Dissociation d’échantillons de tissus tumoraux humains et murins pour le séquençage d’ARN unicellulaire

Ce protocole décrit la procédure de dissociation rapide des échantillons de tumeurs humaines et de souris pour le séquençage de l’ARN sur cellule unique.

Les échantillons de tumeurs humaines contiennent une pléthore d’informations sur leur microenvironnement et leur répertoire immunitaire. La dissociation efficace d’échantillons de tissus humains en suspensions cellulaires viables est une donnée d’entrée nécessaire pour le pipeline de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq). Contrairement aux approches de séquençage de l’ARN en vrac, le scRNAseq nous permet de déduire l’hétérogénéité transcriptionnelle dans les échantillons tumoraux au niveau de la cellule unique. L’intégration de cette approche au cours des dernières années a conduit à de nombreuses découvertes, telles que l’identification d’états cellulaires immunitaires et tumoraux et de programmes associés aux réponses cliniques aux immunothérapies et à d’autres types de traitements. De plus, les technologies unicellulaires appliquées aux tissus dissociés peuvent être utilisées pour identifier les régions de chromatine accessibles, le répertoire des récepteurs des lymphocytes T et B, et l’expression des protéines, à l’aide d’anticorps à code-barres d’ADN (CITEseq).

La viabilité et la qualité de l’échantillon dissocié sont des variables critiques lors de l’utilisation de ces technologies, car elles peuvent affecter considérablement la contamination croisée de cellules uniques avec de l’ARN ambiant, la qualité des données et l’interprétation. De plus, les protocoles de dissociation longs peuvent conduire à l’élimination de populations cellulaires sensibles et à la régulation positive d’une signature génique de réponse au stress. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu un protocole de dissociation universelle rapide, qui a été validé sur plusieurs types de tumeurs humaines et murines. Le processus commence par une dissociation mécanique et enzymatique, suivie d’une filtration, d’une lyse des globules rouges et d’un enrichissement des cellules mortes vivantes, ce qui convient aux échantillons à faible apport de cellules (par exemple, les biopsies à l’aiguille). Ce protocole garantit une suspension unicellulaire propre et viable, essentielle à la génération réussie d’émulsions de billes de gel (GEM), de codes-barres et de séquençage.

Bien que de nombreuses avancées dans la recherche sur le cancer aient conduit au développement et à l’approbation par la FDA d’agents ciblant les récepteurs inhibiteurs exprimés sur les cellules immunitaires et tumorales, connus sous le nom d’inhibiteurs de blocage de points de contrôle, la résistance au traitement et l’identification des mécanismes qui déterminent la réponse des patients restent difficiles¹. Le défi complexe de caractériser l’hétérogénéité tumorale sur sa diversité moléculaire et l’interaction complexe entre les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaire nécessite de nouvelles approches pour disséquer cet écosystème complexe à la résolution d’une seule cellule. La compréhension des subtilités moléculaires au sein des tumeurs et de leurs microenvironnements est essentielle pour faire progresser les stratégies thérapeutiques et déchiffrer la biologie complexe sous-jacente à la progression du cancer². Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est devenu de plus en plus populaire car il fournit une analyse à haute résolution de cellules individuelles dans des échantillons tumoraux complexes ^3,4.

L’hétérogénéité tumorale, englobant les diversités génétiques, épigénétiques et phénotypiques, pose un défi pour découvrir les subtilités de la biologie du cancer⁵. Les méthodes conventionnelles de séquençage de l’ARN en vrac ont tendance à masquer les profils d’expression et les phénotypes uniques des populations cellulaires hétérogènes présentes dans les tumeurs, car ces méthodes font la moyenne des signaux sur des populations cellulaires entières⁴. En revanche, le scRNA-seq permet la dissection de types de cellules individuelles, révélant diverses expressions génétiques, des modèles de répression et des états cellulaires autrement négligés ^4,6. Le principe du scRNA-seq réside dans sa capacité à décoder les signatures génétiques et moléculaires des cellules individuelles, ce qui est extrêmement prometteur pour la découverte de nouvelles thérapies contre le cancer⁷.

