.

דגימות גידול אנושי מכילות שפע של מידע על המיקרו-סביבה והרפרטואר החיסוני שלהם. דיסוציאציה יעילה של דגימות רקמה אנושית לתרחיפים בני קיימא של תאים היא קלט נדרש עבור צינור ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq). שלא כמו גישות ריצוף RNA בתפזורת, scRNAseq מאפשר לנו להסיק את הטרוגניות השעתוק בדגימות גידול ברמת התא היחיד. הטמעת גישה זו בשנים האחרונות הובילה לתגליות רבות, כגון זיהוי מצבים חיסוניים ותאיים סרטניים ותוכניות הקשורות לתגובות קליניות לאימונותרפיה ולסוגים אחרים של טיפולים. יתר על כן, טכנולוגיות חד-תאיות המיושמות על רקמות מנותקות יכולות לשמש לזיהוי אזורי כרומטין נגישים רפרטואר קולטני תאי T ו-B, וביטוי חלבונים, באמצעות נוגדנים מקודדים של DNA (CITEseq).

הכדאיות והאיכות של הדגימה המנותקת הם משתנים קריטיים בעת שימוש בטכנולוגיות אלה, שכן אלה יכולים להשפיע באופן דרמטי על זיהום צולב של תאים בודדים עם RNA הסביבה, איכות הנתונים ופרשנות. יתר על כן, פרוטוקולי דיסוציאציה ארוכים יכולים להוביל לחיסול אוכלוסיות תאים רגישות ולהגברת הרגולציה של חתימת גן תגובת עקה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול דיסוציאציה אוניברסלי מהיר, אשר אומת על סוגים רבים של גידולים אנושיים ומורין. התהליך מתחיל בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית, ואחריו סינון, ליזה של דם אדום והעשרת חיים מתים, המתאימים לדגימות עם קלט נמוך של תאים (למשל, ביופסיות ליבת מחט). פרוטוקול זה מבטיח תרחיף נקי ובר קיימא של תא בודד בעל חשיבות עליונה ליצירה מוצלחת של תחליב חרוזי ג'ל (GEMs), ברקוד וריצוף.

למרות שהתפתחויות רבות בחקר הסרטן הובילו לפיתוח ולאישור ה-FDA של חומרים המכוונים לקולטנים מעכבים המתבטאים בתאי מערכת החיסון ובתאי הגידול, המכונים מעכבי חסימת נקודות ביקורת, עמידות לטיפול וזיהוי מנגנונים המניעים את תגובת המטופל נותרו מאתגרים¹. האתגר המורכב של אפיון ההטרוגניות של הגידול על המגוון המולקולרי שלו ויחסי הגומלין המורכבים בין תאי הגידול לבין המיקרו-סביבה החיסונית מחייב גישות חדשות לנתח את המערכת האקולוגית המורכבת הזו ברזולוציה של תא בודד. הבנת המורכבויות המולקולריות בתוך גידולים והמיקרו-סביבות שלהם היא חיונית לקידום אסטרטגיות טיפוליות ולפענוח הביולוגיה המורכבת העומדת בבסיס התקדמות הסרטן². ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) הפך פופולרי יותר ויותר מכיוון שהוא מספק ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך דגימות גידול מורכבות ^3,4.

הטרוגניות גידולית, הכוללת הבדלים גנטיים, אפיגנטיים ופנוטיפיים, מציבה אתגר בחשיפת נבכי הביולוגיה של הסרטן⁵. השיטות המקובלות של ריצוף RNA בתפזורת נוטות לטשטש את פרופילי הביטוי והפנוטיפים הייחודיים של אוכלוסיות תאים הטרוגניות הקיימות בתוך גידולים, שכן שיטות אלה מכניסות אותות בממוצע על פני אוכלוסיות תאים שלמות⁴. לעומת זאת, scRNA-seq מאפשר דיסקציה של סוגי תאים בודדים, וחושף ביטוי גנים מגוון, דפוסי דיכוי ומצבים תאיים שאחרת התעלמו מהם ^4,6. הנחת היסוד של scRNA-seq טמונה ביכולתו לפענח חתימות גנטיות ומולקולריות של תאים בודדים, וטומנת בחובה הבטחה עצומה בגילוי טיפולים חדשים לסרטן⁷.

