Неинвазивный анализ для определения кинетики биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса

В данной статье мы расскажем о современном инструменте, предназначенном для мониторинга биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования проростков арабидопсиса . Новая методология обеспечивает неинвазивную флуоресцентную визуализацию хлорофилла в режиме реального времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой деэтиолирования, одного из самых драматических этапов жизненного цикла растений. Строго контролируемый и высокодинамичный процесс биосинтеза хлорофилла запускается во время перехода от темноты к свету у цветковых растений. В тот момент, когда этиолированные проростки подвергаются воздействию первых следов солнечного света, быстрое (с точностью до секунд) превращение протохлорофиллида в хлорофиллид опосредовано уникальными светопринимающими белковыми комплексами, приводящими через последующие метаболические этапы к выработке полнофункционального хлорофилла. Стандартные методики анализа содержания хлорофилла включают выделение пигмента из обособленных тканей растений, что не применимо для изучения таких быстрых процессов. Для исследования кинетики хлорофилла in vivo с высокой точностью и пространственно-временным разрешением в первые часы после световой деэтиолляции были разработаны прибор и протокол. Здесь мы представляем подробную процедуру, предназначенную для статистически надежного количественного определения хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса .

Деэтиолирование представляет собой наиболее драматичную фазу жизненного цикла растений, характеризующуюся рядом морфологических изменений и полной перестройкой метаболизма растений (от гетеро- до автотропного)¹. Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой светоиндуцированной деэтиолляции в растениях и очень динамичным процессом. Образование хлорофилла из темного предшественника протохлорофиллида должно быть тесно скоординировано, чтобы избежать повреждений из-за реакционноспособных побочных продуктов². Восстановление протохлорофиллида до хлорофиллида катализируется светозависимыми протохлорофиллидоксидоредуктазами (ПОР), уникальными ферментами, активируемыми непосредственно светом. Реакция протекает очень быстро, протекая в порядке от мс до^с3, что приводит к заметному накоплению хлорофилла в течение нескольких минут после облучения этиолированных проростков ^4,5,6. Для биогенеза хлоропластов требуется больше времени (от нескольких часов до нескольких дней) для создания полностью функционального фотосинтетического аппарата³.

Существуют различные методы анализа содержания хлорофилла, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) или спектрофотометрию. Обычно эти методы требуют разрушения растительной ткани ^4,5,6, что ограничивает определение изменений уровня хлорофилла с течением времени. Методы, позволяющие установить неинвазивную кинетику хлорофилла, могут открыть совершенно новые перспективы для изучения растений в самых разных аспектах, начиная от фундаментальных научных вопросов, таких как анализ процесса синтеза хлорофилла во времени и пространстве, и заканчивая более практическими приложениями, такими как оценка стрессоустойчивости или влияния биостимуляторов на кинетику хлорофилла. Учитывая это, мы внедрили систему мониторинга образования хлорофилла iReenCAM⁷. Он включает в себя ПЗС-камеру, эмиссионные фильтры, источники света и конвейер для автоматизированного анализа флуоресценции (рис. 1). Главной особенностью разработанного прибора является высокое пространственное и временное разрешение, превосходящее по параметрам, используемым в современных подходах, и достаточная чувствительность и специфичность по сравнению со стандартными аналитическими методами⁷.

Описанная здесь неинвазивная процедура требует минимального количества реагентов и состоит из простых этапов, позволяющих получить профиль кинетики хлорофилла в живых проростках арабидопсиса на самых ранних стадиях деэтиолирования. Протокол может быть полезен для изучения высокодинамичного процесса синтеза хлорофилла под влиянием ряда факторов, как экзогенного (соль, засуха, биостимуляторы, тяжелые металлы и т.д.), так и эндогенного (обычно связанного с изменениями активности генов) по происхождению без необходимости отрыва какой-либо растительной ткани, что позволяет избежать дополнительного стресса.

