Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

A biossíntese de clorofila é uma marca da desetiolação, uma das fases mais dramáticas do ciclo de vida das plantas. O processo rigidamente controlado e altamente dinâmico de biossíntese de clorofila é desencadeado durante a mudança do escuro para a luz em plantas com flores. No momento em que as plântulas etioladas são expostas aos primeiros vestígios de luz solar, a rápida conversão (em ordem de segundos) de protoclorofilida em clorofilida é mediada por complexos proteicos únicos que aceitam a luz, levando através de etapas metabólicas subsequentes à produção de clorofila totalmente funcional. As técnicas padrão para análise do teor de clorofila incluem a extração de pigmentos de tecidos vegetais destacados, o que não se aplica ao estudo de processos tão rápidos. Para investigar a cinética da clorofila in vivo com alta acurácia e resolução espaço-temporal nas primeiras horas após a desetiolação induzida pela luz, um instrumento e um protocolo foram desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento detalhado desenhado para quantificação estatisticamente robusta de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis .

A desetiolação representa a fase mais dramática do ciclo de vida das plantas, caracterizada por uma série de alterações morfológicas e rearranjo completo do metabolismo vegetal (de hetero para autotrópico)¹. A biossíntese de clorofila é uma característica da desetiolação induzida pela luz em plantas e um processo muito dinâmico. A formação de clorofila a partir de protoclorofilida precursora produzida no escuro deve ser fortemente coordenada para evitar danos causados por subprodutos reativos². A redução do protoclorofilide a clorofilida é catalisada por protoclorofilídeos oxidorredutases (PORs) dependentes de luz, enzimas únicas ativadas diretamente pela luz. A reação é muito rápida, ocorrendo da ordem de ms a^{s 3}, levando ao acúmulo reconhecível de clorofila em poucos minutos após a irradiação das plântulas etioladas ^4,5,6. É necessário mais tempo (de horas a dias) para que a biogênese dos cloroplastos estabeleça um aparelho fotossintético totalmente funcional³.

Existem vários métodos para analisar o teor de clorofila, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou espectrofotometria. Usualmente, essas técnicas exigem a destruição^{do tecido vegetal4,5,6}, restringindo a determinação de alterações nos níveis de clorofila ao longo do tempo. Métodos que permitam o estabelecimento de cinética não invasiva da clorofila podem abrir uma nova perspectiva para o estudo de plantas em diversos aspectos, desde questões fundamentais de pesquisa, como a análise do processo de síntese de clorofila no tempo e no espaço, até aplicações mais práticas, como a avaliação da tolerância ao estresse ou do efeito de bioestimulantes sobre a cinética da clorofila. Diante disso, foi introduzido um sistema de monitoramento da formação de clorofila, o iReenCAM⁷. Ele incorpora uma câmera CCD, filtros de emissão, fontes de luz e uma tubulação para análise automatizada de fluorescência (Figura 1). A principal característica do dispositivo desenvolvido é a alta resolução espacial e temporal, desempenho superior nos parâmetros utilizados nas abordagens atuais, sensibilidade e especificidade suficientes quando comparado aos métodos analíticos^padrão7.

O procedimento não-invasivo aqui descrito requer reagentes mínimos e compreende etapas simples, permitindo obter um perfil cinético de clorofila em mudas vivas de Arabidopsis durante estágios muito iniciais de desetiolização. O protocolo pode ser útil para o estudo de processos altamente dinâmicos de síntese de clorofila influenciados pelo número de fatores, tanto exógenos (sal, seca, bioestimulantes, metais pesados, etc.) quanto endógenos (tipicamente associados a alterações na atividade gênica) na origem, sem a necessidade de desprendimento de qualquer tecido vegetal, evitando assim estresse adicional.

1. Preparação do meio

1. Preparar o meio de cultivo misturando 0,75 g de gelificante com 50 mL de água deionizada estéril em um frasco de vidro para atingir uma concentração de 1,5% (p/v) para uma placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente a mistura e, em seguida, aqueça-a no micro-ondas até ferver para dissolver o agente gelificante (a solução torna-se clara).
2. Deixe o meio arrefecer até 58-60 °C antes de prosseguir para os passos seguintes. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação.
3. Use placas de Petri com bordas à prova de luz para evitar reflexão excessiva de luz actínica e alta autofluorescência de fundo durante as medições. Para isso, aplique fita adesiva preta (ou outros meios disponíveis) para cobrir todos os lados da placa de Petri vazia (Figura 2).
4. Realizar a esterilização da(s) placa(s) após a aplicação da fita por irradiação com lâmpada germicida UV por 20-30 min.
5. Se o experimento envolver tratamento químico (ou seja, estressores abióticos/bióticos, hormônios vegetais e/ou reguladores de crescimento, etc.), adicione a quantidade apropriada de produto químico correspondente diretamente ao meio. Esteja ciente de uma estabilidade química escolhida que está sendo adicionada ao meio (por exemplo, se o produto químico não for termoestável, adicione ao meio quando ele for resfriado antes de despejá-lo na placa). Misture bem o meio agitando para garantir uma distribuição uniforme do produto químico.
6. Evite a iluminação das placas para a luz UV depois que a mídia é derramada (levaria à produção de radicais de oxigênio que poderiam interferir no experimento).
7. Despeje o meio preparado na(s) placa(s) de Petri quadrada e deixe o meio solidificar à temperatura ambiente.