על ידי פענוח פרופילי ביטוי הגנים של תאי הגידול ותאי הסטרומה ומערכת החיסון הסובבים אותם, החוקרים יכולים לזהות מטרות טיפוליות חדשות ולפתח אסטרטגיות רפואה גנטית מדויקות המותאמות לחולים בודדים⁶. יתר על כן, ניתוח הרפרטואר החיסוני בתוך המיקרו-סביבה של הגידול מספק תובנות חיוניות לגבי יחסי הגומלין בין תאי הגידול לבין גורמים חיסוניים, וסולל את הדרך להתערבויות אימונותרפיות³. למרות ההתקדמות בשימוש ב- scRNAseq על דגימות קליניות, מספר אתגרים במהלך שלבי העיבוד עלולים לפגוע בשלמות ה- RNA של התא, בכדאיות ובאיכות הנתונים שנוצרו. יתר על כן, עיבוד רקמה עם כדאיות תאים נמוכה יכול להגדיל את רמות RNA הסביבה בטיפות שנוצרו במהלך אנקפסולציה של תאים בודדים, וכתוצאה מכך זיהום צולב וביאור שגוי של סוגי תאים, בעוד פרוטוקולי דיסוציאציה ארוכים המבוצעים ב 37 ° C יכול להוביל להגברת הרגולציה של חתימת גן תגובת לחץ בסוגי תאים מרובים ^{8,9, 10}.

ההליך ההדרגתי (איור 1A) המתואר בפרוטוקול זה מתחיל בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית מהירה של גידולים, ולאחר מכן סינון והסרה של תאים מתים, בהתאם לכדאיות של כל דגימת גידול. נכון לעכשיו, הליך זה אומת במלנומה¹¹, מעי גס¹², קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר¹³, דגימות גידול בלבלב וריאות (נתונים שלא פורסמו). טכניקות אלה מבטיחות יצירה של מתלי תאים איכותיים וברי קיימא החיוניים לניתוחים במורד הזרם¹⁴. יש לציין, הסרת תאי דם אדומים, ללא RNA מסונתז, הופך הכרחי כדי לטהר את הדגימה¹⁵. הערכה מאוחרת יותר של ספירת תאים וחיסול תאים מתים משמשים כתנאי מוקדם ליצירה מוצלחת של תחליב חרוזי ג'ל 10x גנומיקה (GEM), ברקוד, ומגבירים את ההתאוששות של תעתיקים ותאים מרוצפים מבלי לסכן את ההדרה של אוכלוסיות רגישות (למשל, נויטרופילים ותאי אפיתל)¹⁶. צעדים אלה הם בסיסיים בפתיחת הפוטנציאל של ניתוח רזולוציה של תא בודד בתוך דגימות גידול ^9,10, חשיפת פרופילי ביטוי גנים חדשים וחתימות חיסוניות הנחוצות להנעת התערבויות טיפוליות חדשניות, וזיהוי נקודות תורפה חדשות של הגידול.

מחקר זה עמד בכל ההנחיות המוסדיות בנוגע לדגימת רקמות אנושיות. הסכמה מדעת התקבלה ממטופלים, ונתוני מדגם הניתנים לזיהוי הפכו לאנונימיים. הדגימות נאספות בחדר הניתוח, מונחות בתמיסה של RPMI, מלוחים או PBS, ומאושרות כסרטניות באמצעות המחלקה הפתולוגית לפני השימוש במחקר. כל השלבים, למעט כאשר צוין, צריכים להתבצע ב 4 °C (75 °F) או על קרח. עבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת עיבוד רקמות אנושיות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קבלת המדגם