En déchiffrant les profils d’expression génique des cellules tumorales et des cellules stromales et immunitaires environnantes, les chercheurs peuvent identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et développer des stratégies de médecine génétique de précision adaptées à chaque patient⁶. De plus, la dissection du répertoire immunitaire au sein du microenvironnement tumoral fournit des informations cruciales sur l’interaction entre les cellules tumorales et les effecteurs immunitaires, ouvrant ainsi la voie à des interventions immunothérapeutiques³. Malgré les progrès réalisés dans l’utilisation du scRNAseq sur des échantillons cliniques, plusieurs défis au cours des étapes de traitement peuvent nuire à l’intégrité de l’ARN de la cellule, à la viabilité et à la qualité des données générées. De plus, le traitement de tissus à faible viabilité cellulaire peut augmenter les niveaux d’ARN ambiant dans les gouttelettes générées lors de l’encapsulation des cellules individuelles, entraînant une contamination croisée et une annotation incorrecte des types de cellules, tandis que les protocoles de dissociation longs effectués à 37 °C peuvent conduire à la régulation positive d’une signature génique de réponse au stress dans plusieurs types de cellules ^{8,9, 10}. Aéroport international

La procédure par étapes (Figure 1A) décrite dans ce protocole commence par une dissociation mécanique et enzymatique rapide des tumeurs, suivie d’une filtration et de l’élimination des cellules mortes, en fonction de la viabilité de chaque échantillon tumoral. À l’heure actuelle, cette procédure a été vérifiée dans des échantillons de mélanome¹¹, de colorectal¹², de carcinome épidermoïde de la tête et du cou¹³, de tumeurs du pancréas et du poumon (données non publiées). Ces techniques garantissent la génération de suspensions cellulaires viables de haute qualité, cruciales pour les analyses en aval¹⁴. Notamment, l’élimination des globules rouges, dépourvus d’ARN synthétisé, devient impérative pour purifier l’échantillon¹⁵. L’évaluation ultérieure du nombre de cellules et l’élimination des cellules mortes constituent une condition préalable à la réussite de la génération d’émulsion de billes de gel (GEM) 10x Genomics, du codage à barres, et augmentent la récupération des transcrits et des cellules séquencées sans compromettre l’exclusion des populations sensibles (par exemple, les neutrophiles et les cellules épithéliales)¹⁶. Ces étapes sont fondamentales pour libérer le potentiel de l’analyse de la résolution unicellulaire dans les échantillons tumoraux ^9,10, découvrir de nouveaux profils d’expression génique et des signatures immunitaires nécessaires pour conduire des interventions thérapeutiques innovantes, et identifier de nouvelles vulnérabilités tumorales.

Cette étude a respecté toutes les directives institutionnelles concernant l’échantillonnage de tissus humains. Le consentement éclairé des patients a été reçu et les données identifiables de l’échantillon ont été anonymisées. Les échantillons sont prélevés dans la salle d’opération, placés dans une solution de RPMI, de sérum physiologique ou de PBS, et confirmés cancéreux par le service de pathologie avant d’être utilisés dans la recherche. Toutes les étapes, sauf indication contraire, doivent être effectuées à 4 °C ou sur glace. Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lors du traitement de tissus humains. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Obtention de l’échantillon