1. Подготовка среды

1. Приготовьте питательную среду, смешав 0,75 г желирующего агента с 50 мл стерильной деионизированной воды в стеклянной бутылке для достижения концентрации 1,5% (по массе) для одной чашки Петри (120 x 120 x 17 мм). Аккуратно встряхните смесь, а затем нагрейте ее в микроволновой печи до закипания, чтобы растворился желирующий агент (раствор станет прозрачным).
2. Дайте среде остыть до 58-60 °C, прежде чем переходить к следующим шагам. Все последующие этапы должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение.
3. Используйте планшеты Петри со светонепроницаемыми краями, чтобы избежать чрезмерного отражения актинического света и высокой фоновой автофлуоресценции во время измерений. Для этого наклейте черную клейкую ленту (или другое доступное средство), чтобы покрыть все стороны пустой чашки Петри (рисунок 2).
4. После наложения ленты провести стерилизацию пластины (пластин) путем облучения бактерицидной УФ-лампой в течение 20-30 минут.
5. Если эксперимент включает в себя химическую обработку (например, абиотические/биотические стрессоры, растительные гормоны и/или регуляторы роста и т. д.), добавьте соответствующее количество соответствующего химического вещества непосредственно в среду. Имейте в виду, что в среду добавляется выбранная химическая стабильность (например, если химическое вещество не термостабильно, добавьте в среду, когда она остынет, непосредственно перед заливкой в пластину). Тщательно перемешайте среду, встряхивая, чтобы обеспечить равномерное распределение химиката.
6. Избегайте подсветки пластин ультрафиолетовым светом после заливки среды (это может привести к образованию кислородных радикалов, которые могут помешать эксперименту).
7. Вылейте подготовленную среду в квадратную чашку (планшеты) Петри и дайте среде затвердеть при комнатной температуре.

2. Стерилизация поверхности семян и условия роста растений

1. Необходимое количество семян Arabidopsis thaliana Col-0 достать из заготовки (10-20 мг) и добавить в пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Никаких специфических модификаций при работе с различными линиями Arabidopsis (линии экотипа/мутантов) не требуется. Для других видов растений ревизию решетки и измерений следует проводить с учетом разницы в размерах семян, всхожести и размерах проростков.
2. Стерилизуйте семена арабидопсиса с поверхности, добавив в пробирку 70% этанола в течение 2 минут. Аккуратно встряхните пробирки во время стерилизации.
3. Осторожно удалите этанол с помощью пипетки, стараясь не потерять семена. Промойте семена, добавив стерильную воду в пробирку на 5 минут, чтобы удалить остатки этанола (осторожно встряхните пробирки во время промывки).
4. Дайте семенам оседать на дно пробирки под действием силы тяжести, удалите оставшуюся воду.
5. Еще раз промойте семена 2 раза стерильной водой, как описано в шаге 2.3, чтобы убедиться, что в них нет никаких признаков этанола. Дайте семенам оседать на дно пробирки под действием силы тяжести, удалите оставшуюся воду.
6. Добавьте равный объем стерильной воды в пробирку с семенами, чтобы создать суспензию из семян и воды.
7. Используйте посевную сетку, чтобы равномерно распределить семенно-водную суспензию данного генотипа на выбранных участках средней пластины (рис. 2 и дополнительный рис. 1). Распределите семена (примерно 30-40) в ряд на каждом участке с помощью широкого наконечника пипетки.
8. Дайте воде высохнуть в семенных зонах в течение примерно 30 минут, держа пластину (тарелки) открытой в ламинарном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение. Заклейте пластину лентой с микропорами и оберните алюминиевой фольгой.
9. Стратифицируйте семена в течение 3 дней при температуре 4 °C в темноте, чтобы (в зависимости от используемого экотипа) преодолеть период покоя семян и/или способствовать равномерному прорастанию.
10. Переложите планшет со стратифицированными семенами на белый свет (150 мкмоль/^м2/с) на 1 ч, чтобы вызвать прорастание (разверните фольгу только для световой обработки).
11. После световой обработки оберните тарелку алюминиевой фольгой, чтобы защитить семена от света, поместите в вертикальное положение в камеру роста и культивируйте в течение 4 дней в темноте при температуре 21 °C.