1. קבל דגימת גידול מוצקה בצינור של מדיה והנח אותה על קרח.
   1. יש להנחות את צוות חדר הניתוח להעביר את הדגימה בצינור המכיל מספיק RPMI, מלוחים או PBS כדי לטבול לחלוטין את הרקמה כדי למנוע התייבשות דגימה.
      הערה: חשוב לוודא שהדגימה אינה מיובשת, מכיוון שהדבר יקטין את הכדאיות.
2. מצננים את כל הצנטריפוגות ל-4°C ומביאים את המיקסר התרמי ל-37°C.
3. הוציאו אנזימי דיסוציאציה מוכנים של גידול בבני אדם או בעכברים (Table of Materials), הפשירו במיקסר תרמי בטמפרטורה של 37°C ועברו לקרח לאחר ההפשרה.
4. אחזר aliquot 20 מ"ל של RPMI.
5. רשום מידע רלוונטי לדוגמה (לדוגמה, מזהה מטופל, ביטול מזהה, סוג מדגם).
6. מעבירים את הדגימה לצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ (מונחת על קרח) על ידי היפוך הצינור מספר פעמים ושפיכת התוכן לתוך הצלחת כדי לוודא שכל חומר הדגימה מועבר. אם הדגימה לא נמסרה במדיה עם ההגעה, הוסף מדיה RPMI טרי למנה.
   1. אם הדגימה מקוטעת, סובבו את הצינור המכיל את הדגימה בטמפרטורה של 450 × גרם, 4°C למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הדגימה ב-420 μL של סל"ד ועברו לסעיף 2.

2. עיכול מכני ואנזימטי

1. פיפטה 420 μL של מדיה מצלחת דגימה 60 מ"מ לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. נסה לכלול קטעי מדגם התלויים במדיה.
2. מעבירים את רקמת הדגימה מצלחת 60 מ"מ לצינור 1.5 מ"ל המכיל מדיה באמצעות פינצטה. חתכו את הדגימה עם מספריים נקיים בתוך הצינור כך שהחלקים יהיו בקוטר מקסימלי של 2-3 מ"מ.
3. הוסף אנזימי עיכול, שהוכנו על פי מפרטי היצרן (רשימת חומרים), לדגימה בכרכים הבאים: 42 μL של אנזים H (פרוטאזות לא ספציפיות) עבור דגימות אנושיות, אנזים D (פרוטאזות לא ספציפיות) עבור דגימות מורין, 21 μL של אנזים R (פרוטאזות לא ספציפיות), ו 5 μL של אנזים A (nuclease).
4. הוסף עוד 420 μL של מדיה מן המנה או עד סימן 1 מ"ל על הצינור. אין לחרוג מ-420 מיקרוליטר של חומרי הדפסה.
5. סובבו את הצינור במשך 5 שניות והניחו אותו במערבל תרמי הממוקם אנכית על צידו (איור 1B). יש לדגור ב-37°C, 450 סל"ד, למשך 15 דקות.
   הערה: במהלך הדגירה, הוציאו את כל 10x החומרים הגנומיים הדרושים ליצירת GEM, מכיוון שהם דורשים 30 דקות כדי להתאזן לטמפרטורת החדר

3. סינון לדוגמה

1. הניחו מסנן תאים של 50 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל והפעילו את המסנן על ידי העברת 1 מ"ל של מדיה סל"ד טרי דרכו לתוך הצינור.
2. לאחר העיכול, להעביר את הדגימה לצינור 15 מ"ל באמצעות 1,000 μL קצה פיפטה רחב שמירה נמוכה. שטפו את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיה טרייה והעבירו את המדיה למסנן כדי לוודא שכל חומר הדגימה עובר דרך המסנן.
3. להשיג מזרק פלסטיק 1 מ"ל ולהוציא רק את הבוכנה (להשליך את שארית המזרק). בעזרת החלק האחורי של בוכנה מזרק, לטחון ולדחוף את הדגימה על המסנן בתנועה סיבובית.
4. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל של מדיה וכל מדיה שנותרה מהצלחת שהכילה את הדגימה (סעיף 1) כדי לאסוף תאים שאולי התנתקו מהרקמה.
5. הניחו מסנן תאים של 30 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל, הגדילו את המסנן עם 1 מ"ל מדיה, והעבירו את תכולת הצינור המכיל את הדגימה המנותקת דרך המסנן.
   הערה: שלב זה יסיר פסולת גדולה שעלולה להיסתם או לגרום לכשל הרטבה בעת הפעלת הדגימה באמצעות שבבי מיקרופלואידים 10x Genomics.