1. Obtenez un échantillon de tumeur solide dans un tube de support et placez-le sur de la glace.
   1. Demandez au personnel de la salle d’opération de transporter l’échantillon dans un tube contenant suffisamment de RPMI, de solution saline ou de PBS pour immerger complètement le tissu afin d’éviter la déshydratation de l’échantillon.
      REMARQUE : Il est important de s’assurer que l’échantillon n’est pas desséché, car cela diminuera la viabilité.
2. Refroidissez toutes les centrifugeuses à 4 °C et amenez le mélangeur thermique à 37 °C.
3. Retirez les enzymes de dissociation tumorale humaines ou de souris préparées (tableau des matériaux), décongelez-les sur le mélangeur thermique à 37 °C et passez-les à la glace une fois décongelées.
4. Prélever une aliquote de 20 mL de RPMI.
5. Consignez les renseignements pertinents sur l’échantillon (p. ex., numéro d’identification du patient, désidentificateur, type d’échantillon).
6. Transférez l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm (placée sur de la glace) en retournant le tube plusieurs fois et en versant le contenu dans la boîte pour s’assurer que tout le matériel de l’échantillon est transféré. Si l’échantillon n’a pas été livré dans le milieu à l’arrivée, ajoutez du milieu frais dans le plat.
   1. Si l’échantillon est fragmenté, faire tourner le tube contenant l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, jeter le surnageant, remettre l’échantillon en suspension dans 420 μL de RPMI et passer à la section 2.

2. Digestion mécanique et enzymatique

1. Pipeter 420 μL de milieu de la boîte d’échantillonnage de 60 mm vers un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Essayez d’inclure des fragments d’échantillons en suspension dans le support.
2. Transférez le tissu de l’échantillon de la boîte de 60 mm dans le tube de 1,5 mL contenant le milieu à l’aide d’une pince à épiler. Découpez l’échantillon avec des ciseaux propres à l’intérieur du tube de sorte que les morceaux aient un diamètre maximal de 2 à 3 mm.
3. Ajouter à l’échantillon des enzymes de digestion, préparées conformément aux spécifications du fabricant (tableau des matériaux), dans les volumes suivants : 42 μL d’enzyme H (protéases non spécifiques) pour les échantillons humains, l’enzyme D (protéases non spécifiques) pour les échantillons murins, 21 μL d’enzyme R (protéases non spécifiques) et 5 μL d’enzyme A (nucléase).
4. Ajoutez 420 μL de support supplémentaire de la parabole ou jusqu’à 1 ml sur le tube. Ne pas dépasser 420 μL de support.
5. Vortex le tube pendant 5 s et placez-le dans un mélangeur thermique positionné verticalement sur son côté (Figure 1B). Incuber à 37 °C, 450 tr/min, pendant 15 min.
   REMARQUE : Pendant l’incubation, retirez tous les 10x matériaux génomiques nécessaires à la génération de GEM, car ils nécessitent 30 minutes pour s’équilibrer à température ambiante

3. Filtrage des échantillons

1. Placez un filtre à cellules de 50 μm sur un nouveau tube conique de 15 mL et amorcez le filtre en faisant passer 1 mL de média RPMI frais à travers celui-ci dans le tube.
2. Après la digestion, transférez l’échantillon dans le tube de 15 ml à l’aide d’une pointe de pipette large à faible rétention de 1 000 μL. Lavez le tube de 1,5 mL avec 1 mL de média frais et transférez le média sur le filtre pour vous assurer que tout le matériel de l’échantillon passe à travers le filtre.
3. Prenez une seringue en plastique de 1 ml et retirez-en seulement le piston (jetez le reste de la seringue). À l’aide de l’arrière du piston de la seringue, broyez et poussez l’échantillon sur le filtre dans un mouvement de torsion.
4. Lavez le filtre avec 5 ml de média et tout média restant de la boîte qui contenait l’échantillon (section 1) pour recueillir les cellules qui auraient pu se détacher du tissu.
5. Placez un filtre à cellules de 30 μm sur un nouveau tube conique de 15 ml, amorcez le filtre avec 1 ml de média et transférez le contenu du tube contenant l’échantillon dissocié à travers le filtre.
   REMARQUE : Cette étape éliminera les gros débris qui pourraient se boucher ou provoquer un échec de mouillage lors de l’analyse de l’échantillon à l’aide des puces microfluidiques 10x Genomics.