3. Измерение и анализ флуоресценции хлорофилла

1. Включите систему iReenCAM и убедитесь, что система готова и правильно настроена в автоматически запускаемом серверном программном обеспечении PS (например, достаточно ли места для хранения данных эксперимента, подключена ли флуоресцентная камера к ПК и т. д.).
2. Активируйте программное обеспечение планировщика, чтобы создать план эксперимента для измерения, щелкнув Эксперименты > Новый эксперимент. Укажите описательное название эксперимента и заполните сведения (описание).
3. Задайте необходимые действия для эксперимента, нажав кнопку Добавить действие , что приведет к расписанию экспериментальных действий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слово «действие» здесь означает выполнение полного эксперимента (т.е. включая все шаги, необходимые для выполнения одного измерения планшета).
4. Укажите условия для одного круглого измерения (т.е. продолжительность периода света/темноты).
5. Нажав кнопку Generate List, задайте временные интервалы между измерениями раундов. Выберите время начала и окончания раунда (всего 4 часа) и интервалы между раундами (в текущей конфигурации один раунд каждые 2 минуты).
6. Нажмите «Создать» и убедитесь, что временные рамки и интервалы между световыми импульсами верны, проверив список, сгенерированный в левой части экрана.
7. Выберите протокол измерения (Дополнительный рисунок 2). Сохраните все изменения в базе данных для использования в будущем.
8. Непосредственно перед началом измерения используйте зеленый свет низкой интенсивности (см. Таблицу материалов) в темной комнате и отрегулируйте уровень полки внутри измерительной камеры или выполните другие подготовительные действия, прежде чем снимать фольгу с планшета Петри. Затем выключите свет и перенесите пластины в измерительную камеру в полной темноте.
9. Осторожно снимите алюминиевую фольгу, закрывающую планшет Петри, содержащую 4-дневные саженцы. Поместите планшет Петри горизонтально внутрь измерительной камеры прибора. Внутри камеры индуцируют актинические световые импульсы и выполняют визуализацию в соответствии с планом эксперимента (действиями), заданным в шагах 3.1-3.7.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать любого освещения пластин с этиолированными проростками перед помещением их в измерительную камеру. Манипуляции с пластиной с этиолированными проростками необходимо проводить в темном помещении/камере (возможную экспериментальную установку см. на дополнительном рисунке 3).

4. Извлечение и анализ данных

1. После завершения измерения откройте соответствующий эксперимент в программном обеспечении анализатора.
2. Чтобы проанализировать флуоресценцию проростков, сгенерируйте два типа масок: грубую (лотковую) маску, которая покрывает область, где расположены проростки, и точную (растительную) маску, которая покрывает только интересующую ткань (обычно семядоли).
3. Создайте маску лотка, щелкнув опцию Create New Tray Type . Присвойте соответствующие названия генотипов соответствующим областям на изображении пластины.
4. Для присвоения генотипа выберите номер изображения в Раунде , а затем нажмите Загрузить изображение в верхней части экрана. Изображение таблички отобразится на экране. Нажав на любую из множества кнопок, представляющих различные инструменты рисования фигур (Дополнительный рисунок 4), войдите в New Shape Mode , который позволяет нарисовать интересующую область на изображении пластины. Выберите необходимые области (например, различные генотипы на табличке) и дайте им соответствующие названия.
5. Нажмите клавишу Esc, чтобы выйти из режима фигуры. Сохраните сгенерированную маску лотка (предварительно указав для нее имя), нажав кнопку Сохранить тип лотка.
6. Вернитесь на шаг назад и примените маску, созданную на предыдущих шагах, выбрав ее имя в параметре «Изменить по типу лотка ».
7. Чтобы создать маску растения с высокой точностью, используйте изображение, полученное после 180 минут измерения (раунд 91), чтобы установить минимальное пороговое значение интенсивности сигнала флуоресценции, позволяющее вычитание фонового шума. Для этого снимите галочку с Auto Threshold и установите Manual Threshold на 0 (Дополнительный рисунок 4).
8. Нажмите кнопку Предварительный просмотр, чтобы убедиться, что маска лотка покрывает все необходимые области (генотипы) на изображении пластины. Для этого выберите раунд 91 и нажмите Обновить предварительный просмотр.
9. Войдите в меню «Выполнить», нажав кнопку «Выполнить». Запустите анализ исключительно для 91-го раунда, поставив галочку только на 91-м раунде. Затем выберите выходной путь и нажмите кнопку Начать анализ.
10. После завершения анализа автоматически откроется меню Готово. Выберите выполненный раунд (он будет единственным) из экспериментов и нажмите Переключить анализатор на Анализируемые данные , чтобы экспортировать данные для этого конкретного момента времени (раунд 91).
11. Извлеките файл .xsel из экспортированного архива, так как этот файл содержит важную информацию о маске растения, нажав на значок Open Export Part .
12. Снова откройте эксперимент, щелкнув значок Open Local Analysis Part . Снова войдите в меню Mask Builder , нажмите Load Image, выберите раунд 1, а затем Load from File в правом верхнем углу экрана и загрузите ранее извлеченный файл .xsel. Изображение пластины будет показано с примененной маской лотка.
13. Сохраните маску, нажав кнопку Store Tray Type , и примените ее, выбрав ее имя в опции Change by Tray Type .
14. Сгенерируйте маску растения, настроив порог интенсивности сигнала флуоресценции. Увеличивайте значение Ручного порога до тех пор, пока маска, сгенерированная в меню Просмотра , не будет идеально соответствовать ROI (например, семядолям) в каждом из генотипов (Дополнительный рисунок 4). Проверьте, подходит ли маска ко всем раундам измерений, прокручивая раунды (проверки правильного положения маски на раундах 1, 61 и 121 должно быть достаточно) в меню предварительного просмотра .
15. Выполните анализ для всех измерительных циклов и экспортируйте данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходной файл включает значения флуоресценции хлорофилла данного генотипа для каждого момента времени, что позволяет строить диаграммы выбора и облегчает дальнейшую статистическую оценку.