4. ליזה של תאי דם אדומים

1. צנטריפוגה את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את התקשורת, להיזהר לא להפריע את הכדור.
2. השהה מחדש במאגר ACK Lysis כדי להסיר תאי דם אדומים (RBCs) ולהקליט את עוצמת הקול בשימוש. הנפח יהיה תלוי בגודל הגלולה ובהיקף RBCs בכדור.
   הערה: תמיסת דגימת ACK מושהית מחדש צריכה להיות חסרת צבע כאשר נוסף מספיק חיץ ACK Lysis, מכיוון שפעולה זו תנקה את תאי הדם האדומים מהדגימה.
3. צנטריפוגה את צינור הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant.
4. חזור על שלבים 4.2-4.3 לפי הצורך עד שלגלולת הדגימה לא יהיה צבע אדום נראה לעין לאחר הצנטריפוגה (איור 2). רשום את כל אמצעי האחסון הנוספים של מאגר ACK Lysis המשמש בשלב זה.
5. יש להשהות מחדש את גלולת הדגימה במדיה טרייה לקראת ספירה.

5. ספירת תאים

1. מניחים 10 μL של טריפאן כחול בצינור 1.5 מ"ל. מערבבים בעדינות את התאים המנותקים, לוקחים 10 μL של דגימה ומערבבים (1:1) עם כחול טריפאן. לטעון 10 μL על כל צד של hemocytometer ולספור את התאים.
2. רשום ריכוז תאים, ספירת תאים חיים כוללת, אחוז כדאיות ונפח מדיה סופי לאחר ספירה.
3. ודא שספירת התאים היא בין 700 ל- 1,200 תאים/μL (7 × 10,⁵- 1.2 × 10,⁶/mL) לריצה אופטימלית של 10x גנומיקה.
   1. אם הדגימה מרוכזת מדי, דללו אותה במדיה וספרו אותה מחדש.
   2. אם הדגימה מדוללת מדי, צנטריפוגו את הדגימה בטמפרטורה של 450 × גרם, 4°C למשך 5 דקות והשהו מחדש בנפח קטן יותר של מדיה.
   3. אם כדאיות התא נמוכה מ-80%, בצע הליך של מוות חי כדי להסיר תאים מתים.
   4. אם יש פחות ממיליון תאים, ראה סעיף 6.
   5. אם יש יותר ממיליון תאים והכדאיות > 10%, ראה סעיף 6.
   6. אם יש יותר ממיליון תאים והכדאיות < 10%, ראה סעיף 7.
   7. אם כדאיות התא היא מעל 80%, לשמור את התאים המעובדים על קרח ולהמשיך מיד לייצור GEM על פי הוראות היצרן.

6. הסרת תאים מתים - ערכה 1

הערה: עבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת שימוש בריאגנטים להסרת תאים מתים, מכיוון שהם יכולים להזדהם בקלות.

1. צנטריפוגה את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות.
2. הכינו את אמצעי הבידוד בצינור חרוטי של 15 מ"ל ושמרו אותו בטמפרטורת החדר: 9.8 מ"ל של PBS, 10 מיקרוליטר של CaCl₂ ו-200 מיקרוליטר של FCS מומת בחום (נוסף במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית).
3. לאחר הצנטריפוגה, לשאוף את התקשורת מן הגלולה ולהשהות מחדש ב 1 מ"ל של אמצעי הבידוד.
4. צנטריפוגה את הצינור שוב ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של אמצעי בידוד.
5. להעביר 100 μL של דגימה באמצעי בידוד לתוך באר אחת של 0.2 מ"ל PCR strip-tube.
6. במכסה מנוע בטיחות ביולוגית, יש להוסיף 10 μL של קוקטייל Annexin V ו-10 μL של קוקטייל בחירת ביוטין לבאר המכילה 100 μL של הדגימה באמצעי בידוד. פיפטה מערבבים את התמיסה ומניחים לה לשבת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.
7. לאחר 4 דקות, מערבלים את החלקיקים המגנטיים המצופים דקסטרן במשך 30 שניות. הוסף 20 μL של החרוזים ו 60 μL של מדיה בידוד לדגימה (נפח כולל של 200 μL). אם הכדאיות נמוכה מ-40%, הגדילו את כמות החרוזים עד 40 מיקרוליטר תוך התאמת נפח מדיית הבידוד (עד 40 מיקרוליטר), תוך שמירה על נפח כולל של 200 מיקרוליטר. תערובת פיפטה ואפשרו לתמיסה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
8. הניחו את צינור הרצועה על מפריד מגנטי 10x Genomics (בהגדרה גבוהה) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
9. מעבירים את הנוזל מצינור הרצועה מבלי להפריע לחרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. אין להסיר את צינור הרצועה מהמגנט.
10. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל המכיל את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיית RPMI בהתבסס על גודל הגלולה ותאי הספירה כמתואר בסעיף 5. חזור על הליך הסרת התאים המתים אם הכדאיות נשארת מתחת ל-80% (איור 3 ואיור 4).
    הערה: אין להשעות תאים באמצעי בידוד ליצירת GEM במורד הזרם, מכיוון שהסידן כלורי יפריע לתהליך האנקפסולציה ולשלב השעתוק ההפוך (RT).
11. שמור תאים מעובדים על קרח אם כדאיות התא היא מעל 80% והמשך מיד לייצור GEM בהתאם להוראות היצרן.

