Dissoziation von humanen und Maus-Tumorgewebeproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur schnellen Dissoziation von menschlichen und Maustumorproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Menschliche Tumorproben enthalten eine Fülle von Informationen über ihre Mikroumgebung und ihr Immunrepertoire. Die effektive Dissoziation von humanen Gewebeproben in lebensfähige Zellsuspensionen ist ein erforderlicher Input für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungspipeline (scRNAseq). Im Gegensatz zu Bulk-RNA-Sequenzierungsansätzen ermöglicht uns scRNAseq, die transkriptionelle Heterogenität in Tumorproben auf Einzelzellebene abzuleiten. Die Einbeziehung dieses Ansatzes in den letzten Jahren hat zu vielen Entdeckungen geführt, wie z. B. der Identifizierung von Immun- und Tumorzellzuständen und -programmen, die mit dem klinischen Ansprechen auf Immuntherapien und andere Arten von Behandlungen verbunden sind. Darüber hinaus können Einzelzelltechnologien, die auf dissoziierte Gewebe angewendet werden, verwendet werden, um zugängliche Chromatinregionen, das T- und B-Zell-Rezeptorrepertoire und die Expression von Proteinen unter Verwendung von DNA-Barcoded-Antikörpern (CITEseq) zu identifizieren.

Die Lebensfähigkeit und Qualität der dissoziierten Probe sind kritische Variablen bei der Verwendung dieser Technologien, da diese die Kreuzkontamination einzelner Zellen mit Umgebungs-RNA, die Qualität der Daten und die Interpretation dramatisch beeinflussen können. Darüber hinaus können lange Dissoziationsprotokolle zur Eliminierung empfindlicher Zellpopulationen und zur Hochregulierung einer Stressreaktions-Gensignatur führen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein schnelles universelles Dissoziationsprotokoll entwickelt, das an mehreren Arten von menschlichen und murinen Tumoren validiert wurde. Der Prozess beginnt mit der mechanischen und enzymatischen Dissoziation, gefolgt von der Filtration, der roten Blutlyse und der Anreicherung von lebenden Toten, die für Proben mit geringem Zelleinsatz (z. B. Nadelkernbiopsien) geeignet ist. Dieses Protokoll gewährleistet eine saubere und lebensfähige Einzelzellsuspension, die für die erfolgreiche Erzeugung von Gel-Bead-In-Emulsionen (GEMs), Barcoding und Sequenzierung von größter Bedeutung ist.

Obwohl viele Fortschritte in der Krebsforschung zur Entwicklung und Zulassung von Wirkstoffen geführt haben, die auf inhibitorische Rezeptoren abzielen, die auf Immun- und Tumorzellen exprimiert werden, sogenannte Checkpoint-Blockade-Inhibitoren, bleiben die Therapieresistenz und die Identifizierung von Mechanismen, die das Ansprechen der Patienten beeinflussen, eine Herausforderung¹. Die komplexe Herausforderung, die Heterogenität von Tumoren anhand ihrer molekularen Diversität und des komplizierten Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der Immunmikroumgebung zu charakterisieren, erfordert neue Ansätze, um dieses komplexe Ökosystem mit Einzelzellauflösung zu entschlüsseln. Das Verständnis der molekularen Feinheiten in Tumoren und ihren Mikroumgebungen ist entscheidend für die Weiterentwicklung therapeutischer Strategien und die Entschlüsselung der komplexen Biologie, die dem Fortschreiten von Krebs zugrunde liegt². Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erfreut sich zunehmender Beliebtheit, da sie eine hochauflösende Analyse einzelner Zellen in komplexen Tumorproben ermöglicht ^3,4.

Die Tumorheterogenität, die genetische, epigenetische und phänotypische Unterschiede umfasst, stellt eine Herausforderung dar, um die Feinheiten der Krebsbiologie aufzudecken⁵. Die herkömmlichen Methoden der Bulk-RNA-Sequenzierung neigen dazu, die einzigartigen Expressionsprofile und Phänotypen heterogener Zellpopulationen in Tumoren zu verschleiern, da diese Methoden Signale über ganze Zellpopulationen^hinweg mitteln4. Im Gegensatz dazu ermöglicht scRNA-seq die Dissektion einzelner Zelltypen und enthüllt so unterschiedliche Genexpressionen, Repressionsmuster und zelluläre Zustände, die sonst übersehen werden ^4,6. Die Prämisse von scRNA-seq liegt in seiner Fähigkeit, die genetischen und molekularen Signaturen einzelner Zellen zu entschlüsseln, was bei der Entdeckung neuer Krebstherapeutika äußerst vielversprechend ist⁷.