4. Lyse des globules rouges

1. Centrifuger l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirez le média en faisant attention de ne pas déranger la pastille.
2. Résuspendez-le dans le tampon de lyse ACK pour éliminer les globules rouges (GR) et enregistrer le volume utilisé. Le volume dépendra de la taille des granulés et de l’étendue des globules rouges dans les granulés.
   REMARQUE : La solution d’échantillon ACK remise en suspension doit être incolore lorsqu’une quantité suffisante de tampon de lyse ACK a été ajoutée, car cela éliminera les globules rouges de l’échantillon.
3. Centrifuger le tube d’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, et aspirer le surnageant.
4. Répétez les étapes 4.2 et 4.3 au besoin jusqu’à ce que la pastille d’échantillon n’ait plus de couleur rouge visible après centrifugation (Figure 2). Enregistrez tous les volumes supplémentaires de mémoire tampon de lyse ACK utilisés dans cette étape.
5. Remettre en suspension la pastille d’échantillon dans un milieu frais en préparation du comptage.

5. Comptage des cellules

1. Placer 10 μL de bleu trypan dans un tube de 1,5 mL. Mélangez délicatement les cellules dissociées, prélevez 10 μL d’échantillon et mélangez (1:1) avec le bleu de trypan. Chargez 10 μL de chaque côté d’un hémocytomètre et comptez les cellules.
2. Enregistrez la concentration des cellules, le nombre total de cellules vivantes, le pourcentage de viabilité et le volume final du milieu après le comptage.
3. Assurez-vous que le nombre de cellules se situe entre 700 et 1 200 cellules/μL (7 × 10⁵ - 1,2 × 10⁶/mL) pour une analyse génomique optimale de 10x.
   1. Si l’échantillon est trop concentré, diluez-le avec un milieu et recomptez-le.
   2. Si l’échantillon est trop dilué, centrifugez-le à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, et mettez-le en suspension dans un volume de milieu moindre.
   3. Si la viabilité cellulaire est inférieure à 80 %, effectuez une procédure de mort vivante pour éliminer les cellules mortes.
   4. S’il y a moins d’un million de cellules, voir section 6.
   5. S’il y a plus d’un million de cellules et que la viabilité > 10 %, voir rubrique 6.
   6. S’il y a plus d’un million de cellules et que la viabilité < 10 %, voir rubrique 7.
   7. Si la viabilité des cellules est supérieure à 80 %, conservez les cellules traitées sur de la glace et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

6. Élimination des cellules mortes - Kit 1

REMARQUE : Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lorsque vous utilisez les réactifs d’élimination des cellules mortes, car ceux-ci peuvent facilement être contaminés.

1. Centrifuger l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min.
2. Préparez le milieu d’isolement dans un tube conique de 15 ml et conservez-le à température ambiante : 9,8 ml de PBS, 10 μL de CaCl₂ et 200 μL de FCS inactivé par la chaleur (ajouté dans une hotte de biosécurité).
3. Après la centrifugation, aspirer le média de la pastille et le remettre en suspension dans 1 mL du média d’isolement.
4. Centrifugez à nouveau le tube à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de milieu d’isolement.
5. Transvaser 100 μL d’échantillon dans un milieu d’isolement dans un puits d’un tube à bandelettes PCR de 0,2 mL.
6. Dans une hotte de biosécurité, ajoutez 10 μL d’Annexin V Cocktail et 10 μL de Biotin Selection Cocktail dans le puits contenant 100 μL de l’échantillon dans un milieu isolant. Mélangez la solution à la pipette et laissez-la reposer à température ambiante pendant 4 min.
7. Après 4 min, vortex les particules magnétiques enrobées de dextran pendant 30 s. Ajouter 20 μL de billes et 60 μL de milieu d’isolement à l’échantillon (un volume total de 200 μL). Si la viabilité est inférieure à 40 %, augmentez la quantité de billes jusqu’à 40 μL tout en ajustant le volume du milieu d’isolement (jusqu’à 40 μL), en maintenant un volume total de 200 μL. Mélangez à la pipette et laissez la solution reposer à température ambiante pendant 3 min.
8. Placez le tube de la bandelette sur un séparateur magnétique Genomics 10x (sur le réglage élevé) pendant 5 min à température ambiante.
9. Transférez le liquide du tube à bandelettes sans déranger les billes dans un nouveau tube à microcentrifugation à faible liaison de 1,5 ml. Ne retirez pas le tube ruban de l’aimant.
10. Centrifuger le tube de 1,5 mL contenant l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu RPMI en fonction de la taille de la pastille et des cellules de numération, comme décrit à la section 5. Répétez la procédure d’élimination des cellules mortes si la viabilité reste inférieure à 80 % (Figure 3 et Figure 4).
    REMARQUE : Ne mettez pas les cellules en suspension dans un milieu d’isolement pour la génération de GEM en aval, car le chlorure de calcium interférera avec le processus d’encapsulation et l’étape de transcription inverse (RT).
11. Conservez les cellules traitées sur de la glace si la viabilité des cellules est supérieure à 80 % et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