7. הסרת תאים מתים - ערכה 2

הערה: יש לעבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת השימוש בריאגנטים של הערכה.

1. הניחו את המיקרו-כדוריות ואת תמיסת מאגר ה-Binding Buffer 20x בתוך מכסה מנוע לבטיחות ביולוגית.
2. צנטריפוגה את השעיית הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C למשך 5 דקות.
3. הכן תמיסת חיץ 1x בתנאים סטריליים באמצעות 1 מ"ל של תמיסת מלאי חיץ מחייב 20x המוחדרת לתוך 19 מ"ל של מים מזוקקים ללא DNAse, RNAse.
4. לאחר השלמת הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט, הוסיפו את המיקרו-חרוזים, ערבבו בעדינות את הדגימה ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
   1. כאשר ספירת התאים היא 10⁷ או פחות, להוסיף 100 μL של microbeads.
   2. עבור ספירות גבוהות מ 10⁷ תאים סה"כ, להתאים את microbeads לריכוז סופי של 100 μL לכל 10⁷ תאים חיים.
5. במהלך הדגירה, השג עמודת בחירה חיובית אחת של MACS, MACS multistand, ואת המפריד המגנטי המתאים. ודא שהמפריד מפולס על המעמד הרב-ראשי ושאין מתכת או חפץ מגנטי אחר בקרבת המעמד, מכיוון שהכוח המגנטי חזק ועלול להשפיע על יעילות הסרת התאים המתים. הניחו את העמוד בנוחות במחזיק מפריד עם כנפיים הפונות החוצה.
6. לאחר הדגירה של הדגימה, אם נפח המתלה הכולל קטן מ-500 μL, יש להוסיף 1x Binding Buffer עד שהנפח הכולל יהיה 500 μL.
7. מניחים צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל מתחת לעמודה, ומעלים את העמוד עם 3 מ"ל של 1x Binding Buffer.
8. החלף את הצינור החרוטי בחרוטי חדש של 15 מ"ל לאיסוף דגימות תאים והוסף את הדגימה לעמודה, מה שמאפשר לה לזרום לחלוטין דרך העמודה.
9. שטפו את העמוד 4X3 מ"ל של 1x Binding Buffer, והוסיפו רק כביסה אחת בכל פעם לאחר שהכביסה הקודמת זרמה כולה דרך העמודה.
10. לאחר השטיפה הרביעית, צנטריפוגה את הצינור החרוטי המכיל את התאים המבודדים במשך 5 דקות ב 450 × גרם, 4 ° C. מחק את העמודה ואת מאגר האיגוד 1x הנותר.
11. השהה מחדש את תמיסת הדגימה בכמות המתאימה של מדיית RPMI בהתבסס על גודל הגלולה וספור את התאים המבודדים באמצעות השיטה המתוארת בסעיף 5 (איור 3 ואיור 5).
    1. אם הכדאיות נשארת מתחת ל- 80%, ומספר התאים הכולל הוא 10⁶ או פחות, חזור על סעיף 6.
    2. אם כדאיות התא היא מעל 80%, שמור תאים מעובדים על קרח והמשך מיד לייצור GEM בהתאם להוראות היצרן.