Типичный результат, полученный по вновь разработанной методике на 4-дневных деэтиолированных сеянцах арабидопсиса дикого типа (WT), экотипа Колумбия-0 (Col-0), показан на рисунке 3. В контрольных условиях (среда МС с добавлением ДМСО) кривая биосинтеза хлорофилла начинается с начального всплеска синтеза хлорофилла, при котором пул протохлорфиллида, синтезированный во время скотоморфогенной фазы роста, быстро превращается в хлорофилл за счет индуцированных светом PORs ^7,8,9. Начальная фаза быстрого накопления хлорофилла занимает около 10 мин и сменяется фазой запаздывания, во время которой достигаются минимумы темне-синтезированного протохлорофиллида (примерно через 30 мин после облучения; кривая протохлорофиллида, измеренная с помощью ВЭЖХ, см.⁷). Во время фазы лага гены биосинтеза хлорофилла активизируются¹⁰, что приводит к индуцированной светом продукции протохлорофиллида. Вновь синтезированный протохлорофиллид быстро превращается в хлорофилл, определяемый как экспоненциальная фаза (в случае WT Col-0 начинается примерно через 120 мин после облучения), заканчивающаяся еще одной запаздывающей фазой примерно через 4 ч после облучения деэтиолированных проростков (рис. 3). В присутствии 6-бензиламинопурина (БАТ) первые значимые различия обнаруживаются во время экспоненциальной фазы⁷, что свидетельствует о негативном влиянии БАТ на кинетику хлорофилла на более поздних стадиях биосинтеза хлорофилла (примерно через 2 ч после начала освещения актиническим светом; Рисунок 3).

Для сравнения различных состояний и/или генотипов необходима нормализация исходных данных. Поскольку хлорофилл не обнаруживался с помощью ВЭЖХ при различных условиях и/или различных генотипах в этиолированных проростках, мы провели нормализацию (F/F0) до уровней флуоресценции Т0 (F0), измеренных для соответствующего лечения и/или генотипа⁷. Чтобы продемонстрировать важность нормализации, мы приводим как исходные данные, так и данные, нормализованные к среднему значению флуоресценции хлорофилла контроля, измеренному при T0 (F0; Рисунок 3А и Рисунок 3Б соответственно).