7. Élimination des cellules mortes - Kit 2

REMARQUE : Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lors de l’utilisation des réactifs du kit.

1. Placez les microbilles et la solution mère de tampon de liaison 20x à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.
2. Centrifuger la suspension d’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min.
3. Préparez 1 solution tampon dans des conditions stériles en utilisant 1 mL de la solution mère du tampon de liaison 20 fois pipetée dans 19 mL d’eau distillée exempte d’ADN et d’ARNse.
4. Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant, ajoutez les microbilles, mélangez doucement l’échantillon et incubez à température ambiante pendant 15 min.
   1. Lorsque le nombre de cellules est de 10^{à 7} ou moins, ajoutez 100 μL de microbilles.
   2. Pour un dénombrement supérieur à 10⁷ cellules totales, ajuster les microbilles pour obtenir une concentration finale de 100 μL par 10⁷ cellules vivantes.
5. Pendant l’incubation, obtenir une colonne de sélection positive MACS, un multisupport MACS et le séparateur magnétique correspondant. Assurez-vous que le séparateur est mis à niveau sur le support multiple et qu’aucun autre objet métallique ou magnétique ne se trouve à proximité du support, car la force magnétique est puissante et pourrait affecter l’efficacité d’élimination des cellules mortes. Placez la colonne bien ajustée dans un support de séparateur avec les ailes vers l’extérieur.
6. Après l’incubation de l’échantillon, si le volume total de remise en suspension est inférieur à 500 μL, ajoutez 1 tampon de liaison jusqu’à ce que le volume total soit de 500 μL.
7. Placez un tube conique de 15 ml sous la colonne et amorcez la colonne avec 3 ml de 1 tampon de liaison.
8. Remplacez le tube conique par un nouveau tube conique de 15 mL pour le prélèvement d’échantillons cellulaires et ajoutez l’échantillon à la colonne, ce qui lui permet de s’écouler complètement à travers la colonne.
9. Lavez la colonne 4 x 3 ml de 1 tampon de reliure, en ajoutant seulement un lavage à la fois après que le lavage précédent ait entièrement coulé à travers la colonne.
10. Après le quatrième lavage, centrifuger le tube conique contenant les cellules isolées pendant 5 min à 450 × g, 4 °C. Jetez la colonne et le 1x tampon de liaison restant.
11. Remettre en suspension la solution d’échantillon dans la quantité appropriée de milieu RPMI en fonction de la taille des pastilles et compter les cellules isolées à l’aide de la méthode décrite à la section 5 (figure 3 et figure 5).
    1. Si la viabilité reste inférieure à 80 % et que le nombre total de cellules est de 10⁶ ou moins, répéter la section 6.
    2. Si la viabilité cellulaire est supérieure à 80 %, conservez les cellules traitées sur de la glace et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

Une biopsie du mélanome suspendue dans un RPMI a été obtenue et immédiatement placée sur de la glace. L’échantillon a été transféré dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 420 μL de RPMI et d’enzymes de digestion, haché en petits morceaux à l’aide de ciseaux, puis soumis à une digestion enzymatique pendant 15 min dans un mélangeur thermique positionné verticalement à 37 °C (figure 1). Après la digestion, l’échantillon a été filtré à travers un filtre stérile jetable de 50 μm, et le filtre a été lavé avec du RPMI frais pour augmenter le rendement cellulaire (figure 1). Les parties restantes du tissu qui restaient après les lavages ont été jetées, car il s’agit de matières biologiques indésirables (par exemple, du tissu adipeux).