ביופסיית מלנומה תלויה בסל"ד התקבלה והונחה מיד על קרח. הדגימה הועברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שהכיל 420 מיקרוליטר של סל"ד ואנזימי עיכול, נטחנה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים, ועברה עיכול אנזימטי לאחר מכן במשך 15 דקות במערבל תרמי בטמפרטורה אנכית של 37°C (איור 1). לאחר העיכול, הדגימה סוננה דרך מסנן חד פעמי סטרילי של 50 מיקרומטר, והמסנן נשטף בסל"ד טרי כדי להגדיל את תפוקת התאים (איור 1). שאר חלקי הרקמה שנותרו לאחר השטיפות הושלכו, שכן מדובר בחומרים ביולוגיים לא רצויים (למשל, רקמת שומן).

בהתבסס על הצבע של כדורית התא שהתקבלה, היה צורך ב-15 מ"ל של חיץ ליזה ACK כדי להסיר את תאי הדם האדומים (איור 2). לאחר השעיה במדיית RPMI של 3 מ"ל, ספירת התאים הכוללת הייתה 1 × 10⁶/mL, עם כדאיות של <80% (איור 3A). זה הצביע על כך שהיה צורך במחזור אחד של העשרת תאים חיים באמצעות קיט 1 (פרוטוקול סעיף 6) לפני שנמשיך לטעינה גנומית פי 10 (איור 4). אם בדגימה זו היו יותר ממיליון תאים והייתה לה יכולת קיום של פחות מ-10%, הסרת התאים המתים – ערכה 2 הייתה מנוצלת במקום זאת (איור 5). הדגימה נשטפה באמצעי בידוד, ונוספו 10 μL של Annexin V וקוקטייל בחירת ביוטין, ואחריו 20 μL של החרוזים המגנטיים ו-60 μL של אמצעי בידוד, כמתואר בסעיף 6 של פרוטוקול (איור 4). לאחר הליך זה, הדגימה הושעתה מחדש ב 500 μL של מדיה וסופרה. ספירת התאים החיים הייתה 4.9 ×-10⁵/mL עם כדאיות של מעל 90% (איור 3B), והדגימה המשיכה מיד לייצור GEM בהתאם להוראות היצרן.

איור 1: סקירה כללית של עיבוד דגימות גידול. (A) המחשה של התהליך שלב אחר שלב של פרוטוקול דיסוציאציה של רקמות. (B) עיכול דגימה באמצעות מערבל תרמי הממוקם אנכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טיפול טרום ACK ופוסט-ACK בדגימת מלנומה פיגמנטית קלה. (A) התמונה מראה דגימת מלנומה שסוננה וקיבלה גלולה לאחר שלב העיכול לפני ליזה של תאי דם אדומים (RBC) באמצעות ACK. (B) התמונה מציגה את אותה דגימת מלנומה לאחר הסרת RBC באמצעות מאגר ACC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תצוגה של תאים בהמוציטומטר מתחת לכחול טריפאן מוגדלת בהגדלה של פי 200. (A) תמונה המציגה את המראה של תאים כחולים לפני העשרת תאים חיים, המייצגים תאים מתים, עם כדאיות נמוכה מ-80%. (B) תמונה המציגה את הדגימה לאחר העשרת תאים חיים באמצעות פרוטוקול Kit 1 (שלב 6 של הפרוטוקול), המראה כדאיות מוגברת מעל 90%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סקירה כללית של בידוד תאי דגימה חיים באמצעות ערכה 1. שלב זה מבוצע כאשר פחות ממיליון או יותר ממיליון תאים עם כדאיות >10% מזוהים לאחר ספירת תאים (שלב פרוטוקול 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: סקירה כללית של בידוד תאים חיים ומתים באמצעות מיקרו-כדוריות להסרת תאים מתים בערכה 2. שלב זה מבוצע כאשר יש מעל מיליון תאים ויכולת קיום של <10%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: אימות של אנליזה של תא בודד של דגימה ללא מניפולציה לאחר מחזור אחד של העשרת תאים חיים באמצעות הפרוטוקול המתוקן של Kit 1. החלק העליון מציג ניתוח UMAP המדגים עקביות בקבוצות תאים וסוגים לפני ואחרי העשרת תאים חיים. החלק התחתון מסכם את תפוקות הרצף שנוצרו על ידי Cell Ranger. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה של דגימות גידול אנושיות או מורין לתרחיף חד-תאי לצורך ריצוף scRNA באמצעות המערכת המיקרופלואידית 10x Genomics. בעיבוד רקמות שלעתים קרובות מגיעות מסרטן נדיר או שהן חלק מניסויים קליניים מתמשכים או ניסויים ארוכים בגידולי מורין, הדגימה חייבת להישמר בצורה אופטימלית וקפדנית בין כל השלבים. כל השלבים צריכים להתבצע במהירות על קרח או ב -4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פרופילי הרנ"א התאיים המקוריים ולמנוע התפרקות, שכן עבודה בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים תשפיע על איכות השעתוק^17,18.