Durch die Entschlüsselung der Genexpressionsprofile von Tumorzellen und den umgebenden Stroma- und Immunzellen können Forscher neue therapeutische Ziele identifizieren und auf den einzelnen Patienten zugeschnittene Strategien für die Präzisionsmedizin entwickeln⁶. Darüber hinaus liefert die Entschlüsselung des Immunrepertoires innerhalb der Tumormikroumgebung entscheidende Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und Immuneffektoren und ebnet den Weg für immuntherapeutische Interventionen³. Trotz der Fortschritte bei der Verwendung von scRNAseq bei klinischen Proben können mehrere Herausforderungen während der Verarbeitungsschritte die RNA-Integrität, Lebensfähigkeit und Qualität der generierten Daten der Zelle beeinträchtigen. Darüber hinaus kann die Verarbeitung von Gewebe mit geringer Zellviabilität den RNA-Gehalt in der Umgebung, die bei der Verkapselung einzelner Zellen erzeugt werden, erhöhen, was zu einer Kreuzkontamination und einer falschen Annotation von Zelltypen führt, während lange Dissoziationsprotokolle, die bei 37 °C durchgeführt werden, zu einer Hochregulierung einer Stressreaktions-Gensignatur in mehreren Zelltypen führen können ^{8,9, 10}. Urheberrecht

Das in diesem Protokoll beschriebene schrittweise Verfahren (Abbildung 1A) beginnt mit einer schnellen mechanischen und enzymatischen Dissoziation von Tumoren, gefolgt von der Filtration und der Entfernung abgestorbener Zellen, abhängig von der Lebensfähigkeit jeder Tumorprobe. Gegenwärtig wurde dieses Verfahren an Melanom¹¹, kolorektal¹², Plattenepithelkarzinom¹³ im Kopf- und Halsbereich, Pankreas- und Lungentumorproben (unveröffentlichte Daten) verifiziert. Diese Techniken gewährleisten die Erzeugung hochwertiger lebensfähiger Zellsuspensionen, die für nachgelagerte Analysen von entscheidender Bedeutung^{sind 14}. Insbesondere wird die Entfernung roter Blutkörperchen, die keine synthetisierte RNA enthalten, zwingend erforderlich, um die Probe^{zu reinigen 15}. Die anschließende Auswertung der Zellzahlen und die Eliminierung toter Zellen dienen als Voraussetzung für die erfolgreiche Generierung und das Barcoding der 10x Genomics Gel Bead-in Emulsion (GEM) und erhöhen die Rückgewinnung von Transkripten und sequenzierten Zellen, ohne den Ausschluss empfindlicher Populationen (z. B. Neutrophile und Epithelzellen) zu ^gefährden16. Diese Schritte sind von grundlegender Bedeutung, um das Potenzial der Einzelzellauflösungsanalyse in Tumorproben zu erschließen ^9,10, neue Genexpressionsprofile und Immunsignaturen aufzudecken, die für innovative therapeutische Interventionen erforderlich sind, und neue Tumoranfälligkeiten zu identifizieren.

Diese Studie entsprach allen institutionellen Richtlinien bezüglich der Entnahme von humanem Gewebe. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde eingeholt und identifizierbare Probendaten wurden anonymisiert. Die Proben werden im Operationssaal entnommen, in eine Lösung aus RPMI, Kochsalzlösung oder PBS gegeben und über die Pathologie als krebserregend bestätigt, bevor sie in der Forschung verwendet werden. Alle Schritte sollten, sofern nicht anders angegeben, bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt werden. Arbeiten Sie bei der Verarbeitung von menschlichem Gewebe in einer Biosicherheitshaube. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Entnahme der Probe

1. Entnehmen Sie eine solide Tumorprobe in einem Röhrchen mit Medium und legen Sie sie auf Eis.
   1. Weisen Sie das Personal im Operationssaal an, die Probe in einem Röhrchen zu transportieren, das genügend RPMI, Kochsalzlösung oder PBS enthält, um das Gewebe vollständig einzutauchen und eine Austrocknung der Probe zu vermeiden.
      HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Probe nicht ausgetrocknet ist, da dies die Lebensfähigkeit verringert.
2. Alle Zentrifugen auf 4 °C abkühlen und den Thermomischer auf 37 °C bringen.
3. Nehmen Sie die vorbereiteten Tumordissoziationsenzyme von Menschen oder Mäusen heraus (Tabelle der Materialien), tauen Sie sie auf dem 37 °C heißen Thermomischer auf und stellen Sie sie nach dem Auftauen auf Eis.
4. Entnehmen Sie ein 20-ml-Aliquot von RPMI.
5. Erfassen Sie relevante Probeninformationen (z. B. Patienten-ID, De-Identifikator, Probentyp).
6. Übertragen Sie die Probe in eine 60-mm-Gewebekulturschale (auf Eis gestellt), indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen und den Inhalt in die Schale gießen, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenmaterial übertragen wird. Wenn die Probe bei der Ankunft nicht in Form eines Mediums geliefert wurde, legen Sie frisches RPMI-Medium in die Schale.
   1. Wenn die Probe fragmentiert ist, drehen Sie das Röhrchen mit der Probe 5 Minuten lang bei 450 × g, 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Probe in 420 μl RPMI und gehen Sie zu Abschnitt 2.