D’après la couleur de la pastille cellulaire résultante, 15 mL de tampon de lyse ACK ont été nécessaires pour éliminer les globules rouges (figure 2). Après la remise en suspension dans 3 mL de milieu RPMI, le nombre total de cellules était de 1 × 10⁶/mL, avec une viabilité de <80 % (figure 3A). Cela indiquait qu’un cycle d’enrichissement de cellules vivantes à l’aide du kit 1 (section 6 du protocole) était nécessaire avant de passer à une charge génomique 10x (Figure 4). Si cet échantillon contenait plus de 1 million de cellules et avait une viabilité inférieure à 10 %, le kit d’élimination des cellules mortes 2 aurait été utilisé à la place (figure 5). L’échantillon a été lavé à l’aide d’un milieu d’isolement, et 10 μL d’Annexine V et un cocktail de sélection de biotine ont été ajoutés, suivis de 20 μL de billes magnétiques et de 60 μL de milieu d’isolement, comme décrit à la section 6 du protocole (figure 4). Après cette procédure, l’échantillon a été remis en suspension dans 500 μL de milieu et recompté. Le nombre de cellules vivantes était de 4,9 × 10⁵/mL avec une viabilité supérieure à 90 % (figure 3B), et l’échantillon est immédiatement passé à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

Figure 1 : Vue d’ensemble du traitement des échantillons tumoraux. (A) Illustration du processus étape par étape du protocole de dissociation tissulaire. (B) La digestion d’un échantillon à l’aide d’un mélangeur thermique positionné verticalement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Traitement pré-ACK et post-ACK d’un échantillon de mélanome légèrement pigmenté. (A) L’image montre un échantillon de mélanome qui a été filtré et granulé après l’étape de digestion avant la lyse des globules rouges (GR) à l’aide de l’ACK. (B) L’image montre le même échantillon de mélanome après l’élimination des globules rouges à l’aide du tampon ACK. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vue des cellules sur l’hémocytomètre sous bleu trypan zoomé à un grossissement de 200x. (A) Image montrant l’apparition de cellules bleues avant l’enrichissement en cellules vivantes, représentant des cellules mortes, avec une viabilité inférieure à 80%. (B) Image montrant l’échantillon après enrichissement de cellules vivantes à l’aide du protocole du Kit 1 (étape 6 du protocole), montrant une viabilité accrue supérieure à 90 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Vue d’ensemble de l’isolement des cellules d’échantillon de mort-vivant à l’aide du kit 1. Cette étape est effectuée lorsque moins d’un million ou plus d’un million de cellules avec une viabilité >10 % sont détectées après le comptage des cellules (étape 5 du protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Vue d’ensemble de l’isolement des cellules mortes vivantes à l’aide des microbilles d’élimination des cellules mortes du kit 2. Cette étape est réalisée lorsqu’il y a plus d’un million de cellules et une viabilité de <10 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Validation de l’analyse sur cellule unique d’un échantillon non manipulé après un cycle d’enrichissement de cellules vivantes à l’aide du protocole modifié du Kit 1. La partie supérieure montre une analyse UMAP démontrant la cohérence des groupes et des types de cellules avant et après l’enrichissement des cellules vivantes. La partie inférieure résume les résultats de séquençage générés par Cell Ranger. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce protocole décrit la dissociation d’échantillons tumoraux humains ou murins en une suspension unicellulaire pour le séquençage de l’ARNsc à l’aide du système microfluidique 10x Genomics. Lors du traitement de tissus qui proviennent souvent de cancers rares ou qui font partie d’essais cliniques en cours ou de longues expériences pour des tumeurs murines, l’échantillon doit être conservé de manière optimale et soigneuse entre toutes les étapes. Toutes les étapes doivent être effectuées rapidement sur de la glace ou à 4 °C pour conserver les profils d’ARN cellulaire natifs et éviter la dégradation, car le travail à température ambiante pendant de longues périodes affectera la qualité transcriptomique^17,18.