Рисунок 1: Обзор протокола измерительного прибора. Схема измерительно-аналитического конвейера iReenCAM. (A) Пробоподготовка путем посева семян с определенной сеткой, стратификации, световой индукции прорастания и вертикально ориентированной обработки пластиной Петри в темноте. (B) Модуль управления для автоматического и программируемого получения изображений и управления данными на основе инструментария PlantScreen phenotyping SW организует работу всей системы, контролируя и синхронизируя работу аппаратного обеспечения с пользовательским протоколом измерения и анализа. (C) Протокол измерений предназначен для динамических измерений изображений флуоресцентных образцов с интервалом 2 минуты в течение 4 ч в общей сложности 4 ч, т.е. 120 циклов измерения. Временная визуальная рамка репрезентативного ложноцветного изображения вертикально ориентированных 4-дневных сеянцев арабидопсиса, полученных за время 180 мин, используется для генерации ROI-маски. (D) Маска, определяющая ROI для интересующей ткани (например, семядоли, гипокотиля или корневой зоны), применяется к визуальному кадру времени, выполняется вычитание фона и извлекаются попиксельные значения флуоресценции для каждого ROI (определяемого маской растений) из всех циклов измерения. Наконец, исходные данные (флуоресценция F) нормируются к среднему значению флуоресценции при T0 (F0). Масштабные линейки = 1 см (A) и 0,25 см (C). Цифра изменена с⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Размещение семян. На рисунке показано размещение семян арабидопсиса на пластине Петри со светонепроницаемыми краями с помощью пильной сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Кинетика накопления хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса . Этиолированные сеянцы WT Col-0 выращивали на средах с добавлением БАТ или ДМСО (макет). (A) Среднее значение ± SD (заштрихованная область), n=9 исходных данных и (B) данные, нормированные к среднему значению флуоресценции при T0 (F0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Посевная решетка. Слева: Посевная сетка с очерченными прямоугольными ящиками для размещения семян каждого генотипа в измерительную точку, расположенную в зоне актинической световой однородности (интенсивность света ≥ 0,7 от максимальной интенсивности света). Справа: Схематическое изображение 4-дневных, этиолированных сеянцев арабидопсиса , выращенных для анализа. Посевная сетка обеспечивает возможную схему позиционирования семян арабидопсиса , обеспечивающую световую однородность и надлежащую плотность семян (каждая щель может быть использована для заделки семян, так как размер щели, расстояние между щелями и световая однородность в области сетки унифицированы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Протокол измерения флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Экспериментальная конфигурация, позволяющая избежать нежелательного воздействия света. (А) Измерительный прибор помещается в фитотрон, (Б) в камеру, отделенную светонепроницаемой дверцей. (C) Ящики для культивирования in vitro (красная стрелка), предназначенные для роста этиолированных проростков при определенных условиях (температура и относительная влажность), размещаются непосредственно под устройством (желтая стрелка), обеспечивая минимальный риск воздействия света. Источник зеленого тусклого света (синяя стрелка) монтируется на стене рядом с управляющим ПК (оранжевая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Процедура генерации маски в рабочем процессе с помощью программного обеспечения анализатора данных PS. Распечатайте снимки экрана отдельных шагов, которые необходимо выполнить для создания маски лотка (шаги 4.3-4.6) и маски растения (шаги 4.12) и анализа данных (шаги 4.7 и 4.13). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Плотность посева, влияющая на вариабельность измерений. Кинетика накопления хлорофилла в 4-дневных, этиолированных сеянцах Arabidopsis WT Col-0, выращенных (А) отдельно (как отдельные сеянцы, здесь n=5) или в группе (В) высокой (HD, n=30-40) или (C) низкой плотности (LD, n=10-15). n соответствует количеству всходов на слот посевной сетки, данные представляют собой средние значения ± SD (заштрихованный регион). Высокая или низкая плотность соответствует количеству всходов на слот посевной сетки, как уже упоминалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Интервал культивирования и пространство требуют оптимизации, специфичной для конкретного вида. Выращивание различных видов растений с использованием протокола, оптимизированного для Arabidopsis. (А) Размещение семян на посевной сетке. (B) 4-дневные, этиолированные сеянцы (слева направо) Arabidopsis thaliana, Brassica napus и Crambe abyssinica. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Критические шаги протокола и устранение неполадок - нет света и берегите маску
Как подчеркивается непосредственно в приведенном выше описании протокола, критически важное значение имеет избегание даже следовых количеств света как во время культивирования этиолированных рассад растений, так и непосредственно перед началом протокола¹¹. В нашей установке мы используем специальную темную камеру, расположенную в фитотроне и отделенную от остальной части фитотрона светонепроницаемой вращающейся дверцей (дополнительный рисунок 3). Камера оборудована местом для выращивания растений и рабочим столом, позволяющим разместить устройство вместе с управляющим ПК и вытяжным шкафом. Это позволяет нам выращивать растения в темноте и начинать измерения без необходимости транспортировки пластин.