2. Mechanischer und enzymatischer Aufschluss

1. Pipettieren Sie 420 μl Medium aus der 60-mm-Probenschale in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Versuchen Sie, alle Beispielfragmente einzuschließen, die in den Medien aufgehängt sind.
2. Übertragen Sie das Probengewebe mit einer Pinzette aus der 60-mm-Schale in das 1,5-ml-Röhrchen mit dem Medium. Schneiden Sie die Probe mit einer sauberen Schere im Inneren des Röhrchens so auf, dass die Stücke einen Durchmesser von maximal 2-3 mm haben.
3. Geben Sie der Probe Verdauungsenzyme, die gemäß den Herstellerspezifikationen (Materialtabelle) hergestellt wurden, in den folgenden Volumina hinzu: 42 μl Enzym H (unspezifische Proteasen) für Humanproben, Enzym D (unspezifische Proteasen) für murine Proben, 21 μl Enzym R (unspezifische Proteasen) und 5 μl Enzym A (Nuklease).
4. Fügen Sie weitere 420 μl Medium aus der Schale oder bis zur 1-ml-Markierung auf dem Röhrchen hinzu. Überschreiten Sie nicht 420 μl des Mediums.
5. Wirbeln Sie das Rohr 5 s lang vor und legen Sie es in einen thermischen Mischer, der senkrecht auf der Seite positioniert ist (Abbildung 1B). Inkubieren Sie bei 37 °C, 450 U/min, für 15 min.
   HINWEIS: Nehmen Sie während der Inkubation alle 10x Genomics-Materialien heraus, die für die GEM-Generierung benötigt werden, da diese 30 Minuten benötigen, um sich auf Raumtemperatur auszugleichen

3. Filterung von Stichproben

1. Setzen Sie einen 50-μm-Zellfilter auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen und entleeren Sie den Filter, indem Sie 1 ml frisches RPMI-Medium in das Röhrchen leiten.
2. Nach dem Aufschluss wird die Probe mit einer breiten 1.000-μl-Pipettenspitze mit geringer Retention in das 15-ml-Röhrchen überführt. Waschen Sie das 1,5-ml-Röhrchen mit 1 mL frischem Medium und geben Sie das Medium in den Filter, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenmaterial durch den Filter geleitet wird.
3. Besorgen Sie sich eine 1-ml-Kunststoffspritze und nehmen Sie nur den Kolben heraus (entsorgen Sie den Rest der Spritze). Mahlen Sie die Probe mit der Rückseite des Spritzenkolbens und schieben Sie sie in einer Drehbewegung auf den Filter.
4. Waschen Sie den Filter mit 5 ml Medium und allen verbleibenden Medien aus der Schale, in der sich die Probe befand (Abschnitt 1), um alle Zellen zu sammeln, die sich möglicherweise vom Gewebe gelöst haben.
5. Setzen Sie einen 30-μm-Küvettenfilter auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen, grundieren Sie den Filter mit 1 mL Medium und übertragen Sie den Inhalt des Röhrchens mit der dissoziierten Probe durch den Filter.
   HINWEIS: Dieser Schritt entfernt große Ablagerungen, die verstopfen oder einen Benetzungsfehler verursachen könnten, wenn die Probe mit den mikrofluidischen Chips von 10x Genomics ausgeführt wird.