Plusieurs mesures doivent être prises pour s’assurer que la perte de cellules tout au long de la procédure est minimale, en particulier lors du traitement de petites biopsies à l’aiguille¹⁷. S’assurer que tous les fragments de l’échantillon de tumeur sont inclus dans la digestion conduira au résultat le plus réussi, car plus de cellules extraites de l’échantillon améliorera l’encapsulation et le séquençage futurs de la génomique 10x et le nombre total de cellules et de transcrits récupérés pour l’analyse. Si l’échantillon se loge dans le tube dans lequel il arrive, un milieu peut être ajouté, le tube inversé et transféré dans la boîte pour le traitement. Si l’échantillon initial est fragmenté ou si la solution est trouble, indiquant la présence de cellules en suspension, assurez-vous que tout l’échantillon est prélevé pour la digestion enzymatique en centrifugant l’échantillon avec la solution dans laquelle il est arrivé et en le remettant en suspension dans le volume du milieu pour la digestion (protocole section 1).

Lors de l’aspiration, assurez-vous que la pastille n’est pas perturbée tout au long de la procédure. Laissez un volume supplémentaire lors de l’aspiration, qui peut être retiré avec une pipette P200. Si le granulé est perturbé, le volume peut être réinjecté dans le tube et recentriflé. Après la lyse ACK ou après l’élimination des aliments morts vivants, l’échantillon peut avoir des volumes aussi faibles que 25 μL. Ainsi, il est essentiel de ne pas perdre de surnageant contenant les cellules. Une bonne digestion mécanique est essentielle pour s’assurer que les cellules d’intérêt sont exposées à la digestion enzymatique. Une digestion enzymatique plus longue à l’aide des enzymes appropriées et d’un mélangeur thermique peut être nécessaire pour les échantillons de plus grande taille ^9,19,20. Bien que les noms spécifiques d’enzymes soient exclusifs, le fabricant note l’enzyme A comme une nucléase et les enzymes H, D et R comme des protéases non spécifiques. Il est essentiel de faire passer la plus grande partie de l’échantillon tumoral à travers le filtre pour garantir le rendement cellulaire le plus élevé possible. Un filtrage réussi fera en sorte que le filtre ne contiendra aucun échantillon visible ou seulement un minuscule échantillon visible. Certains morceaux de l’échantillon peuvent ne pas pouvoir être filtrés s’il contient de grandes quantités de tissu adipeux ou conjonctif. S’il y a des morceaux visibles de l’échantillon sur le dessus du filtre, continuez à utiliser l’arrière du piston de la seringue pour broyer et pousser tout l’échantillon à l’aide du mouvement de torsion tout en lavant le haut du filtre avec plus de média.

Le succès de l’étape de lyse des globules rouges est déterminé par l’observation de l’échantillon sous le microscope une fois que l’échantillon est chargé sur l’hémocytomètre pour le comptage et la viabilité^15,21. Si suffisamment d’ACK est ajouté à l’échantillon pour éliminer les globules rouges, il n’y aurait pas de globules rouges ou de rougeur visible dans la pastille. Si des globules rouges sont visibles dans l’échantillon, des cellules ACK supplémentaires doivent être ajoutées et l’échantillon doit être recentriflé à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Une fois cela fait, le surnageant doit être aspiré et la pastille de cellules peut être remise en suspension dans un milieu RPMI pour la visualisation et le comptage.