Способ культивирования растений и генерации маски имеет решающее значение для последующего количественного определения сигнала флуоресценции хлорофилла с помощью предложенного анализа. Следует избегать попадания в среду комков гелеобразующего агента или мелкого визуального мусора/пыли, так как это может привести к отражению света. Поскольку распознавание флуоресценции хлорофилла программным обеспечением ограничено маской, участок растения, который не будет покрыт маской, просто не будет проанализирован программным обеспечением. Во время 4-часового измерения проростки немного растут/двигаются, поэтому назначенная маска может потребовать корректировки, так как она может не проходить через все циклы измерений для точного количественного определения интенсивности сигнала. По нашему опыту, несовершенное определение маски, по-видимому, является основным источником вариативности. В ходе оптимизационных экспериментов мы отслеживали изменения изменчивости значений флуоресценции хлорофилла, взятых для анализа в i) отдельных проростках и группе сеянцев с ii) более высокой (30-40 семян) и iii) более низкой (10-15 семян) плотностью посева (дополнительный рисунок 5). Мы использовали более высокую плотность посева семян, так как она показала наименьшую изменчивость. Более высокая изменчивость, наблюдаемая в случае отдельных проростков/более низкой плотности посева, в основном связана с более высокой долей пикселей, расположенных на границе между сигналом и фоном, и небольшим движением проростков в течение 4-часового интервала измерения.

Чтобы убедиться, что все измерения точны, проверьте, подходит ли маска растения для первого раунда, затем для^15-го,^30-го, 45-го, 60-го, ^75-го и так далее до последнего (выбрав номер раунда и нажав кнопку Обновить предварительный просмотр). Это займет всего пару минут, но гарантирует, что вся семядольная область будет покрыта и оценена. Если на какой-либо раунд растительная маска не помещается (необходимая площадь покрыта не полностью), разделите эксперимент на несколько частей. Затем выполните протокол, начиная с шага 4 (4.1-4.13), чтобы создать определенную маску отдельно для каждой части эксперимента. Например, если вы заметили смещение маски растения на 60-61 раунде (или чуть раньше), разделите эксперимент на две части -^1-ю часть (1-60 раундов) и^2-ю часть (61-121 раунд). Для^1-й части используйте изображение 41-го раунда, чтобы создать маску растения, а для^2-й части используйте 91-й раунд. На шаге 4.13 при анализе данных внимательно выберите раунды в соответствии с соответствующей частью эксперимента (например, раунды 1-60 для первой части и 61-121 для второй, как в предыдущем примере), прежде чем нажимать кнопку Анализировать. При работе с Arabidopsis движение растений незначительно, так как они растут довольно медленно, но при применении протокола для разных видов (см. ниже) следует учитывать темпы роста.

Изменения и ограничения
Количество параметров может быть изменено, включая интенсивность и длину волны актинического света и/или света, подаваемого между интервалами применения актинического света. Измерительное устройство включает в себя встроенное, полностью моторизованное колесо фильтров с программным управлением. Таким образом, алгоритм измерения, пригодный для количественного определения других пигментов, как правило, также продуктов тетрапирольного биосинтетического пути ^10,12, может быть включен в протокол в случае добавления соответствующих фильтров.

Также, как уже было сказано ранее, протокол можно использовать не только для растений Arabidopsis . Однако при работе с другими видами растений каждый шаг протокола должен быть соответствующим образом пересмотрен с учетом видоспецифичных особенностей, включая всхожесть и скорость роста и/или размер (дополнительный рисунок 6).