4. Lyse der roten Blutkörperchen

1. Die Probe wird bei 450 × g, 4 °C für 5 min zentrifugiert. Saugen Sie das Medium an und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
2. Resuspendieren Sie in ACK Lysis Puffer, um rote Blutkörperchen (RBCs) zu entfernen und das verwendete Volumen aufzuzeichnen. Das Volumen hängt von der Pelletgröße und dem Ausmaß der Erythrozyten im Pellet ab.
   HINWEIS: Die resuspendierte ACK-Probenlösung sollte farblos sein, wenn genügend ACK-Lysepuffer hinzugefügt wurde, da dadurch die roten Blutkörperchen aus der Probe entfernt werden.
3. Das Probenröhrchen wird 5 Minuten lang bei 450 × g und 4 ΰC zentrifugiert und der Überstand aspiriert.
4. Die Schritte 4.2 bis 4.3 werden bei Bedarf wiederholt, bis das Probenpellet nach der Zentrifugation keine sichtbare rote Farbe mehr aufweist (Abbildung 2). Notieren Sie alle zusätzlichen Volumina des ACK-Lysepuffers, die in diesem Schritt verwendet wurden.
5. Resuspendieren Sie das Probenpellet in frischem Medium, um es für die Zählung vorzubereiten.

5. Zellzählung

1. Geben Sie 10 μl Trypanblau in ein 1,5-ml-Röhrchen. Mischen Sie die dissoziierten Zellen vorsichtig, entnehmen Sie 10 μl Probe und mischen Sie (1:1) mit dem Trypanblau. Laden Sie 10 μl auf jede Seite eines Hämozytometers und zählen Sie die Zellen.
2. Zeichnen Sie die Zellkonzentration, die Gesamtzahl der lebenden Zellen, den Prozentsatz der Viabilität und das endgültige Medienvolumen nach der Zählung auf.
3. Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl zwischen 700 und 1.200 Zellen/μl (7 × 10 5-1,2 × 10⁶/ml) liegt, um einen optimalen 10x Genomics-Lauf zu gewährleisten.
   1. Wenn die Probe zu konzentriert ist, verdünnen Sie sie mit Medium und zählen Sie sie neu.
   2. Wenn die Probe zu stark verdünnt ist, wird die Probe 5 Minuten lang bei 450 × g und 4 °C zentrifugiert und in einem Medium mit geringerem Volumen resuspendiert.
   3. Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen unter 80 % liegt, führen Sie ein Verfahren zur Entfernung abgestorbener Zellen durch.
   4. Wenn weniger als eine Million Zellen vorhanden sind, siehe Abschnitt 6.
   5. Wenn mehr als eine Million Zellen vorhanden sind und die Lebensfähigkeit > 10 % beträgt, siehe Abschnitt 6.
   6. Wenn mehr als eine Million Zellen vorhanden sind und die Lebensfähigkeit < 10 % beträgt, siehe Abschnitt 7.
   7. Wenn die Zellviabilität über 80 % liegt, halten Sie die verarbeiteten Zellen auf Eis und fahren Sie sofort mit der GEM-Erzeugung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.

6. Entfernung toter Zellen - Kit 1

HINWEIS: Arbeiten Sie in einer Biosicherheitshaube, wenn Sie die Reagenzien zur Entfernung abgestorbener Zellen verwenden, da diese leicht kontaminiert werden können.

1. Die Probe wird bei 450 × g, 4 °C für 5 min zentrifugiert.
2. Bereiten Sie das Isolationsmedium in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor und bewahren Sie es bei Raumtemperatur auf: 9,8 mL PBS, 10 μl CaCl₂ und 200 μl hitzeinaktiviertes FCS (in einer Biosicherheitshaube zugegeben).
3. Nach der Zentrifugation wird das Medium aus dem Pellet abgesaugt und in 1 ml des Isolationsmediums resuspendiert.
4. Das Röhrchen erneut bei 450 × g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in 100 μl Isolationsmedium resuspendiert.
5. Übertragen Sie 100 μl Probe in einem Isoliermedium in eine Vertiefung eines 0,2-ml-PCR-Streifenröhrchens.
6. Geben Sie in einer Biosicherheitshaube 10 μl Annexin V Cocktail und 10 μl Biotin Selection Cocktail in die Vertiefung, die 100 μl der Probe in Isolationsmedien enthält. Pipette, mischen Sie die Lösung und lassen Sie sie 4 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
7. Nach 4 min die dextranbeschichteten magnetischen Partikel 30 s lang vortexen. Geben Sie 20 μl der Kügelchen und 60 μl Isolationsmedium in die Probe (ein Gesamtvolumen von 200 μl). Wenn die Lebensfähigkeit unter 40 % liegt, skalieren Sie die Menge der Kügelchen auf bis zu 40 μl, während Sie das Volumen des Isolationsmediums (bis zu 40 μl) anpassen, wobei ein Gesamtvolumen von 200 μl beibehalten wird. Pipettieren Sie die Mischung und lassen Sie die Lösung 3 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen.
8. Legen Sie das Streifenröhrchen für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einen 10x Genomics Magnetseparator (auf hoher Stufe).
9. Übertragen Sie die Flüssigkeit aus dem Streifenröhrchen, ohne die Kügelchen zu stören, in ein neues 1,5-ml-Lo-Bind-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie das Streifenrohr nicht vom Magneten.
10. Das 1,5-ml-Röhrchen mit der Probe wird 5 Minuten lang bei 450 × g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in einem geeigneten Volumen des RPMI-Mediums auf der Grundlage der Pelletgröße und der Anzahl der Zellen resuspendiert, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Wiederholen Sie das Verfahren zur Entfernung abgestorbener Zellen, wenn die Lebensfähigkeit unter 80 % bleibt (Abbildung 3 und Abbildung 4).
    HINWEIS: Resuspendieren Sie die Zellen nicht in Isoliermedien für die nachgeschaltete GEM-Erzeugung, da das Calciumchlorid den Verkapselungsprozess und den Schritt der reversen Transkription (RT) beeinträchtigt.
11. Halten Sie die verarbeiteten Zellen auf Eis, wenn die Zellviabilität über 80 % liegt, und fahren Sie sofort mit der GEM-Erzeugung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.