יש לנקוט במספר צעדים כדי להבטיח אובדן תאים לאורך ההליך הוא מינימלי, במיוחד בעת עיבוד ביופסיות ליבת מחט קטנות¹⁷. הבטחת הכללת כל חלקי דגימת הגידול בעיכול תוביל לתוצאה המוצלחת ביותר, שכן יותר תאים המופקים מהדגימה ישפרו את האנקפסולציה והריצוף הגנומיים העתידיים פי 10 ואת המספר הכולל של תאים ותעתיקים שנמצאו לניתוח. אם הדגימה נתקעת בצינור אליו היא מגיעה, ניתן להוסיף מדיה, להפוך את הצינור ולהעביר אותו לצלחת לעיבוד. אם הדגימה הראשונית מקוטעת או שהתמיסה מעורפלת, דבר המעיד על נוכחות תאים בתרחיף, יש לוודא שכל הדגימה נאספת לעיכול אנזימטי על ידי צנטריפוגה של הדגימה עם התמיסה שבה הגיעה והשעייתה מחדש בנפח המדיה לעיכול (פרוטוקול סעיף 1).

בעת שאיפה, ודא כי הגלולה אינה מופרעת לאורך כל ההליך. השאירו נפח נוסף בעת השאיפה, אותו ניתן להסיר עם פיפטה P200. אם הגלולה מופרעת, ניתן לשחרר את הנפח בחזרה לתוך הצינור ולצנטריפוגה מחדש. לאחר ACK Lysis או לאחר הסרת מת חי, הדגימה עשויה להיות בנפחים נמוכים כמו 25 μL. לכן, זה קריטי לא לאבד שום supernatant המכיל את התאים. עיכול מכני תקין חיוני כדי להבטיח שהתאים המעניינים נחשפים לעיכול אנזימטי. עיכול אנזימטי ארוך יותר באמצעות אנזימים מתאימים ומערבל תרמי עשוי להיות נחוץ עבור דגימות גדולות יותר ^9,19,20. בעוד ששמות אנזימים ספציפיים הם קנייניים, היצרן מציין אנזים A כנוקלאז ואנזימים H, D ו-R כפרוטאזות לא ספציפיות. העברת כמה שיותר מדגימת הגידול דרך המסנן חיונית להבטחת תפוקת התאים הגבוהה ביותר האפשרית. סינון מוצלח יגרום לכך שהמסנן לא ילכוד בו דגימה זעירה או רק דגימה זעירה וגלויה. ייתכן שלא ניתן יהיה לסנן חלקים מסוימים של הדגימה אם יש בה כמויות גבוהות של שומן או רקמת חיבור. אם יש חלקים גלויים של הדגימה בחלק העליון של המסנן, המשיכו להשתמש בחלק האחורי של בוכנה המזרק כדי לטחון ולדחוף את כל הדגימה באמצעות תנועת הפיתול תוך כדי שטיפת החלק העליון של המסנן עם מדיה נוספת.

ההצלחה של שלב הליזה של תאי הדם האדומים נקבעת על ידי צפייה בדגימה מתחת למיקרוסקופ ברגע שהדגימה נטענת על ההמוציטומטר לצורך ספירה וכדאיות^15,21. אם מוסיפים מספיק ACK לדגימה כדי לנקות תאי דם אדומים, לא יהיו תאי דם אדומים או אדמומיות נראית לעין בכדור. אם תאי דם אדומים נראים בדגימה, יש להוסיף ACK נוסף, והדגימה צריכה להיות צנטריפוגה מחדש ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. לאחר שנעשה, יש לשאוף את הסופרנאטנט, ואת גלולת התאים ניתן להשעות מחדש במדיה RPMI עבור הדמיה וספירה.