Pour assurer une exécution génomique 10x optimale, le nombre de cellules doit se situer entre 700 et 1 200 cellules/μL (7 × 10⁵- 1,2 × 10⁶/mL). Une concentration élevée augmentera le taux de doublet (deux cellules dans une gouttelette) lors de la formation des gouttelettes. Si le nombre est trop élevé, une quantité appropriée de milieu peut être ajoutée à l’échantillon et rechargée sur un hémocytomètre pour le recomptage. Si la concentration est trop faible, l’échantillon peut être recentriflé à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, le surnageant aspiré et remis en suspension dans un volume inférieur de milieu avant d’être recompté. L’échantillon est prêt à être chargé pour la génomique 10x si la viabilité des cellules vivantes est supérieure à 80 % (Figure 3).

Si la viabilité de l’échantillon est inférieure à 80 %, une procédure de mort vivante est nécessaire avant 10 fois la charge génomique¹⁶. Si un cycle d’élimination des morts-vivants n’a pas porté le pourcentage de viabilité au-dessus de 80 %, un autre cycle doit être effectué s’il y a plus de 1 × 10⁵ cellules au total. Une viabilité plus élevée permettra d’éviter les obstructions dans le protocole génomique 10x ultérieur, d’augmenter la récupération cellulaire et de réduire la présence d’ARN ambiant. Le protocole du kit 1 a été optimisé et miniaturisé pour dissocier rapidement des échantillons de tissus plus petits avec un nombre de cellules plus faible. Le volume réduit de réactifs et les temps d’incubation raccourcis augmentent le rendement cellulaire et empêchent une signature génique de réponse au stress (FOS, JUN et JUNB) sur diverses cellules ^9,22. Les méthodes alternatives pour enrichir les cellules vivantes comprennent la coloration et le tri. Cependant, cela entraînerait une réduction du rendement cellulaire, une incubation prolongée de la coloration, qui pourrait affecter les états cellulaires (par exemple, les anticorps aCD3e activeront les cellules T) et un stress induit par la pression de la machine sur les cellules pendant le tri ^9,22. L’exemple illustré à la figure 6 illustre un UMAP généré après le séquençage de l’expression génique génomique 10X (GEX) et la conversion des codes-barres de cellules générés en fichiers FASTQ qui ont ensuite été concaténés et alignés via CellRanger. Les résultats de séquençage ultérieurs et les comparaisons d’élimination des morts-vivants ont été tracés, démontrant les populations cellulaires dans un échantillon avant et après l’élimination des morts-vivants et l’amélioration de la qualité du séquençage. L’échantillon pulmonaire illustré à la figure 6 indiquait un problème avec la fraction des lectures, car elle était inférieure à 70 %. Cet avertissement a été généré en raison d’un taux élevé d’ARN ambiant dans une population de cellules lysées ou mortes. Cependant, après l’élimination des cellules mortes, cette erreur n’était plus présente et a entraîné un pourcentage plus élevé de fractions lues dans les cellules²³.

Le séquençage de l’ARN sur cellule unique est un processus coûteux et précaire qui a fait progresser considérablement le domaine de l’immunologie du cancer et de la recherche sur le cancer. Il permet d’interroger davantage les gènes, les états cellulaires et les programmes exprimés et réprimés dans des types cellulaires spécifiques, en divulguant davantage sur le comportement et l’hétérogénéité des cancers. Les tissus sous-optimaux ou à faible viabilité sont plus susceptibles de générer des données de mauvaise qualité qui peuvent créer des artefacts qui éloignent la réalité de la biologie tumorale, soulignant l’importance cruciale d’une dissociation tumorale et d’une préparation des échantillons appropriées.

M.S-F. a reçu un financement de Bristol Myers-Squibb, d’Istari Oncology, et a été consultant pour Galvazine Therapeutics.

Cette étude a été financée par la Fondation Adelson pour la recherche médicale (AMRF), l’Alliance de recherche sur le mélanome (MRA) et U54CA224068. Les figures 1, 4 et 5 ont été créées à l’aide de BioRender.com.