7. Entfernung toter Zellen - Kit 2

HINWEIS: Arbeiten Sie in einer Biosicherheitshaube, wenn Sie die Reagenzien des Kits verwenden.

1. Legen Sie die Mikrokügelchen und die 20x Binding Buffer Stammlösung in eine Biosicherheitshaube.
2. Die Probensuspension wird 5 Minuten lang bei 450 × g und 4 ΰC zentrifugiert.
3. Bereiten Sie 1x Pufferlösung unter sterilen Bedingungen mit 1 ml der 20x Bindungspuffer-Stammlösung vor, die in 19 ml DNAse-, RNAse-freies destilliertes Wasser pipettiert wird.
4. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie die Mikrokügelchen hinzu, mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   1. Wenn die Zellzahl 10⁷ oder weniger beträgt, fügen Sie 100 μl der Mikrokügelchen hinzu.
   2. Bei einer Anzahl von mehr als 10^{bis 7} Zellen ist die Mikrokügelchen auf eine Endkonzentration von 100 μl pro 10⁷ lebende Zellen einzustellen.
5. Während der Inkubation erhalten Sie eine MACS-Säule mit positiver Auswahl, einen MACS-Multistand und den entsprechenden Magnetabscheider. Stellen Sie sicher, dass der Separator auf dem Multiständer waagerecht steht und sich keine anderen metallischen oder magnetischen Gegenstände in der Nähe des Ständers befinden, da die Magnetkraft stark ist und die Effizienz der Entfernung toter Zellen beeinträchtigen könnte. Setzen Sie die Säule mit den Flügeln nach außen fest in einen Trennhalter.
6. Wenn das Gesamtresuspensionsvolumen nach der Probeninkubation weniger als 500 μl beträgt, fügen Sie 1x Bindungspuffer hinzu, bis das Gesamtvolumen 500 μl beträgt.
7. Platzieren Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen unter der Säule und grundieren Sie die Säule mit 3 mL 1x Binding Buffer.
8. Ersetzen Sie das konische Röhrchen durch ein neues konisches 15-ml-Röhrchen für die Entnahme von Zellproben und geben Sie die Probe in die Säule, so dass sie vollständig durch die Säule fließen kann.
9. Waschen Sie die Säule mit 4 x 3 mL 1x Bindungspuffer und fügen Sie jeweils nur eine Wäsche hinzu, nachdem die vorherige Wäsche vollständig durch die Säule geflossen ist.
10. Nach der vierten Wäsche wird das konische Röhrchen mit den isolierten Zellen 5 Minuten lang bei 450 × g, 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie die Spalte und den verbleibenden 1x-Bindungspuffer.
11. Resuspendieren Sie die Probenlösung in der entsprechend der Pelletgröße geeigneten Menge RPMI-Medium und zählen Sie die isolierten Zellen nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren (Abbildung 3 und Abbildung 5).
    1. Wenn die Lebensfähigkeit unter 80 % bleibt und die Gesamtzahl der Zellen 10⁶ oder weniger beträgt, wiederholen Sie Abschnitt 6.
    2. Wenn die Zellviabilität über 80 % liegt, halten Sie die verarbeiteten Zellen auf Eis und fahren Sie sofort mit der GEM-Erzeugung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.