כדי להבטיח ריצה אופטימלית של 10x גנומיקה, ספירת התאים צריכה להיות בין 700 ל -1,200 תאים / μL (7 × 10⁵- 1.2 × 10⁶/mL). ריכוז גבוה יגביר את קצב ההכפלה (שני תאים בטיפה אחת) במהלך היווצרות טיפות. אם הספירה גבוהה מדי, ניתן להוסיף כמות מתאימה של מדיה לדגימה ולטעון אותה מחדש על המוציטומטר לצורך ספירה חוזרת. אם הריכוז נמוך מדי, הדגימה יכולה להיות צנטריפוגה מחדש ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, supernatant שואף מחדש בנפח נמוך יותר של מדיה לפני ספירה מחדש. הדגימה מוכנה לטעינה עבור גנומיקה פי 10 אם יכולת הקיום של התא החי גבוהה מ-80% (איור 3).

אם כדאיות הדגימה נמוכה מ-80%, יש צורך בהליך מת חי לפני העמסת 10x Genomics¹⁶. אם סבב אחד של הסרת מתים חיים לא הביא את אחוז הכדאיות מעל 80%, יש לבצע סבב נוסף אם יש מעל 1 ×^{10 5} תאים בסך הכל. כדאיות גבוהה יותר תמנע סתימות בפרוטוקול הגנומיקה 10x שלאחר מכן, תגביר את התאוששות התאים ותפחית את נוכחות הרנ"א הסביבתי. הפרוטוקול של Kit 1 עבר אופטימיזציה וממוזער לניתוק מהיר של דגימות רקמה קטנות יותר עם ספירת תאים נמוכה יותר. הנפח המופחת של ריאגנטים וזמני הדגירה המקוצרים מגדילים את תפוקת התאים ומונעים חתימת גנים של תגובת עקה (FOS, JUN ו- JUNB) על תאים שונים ^9,22. שיטות חלופיות להעשרת תאים חיים כוללות צביעה ומיון. עם זאת, זה יגרום לתפוקת תאים מופחתת, דגירה ממושכת של צביעה, אשר עלולה להשפיע על מצבים תאיים (למשל, נוגדנים aCD3e יפעילו תאי T), ולחץ המושרה על ידי לחץ המכונה על התאים במהלך מיון ^9,22. הדוגמה המוצגת באיור 6 מדגימה UMAP שנוצר לאחר ריצוף 10X Genomics Gene Expression (GEX) והמרה של ברקודי התא שנוצרו לקובצי FASTQ ששורשרו ויושרו באמצעות CellRanger. תוצאות ריצוף עוקבות והשוואות לסילוק מתים חיים הושוותו, והראו אוכלוסיות תאים במדגם לפני ואחרי הסרת מתים חיים ושיפרו את איכות הריצוף. דגימת הריאה המוצגת באיור 6 הצביעה על בעיה עם חלק הקריאות, שכן הוא היה מתחת ל-70%. אזהרה זו נוצרה עקב RNA סביבתי גבוה באוכלוסייה של תאים ליזה או מתים. עם זאת, לאחר הסרת תאים מתים, שגיאה זו כבר לא הייתה קיימת והביאה לאחוז גבוה יותר של קריאות שבר בתאים²³.

ריצוף RNA חד-תאי הוא תהליך יקר ומסוכן שקידם באופן דרמטי את תחום האימונולוגיה של הסרטן וחקר הסרטן. היא מאפשרת חקירה נוספת של גנים, מצבים תאיים ותוכניות המבוטאות ומודחקות בסוגי תאים ספציפיים, ומגלה יותר על ההתנהגות וההטרוגניות של סרטן. רקמה תת-אופטימלית או בעלת כדאיות נמוכה נוטה יותר לייצר נתונים באיכות נמוכה שיכולים ליצור ממצאים הלוקחים מהמציאות של הביולוגיה של הגידול, תוך הדגשת החשיבות הקריטית של דיסוציאציה נכונה של הגידול והכנת הדגימה.

מ.ס-פ. קיבל מימון מבריסטול מאיירס-סקוויב, איסטארי אונקולוגיה, והיה יועץ עבור Galvazine Therapeutics.

מחקר זה נתמך על ידי קרן אדלסון למחקר רפואי (AMRF), הברית לחקר מלנומה (MRA) ו-U54CA224068. איור 1, איור 4 ואיור 5 נוצרו עם BioRender.com.