Одним из важных ограничений протокола является промежуток времени, в течение которого может быть выполнен количественный анализ хлорофилла. После того, как хлорофилл интегрируется в комплексы фотосистем, сигнал флуоресценции смещается из-за потребления энергии фотосинтеза (присутствует так называемая переменная флоресценция хлорофилла), что наблюдалось на более поздних стадиях деэтиолирования¹³. По данным анализа транзиентов OJIP^14,15, в течение первых 4 ч после деэтиолирования 7 не было обнаружено никаких признаков фотосинтетической активности^с помощью этой экспериментальной установки. Однако, если предполагается/необходимо исследовать расширенный временной период фотоморфогенеза, следует проверить уровень сборки фотосистем и возможное влияние фотосинтеза на общий уровень флуоресценции.

Наконец, следует отметить, что наш протокол, основанный на измерениях флуоресценции, позволяет проводить относительное, а не абсолютное количественное определение хлорофилла. Если требуется абсолютное количественное определение, соответствующая калибровка должна быть выполнена с использованием альтернативного подхода, например, подхода ВЭЖХ.

Значимость по сравнению с существующими методами - простое, быстрое и статистически надежное количественное определение хлорофилла с высоким временным и пространственным разрешением
Описанная здесь процедура позволяет в режиме реального времени обнаруживать и количественно определять содержание хлорофилла в живых проростках арабидопсиса на ранних стадиях деэтиолирования. По сравнению с другими подходами, основанными в основном на извлечении хлорофилла из отдельного растительного материала^16,17 или недавно разработанными оптическими методами^18,19, этот подход является чисто неинвазивным, позволяя количественно определять хлорофилл путем измерения интенсивности флуоресценции in vivo. Кроме того, нет необходимости в дополнительных реагентах, необходимых для пробоподготовки, как при использовании других существующих альтернативных методов, включая вышеупомянутые подходы, основанные на ВЭЖХ или спектрофотометрии. Недавно представленный протокол является простым, быстрым и точным, что было проверено ранее с помощью ВЭЖХ⁵. Используя стандартные настройки протокола, окончательная кривая одного биологического повтора составляется из 120 точек измерения (средних значений интенсивности флуоресценции), взятых в течение 4 ч измерения, каждая из которых состоит из 15 измерительных точек. Как правило, окончательная кривая включает данные трех биологических реплик (например, трех независимо подготовленных планшетов) и трех измерительных точек (трех технических реплик), каждая из которых состоит из 30-40 саженцев. Таким образом, в каждом временном интервале анализируется около 300 проростков, что обеспечивает статистически надежный набор данных, позволяющий надежно обнаруживать даже небольшие различия, как это было продемонстрировано на мутантах, пораженных на различных стадиях биосинтеза хлорофилла⁷. Здесь мы рекомендуем пользователю использовать недавно разработанный статистический подход, основанный на обобщенных линейных смешанных моделях в сочетании с классическими моделями временных рядов, в качестве подходящего инструмента для анализа данных кинетики хлорофилла²⁰.

Будущие области применения методики - быстрый и дешевый скрининг
Вышеупомянутые особенности делают этот подход полезным инструментом, подходящим для быстрого и дешевого скрининга и высокоточной количественной оценки признаков, связанных (прямо или косвенно) с биосинтезом хлорофилла. Это может включать в себя исследования с использованием прямого генетического скрининга для лучшей характеристики сложных и многоуровневых регуляций биосинтеза хлорофилла 10,12,21. Учитывая возможность лечения различными соединениями, протокол также очень ценен для изучения, например, важности светоопосредованной гормональной регуляции^22,23 или скрининга низкомолекулярных соединений с возможным влиянием на кинетику накопления хлорофилла.

З.Б. и К.. являются сотрудниками PSI, а Мартин Тртилек является генеральным директором и владельцем компании PSI, производящей iReenCAM. Все эти авторы принимали участие в разработке инструмента, описанного выше⁷.

Эта работа была поддержана Европейским фондом регионального развития-проектом SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Этот проект получил финансирование в рамках проекта MSCA4Ukraine (ID 1233580), который финансируется Европейским Союзом. Выражаем благодарность Ленке Сочурковой за графическое оформление рисунка 1.