Eine Melanombiopsie, die in RPMI suspendiert war, wurde entnommen und sofort auf Eis gelegt. Die Probe wurde in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 420 μl RPMI und Aufschlussenzymen überführt, mit einer Schere in kleine Stücke zerkleinert und anschließend 15 Minuten lang in einem vertikal positionierten thermischen Mischer bei 37 °C einem enzymatischen Aufschluss unterzogen (Abbildung 1). Nach dem Aufschluss wurde die Probe durch einen sterilen 50-μm-Einwegfilter filtriert und der Filter mit frischem RPMI gewaschen, um die Zellausbeute zu erhöhen (Abbildung 1). Die restlichen Teile des Gewebes, die nach den Waschungen übrig geblieben sind, wurden verworfen, da es sich um unerwünschtes biologisches Material handelt (z. B. Fettgewebe).

Basierend auf der Farbe des resultierenden Zellpellets wurden 15 ml ACK-Lysepuffer benötigt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen (Abbildung 2). Nach der Resuspension in 3 ml RPMI-Medien betrug die Gesamtzellzahl 1 × 10⁶/ml, wobei die Lebensfähigkeit <80 % betrug (Abbildung 3A). Dies deutete darauf hin, dass ein Zyklus der Lebendzellanreicherung mit Kit 1 (Protokollabschnitt 6) erforderlich war, bevor mit der 10-fachen Genomics-Beladung fortgefahren wurde (Abbildung 4). Wenn diese Probe mehr als 1 Million Zellen enthielt und eine Lebensfähigkeit von weniger als 10 % aufwies, wäre stattdessen das Dead Cell Removal Kit 2 verwendet worden (Abbildung 5). Die Probe wurde mit Isolationsmedien gewaschen und 10 μl Annexin V und Biotin-Selektionscocktail hinzugefügt, gefolgt von 20 μl der magnetischen Beads und 60 μl Isolationsmedium, wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben (Abbildung 4). Nach diesem Verfahren wurde die Probe in 500 μl Medium resuspendiert und neu gezählt. Die Anzahl der lebenden Zellen betrug 4,9 × 10⁵/ml mit einer Lebensfähigkeit von über 90 % (Abbildung 3B), und die Probe wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers sofort zur GEM-Erzeugung weitergeleitet.

Abbildung 1: Überblick über die Verarbeitung von Tumorproben. (A) Veranschaulichung des Schritt-für-Schritt-Prozesses des Gewebedissoziationsprotokolls. (B) Der Aufschluss einer Probe mit einem vertikal angeordneten thermischen Mischer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Pre-ACK- und Post-ACK-Behandlung einer leicht pigmentierten Melanomprobe. (A) Das Bild zeigt eine Melanomprobe, die nach dem Verdauungsschritt vor der Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) mit ACK filtriert und pelletiert wurde. (B) Das Bild zeigt die gleiche Melanomprobe nach der Entfernung von RBC mit ACK-Puffer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ansicht von Zellen auf dem Hämozytometer unter Trypanblau mit 200-facher Vergrößerung. (A) Bild zeigt das Aussehen blauer Zellen vor der Anreicherung lebender Zellen, die tote Zellen darstellen, mit einer Lebensfähigkeit von weniger als 80 %. (B) Bild, das die Probe nach der Anreicherung lebender Zellen mit dem Protokoll von Kit 1 (Protokollschritt 6) zeigt und eine erhöhte Lebensfähigkeit von über 90 % zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Überblick über die Isolierung lebender toter Probenzellen mit Kit 1. Dieser Schritt wird durchgeführt, wenn nach der Zellzählung weniger als eine Million oder mehr als eine Million Zellen mit einer Lebensfähigkeit von >10 % nachgewiesen werden (Protokollschritt 5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Überblick über die Isolierung lebender toter Zellen mit den Mikrokügelchen zur Entfernung toter Zellen in Kit 2. Dieser Schritt wird durchgeführt, wenn mehr als eine Million Zellen vorhanden sind und eine Lebensfähigkeit von <10 % erreicht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Validierung der Einzelzellanalyse einer unmanipulierten Probe nach einem Zyklus der Lebendzellanreicherung unter Verwendung des modifizierten Protokolls von Kit 1. Der obere Teil zeigt eine UMAP-Analyse, die die Konsistenz der Zellgruppen und -typen vor und nach der Anreicherung lebender Zellen zeigt. Der untere Teil fasst die von Cell Ranger generierten Sequenzierungsergebnisse zusammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll beschreibt die Dissoziation von menschlichen oder murinen Tumorproben in eine Einzelzellsuspension für die scRNA-Sequenzierung unter Verwendung des mikrofluidischen Systems 10x Genomics. Bei der Aufbereitung von Geweben, die häufig aus seltenen Krebsarten stammen oder Teil laufender klinischer Studien oder langer Experimente für murine Tumore sind, muss die Probe zwischen allen Schritten optimal und sorgfältig konserviert werden. Alle Schritte sollten schnell auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden, um die nativen zellulären RNA-Profile zu erhalten und einen Abbau zu verhindern, da die Arbeit bei Raumtemperatur über längere Zeiträume die transkriptomische Qualität beeinträchtigt^17,18.

Es sollten mehrere Schritte unternommen werden, um sicherzustellen, dass der Zellverlust während des gesamten Verfahrens minimal ist, insbesondere bei der Verarbeitung kleiner Nadelkernbiopsien¹⁷. Die Sicherstellung, dass alle Fragmente der Tumorprobe in den Verdau einbezogen werden, führt zum erfolgreichsten Ergebnis, da mehr aus der Probe extrahierte Zellen die zukünftige 10x Genomics-Verkapselung und -Sequenzierung sowie die Gesamtzahl der für die Analyse gewonnenen Zellen und Transkripte verbessern. Wenn sich die Probe in dem Röhrchen festsetzt, in dem sie ankommt, kann das Medium hinzugefügt, das Röhrchen umgedreht und zur Verarbeitung in die Schale überführt werden. Wenn die Ausgangsprobe fragmentiert ist oder die Lösung trüb ist, was auf das Vorhandensein von Zellen in Suspension hinweist, stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe für den enzymatischen Aufschluss entnommen wird, indem Sie die Probe mit der Lösung, in der sie angekommen ist, zentrifugieren und sie für den Aufschluss in einem Medienvolumen resuspendieren (Protokollabschnitt 1).

Achten Sie beim Absaugen darauf, dass das Pellet während des gesamten Vorgangs nicht gestört wird. Lassen Sie beim Aspirieren zusätzliches Volumen, das mit einer P200-Pipette entfernt werden kann. Wird das Pellet gestört, kann das Volumen wieder in das Rohr dosiert und erneut zentrifugiert werden. Nach der ACK-Lyse oder nach der Entfernung lebender Toten kann die Probe Volumina von nur 25 μl haben. Daher ist es wichtig, keinen Überstand zu verlieren, der die Zellen enthält. Ein ordnungsgemäßer mechanischer Verdau ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass die interessierenden Zellen einem enzymatischen Verdau ausgesetzt sind. Bei größeren Probengrößen kann ein längerer enzymatischer Aufschluss mit den entsprechenden Enzymen und einem thermischen Mischer erforderlich sein ^9,19,20. Während spezifische Enzymnamen proprietär sind, gibt der Hersteller Enzym A als Nuklease und die Enzyme H, D und R als unspezifische Proteasen an. Es ist wichtig, so viel wie möglich von der Tumorprobe durch den Filter zu leiten, um die höchstmögliche Zellausbeute zu gewährleisten. Eine erfolgreiche Filterung führt dazu, dass sich im Filter keine oder nur eine winzige sichtbare Probe befindet. Einige Stücke der Probe können möglicherweise nicht gefiltert werden, wenn sie einen hohen Anteil an Fett- oder Bindegewebe aufweisen. Wenn sich sichtbare Teile der Probe auf der Oberseite des Filters befinden, verwenden Sie weiterhin die Rückseite des Spritzenkolbens, um die gesamte Probe mit der Drehbewegung zu schleifen und durchzudrücken, während Sie auch die Oberseite des Filters mit mehr Medium waschen.

Der Erfolg des Schritts der Lyse roter Blutkörperchen wird bestimmt, indem die Probe unter dem Mikroskop betrachtet wird, sobald die Probe zur Zählung und Lebensfähigkeit auf das Hämozytometer geladen wird^15,21. Wenn der Probe genügend ACK zugesetzt wird, um rote Blutkörperchen zu entfernen, gibt es keine roten Blutkörperchen oder sichtbare Rötungen im Pellet. Wenn rote Blutkörperchen in der Probe sichtbar sind, sollte zusätzliches ACK hinzugefügt werden, und die Probe sollte 5 Minuten lang bei 450 × g, 4 °C erneut zentrifugiert werden. Sobald dies erledigt ist, sollte der Überstand aspiriert werden, und das Zellpellet kann zur Visualisierung und Zählung in RPMI-Medien resuspendiert werden.

Um einen optimalen 10x Genomics-Lauf zu gewährleisten, sollte die Zellzahl zwischen 700 und 1.200 Zellen/μL liegen (7 × 10⁵- 1,2 × 10⁶/ml). Eine hohe Konzentration erhöht die Dublettenrate (zwei Zellen in einem Tröpfchen) während der Tröpfchenbildung. Wenn die Zählung zu hoch ist, kann der Probe eine angemessene Menge an Medien zugesetzt und zur Nachzählung auf ein Hämozytometer geladen werden. Ist die Konzentration zu niedrig, kann die Probe bei 450 × g, 4 °C für 5 min erneut zentrifugiert werden, der Überstand aspiriert und vor der Nachzählung in einem geringeren Medienvolumen resuspendiert werden. Die Probe kann für die 10-fache Genomik geladen werden, wenn die Lebensfähigkeit lebender Zellen über 80 % liegt (Abbildung 3).

Wenn die Lebensfähigkeit der Probe unter 80 % liegt, ist ein Lebendtodverfahren erforderlich, bevor 10x Genomics geladen^{wird 16}. Wenn eine Runde der Entfernung lebender Toter den Prozentsatz der Lebensfähigkeit nicht über 80 % gebracht hat, sollte eine weitere Runde durchgeführt werden, wenn insgesamt mehr als 1 × 10⁵ Zellen vorhanden sind. Eine höhere Viabilität verhindert Verstopfungen im nachfolgenden 10x Genomics-Protokoll, erhöht die Zellregeneration und reduziert das Vorhandensein von Umgebungs-RNA. Das Protokoll von Kit 1 wurde optimiert und miniaturisiert, um kleinere Gewebeproben mit geringerer Zellzahl schnell zu dissoziieren. Das reduzierte Volumen an Reagenzien und die verkürzten Inkubationszeiten erhöhen die Zellausbeute und verhindern eine Stressreaktions-Gensignatur (FOS, JUN und JUNB) auf verschiedenen Zellen ^9,22. Alternative Methoden zur Anreicherung lebender Zellen sind das Färben und Sortieren. Dies würde jedoch zu einer verringerten Zellausbeute, einer verlängerten Färbeinkubation, die sich auf die zellulären Zustände auswirken könnte (z. B. aktivieren aCD3e-Antikörper T-Zellen), und zu Stress führen, der durch den Druck der Maschine auf die Zellen während der Sortierung induziert wird ^9,22. Das in Abbildung 6 gezeigte Beispiel veranschaulicht eine UMAP, die nach der 10X Genomics Gene Expression (GEX)-Sequenzierung generiert wurde, und die Umwandlung der generierten Zell-Barcodes in FASTQ-Dateien, die dann über CellRanger verkettet und ausgerichtet wurden. Nachfolgende Sequenzierungsergebnisse und Vergleiche der Entfernung von lebenden Toten wurden grafisch dargestellt, um die Zellpopulationen in einer Probe vor und nach der Entfernung von lebenden Toten zu zeigen und die Sequenzierungsqualität zu verbessern. Die in Abbildung 6 gezeigte Lungenprobe wies auf ein Problem mit dem Anteil der Messwerte hin, da er unter 70 % lag. Diese Warnung wurde aufgrund eines hohen RNA-Gehalts in der Umgebung in einer Population von lysierten oder toten Zellen erzeugt. Nach der Entfernung abgestorbener Zellen war dieser Fehler jedoch nicht mehr vorhanden und führte zu einem höheren Prozentsatz an Fraktionslesevorgängen in den Zellen²³.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist ein kostspieliger und prekärer Prozess, der das Gebiet der Krebsimmunologie und Krebsforschung dramatisch vorangebracht hat. Es ermöglicht die weitere Befragung von Genen, zellulären Zuständen und Programmen, die in bestimmten Zelltypen exprimiert und unterdrückt werden, und gibt mehr über das Verhalten und die Heterogenität von Krebs preis. Suboptimales oder wenig lebensfähiges Gewebe erzeugt mit größerer Wahrscheinlichkeit Daten von geringer Qualität, die Artefakte erzeugen können, die von der Realität der Tumorbiologie ablenken und die entscheidende Bedeutung einer ordnungsgemäßen Tumordissoziation und Probenvorbereitung unterstreichen.

M.S-F. erhielt Fördermittel von Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology und war Berater für Galvazine Therapeutics.

Diese Studie wurde von der Adelson Medical Research Foundation (AMRF), der Melanoma Research Alliance (MRA) und U54CA224068 unterstützt. Abbildung 1, Abbildung 4 und Abbildung 5 wurden mit BioRender.com erstellt.