2. Esterilização da superfície das sementes e condições de crescimento das plantas

1. Obter a quantidade necessária de sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 da calha (10-20 mg) e adicioná-la a um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
   NOTA: Nenhuma modificação específica é necessária ao trabalhar com diferentes linhas de Arabidopsis (linhas de ecótipo/mutantes). A revisão da grade de serragem e as etapas de medição devem ser realizadas para outras espécies vegetais, levando-se em consideração a diferença no tamanho das sementes, na taxa de germinação e no tamanho das plântulas.
2. Esterilizar superficialmente as sementes de Arabidopsis adicionando etanol a 70% ao tubo por 2 min. Agite suavemente os tubos durante a esterilização.
3. Remova o etanol pipetando cuidadosamente, tomando cuidado para não perder nenhuma semente. Lave as sementes adicionando água estéril ao tubo por 5 min para remover qualquer etanol residual (agite suavemente os tubos durante o período de lavagem).
4. Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.
5. Enxaguar novamente as sementes 2x com água estéril, conforme descrito na etapa 2.3, para garantir que estejam livres de quaisquer características de etanol. Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.
6. Adicione um volume igual de água estéril ao tubo que contém as sementes para criar uma suspensão de água de sementes.
7. Utilizar uma grade de semeadura para distribuir uniformemente a suspensão de água de semente do genótipo dado nas áreas selecionadas da placa média (Figura 2 e Figura Suplementar 1). Distribuir as sementes (aproximadamente 30-40) em fileiras em cada área utilizando uma ponta de pipeta larga.
8. Deixe a água secar nas áreas de sementes por cerca de 30 min, mantendo a(s) placa(s) aberta(s) em uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Sele a placa com fita adesiva de micropore e envolva-a com papel alumínio.
9. Estratificar as sementes por 3 dias a 4 °C no escuro para, dependendo do ecótipo utilizado, superar a dormência e/ou promover uma germinação uniforme.
10. Transferir a placa com sementes estratificadas para luz branca (150 μmol/m²/s) por 1 h para induzir a germinação (desembrulhar a folha apenas para o tratamento leve).
11. Após o tratamento com luz, envolver a placa com papel alumínio para proteger as sementes da luz e colocá-la na posição vertical em uma câmara de crescimento e cultivar por 4 dias no escuro a 21 °C.

3. Medição e análise da fluorescência da clorofila

1. Ligue o sistema iReenCAM e certifique-se de que o sistema está pronto e configurado corretamente no software do servidor PS iniciado automaticamente (por exemplo, se houver espaço de armazenamento suficiente para os dados do experimento, se a câmera de fluorescência estiver conectada ao PC, etc.).
2. Ative o software Scheduler para criar o plano experimental para a medição clicando em Experimentos > Novo Experimento. Forneça um nome descritivo para o experimento e preencha os detalhes (descrição).
3. Defina as ações necessárias para o experimento clicando em Adicionar ação , o que levará ao cronograma de ações experimentais.
   NOTA: A palavra ação aqui significa realizar um experimento completo (ou seja, incluir todas as etapas necessárias para realizar uma medição de placa).
4. Especifique as condições para uma única medição redonda (ou seja, o comprimento do período de luz/escuridão).
5. Ao clicar em Gerar Lista , defina os intervalos de tempo entre as rodadas de medição. Escolha o horário em que a rodada começará e terminará (4 h no total) e os intervalos entre as rodadas (na configuração atual, uma rodada a cada 2 min).
6. Clique em Gerar e verifique se o período de tempo e os intervalos entre os impulsos de luz estão corretos, verificando a lista gerada no lado esquerdo da tela.
7. Escolha o protocolo de medição (Figura 2 Suplementar). Salve todas as modificações no banco de dados para referência futura.
8. Pouco antes do início da medição, use luz verde de baixa intensidade (ver Tabela de Materiais) dentro da sala escura e ajuste o nível da prateleira dentro da câmara de medição ou execute outras etapas de preparação antes de remover a folha da placa de Petri. Em seguida, desligue a luz e transfira as placas para a câmara de medição na escuridão completa.
9. Retire cuidadosamente a folha de alumínio que cobre a placa de Petri que contém as mudas de 4 dias de idade. Coloque a placa de Petri horizontalmente dentro da câmara de medição do dispositivo. Dentro da câmara, induzir pulsos de luz actínica, e realizar imagens de acordo com o plano de experimento (ações) definido nas etapas 3.1-3.7.
   OBS: É fundamental evitar qualquer iluminação das placas com mudas antes de colocá-las na câmara de medição. A manipulação com a placa com as plântulas etioladas deve ser realizada na sala/câmara escura (para um possível arranjo experimental ver Figura 3 Suplementar).

4. Extração e análise dos dados

1. Depois de concluir a medição, abra o experimento correspondente no software do analisador.
2. Para analisar a fluorescência das mudas, gere dois tipos de máscaras - uma máscara áspera (bandeja) que cobre a área onde as mudas estão localizadas, e uma máscara precisa (planta) que cobre apenas o tecido de interesse (tipicamente cotilédones).
3. Gere uma máscara de bandeja clicando na opção Criar novo tipo de bandeja . Atribua os nomes de genótipos apropriados às respectivas áreas na imagem da placa.
4. Para atribuir genótipo, escolha um número de imagem em Round e clique em Load Image na parte superior da tela. A imagem da placa será mostrada na tela. Ao clicar em qualquer um dos conjuntos de botões que representam diferentes ferramentas de desenho de formas (Figura Suplementar 4), entre no Novo Modo de Forma que permite desenhar a área de interesse na imagem da placa. Escolha as áreas necessárias (por exemplo, diferentes genótipos na placa) e forneça sua nomenclatura apropriada.
5. Clique em Esc para sair do modo de forma. Salve a máscara de bandeja gerada (depois de fornecer um nome para ela) clicando em Armazenar Tipo de Bandeja.
6. Volte uma etapa e aplique a máscara que foi gerada nas etapas anteriores selecionando seu nome na opção Alterar por tipo de bandeja .
7. Para gerar máscara de planta com alta precisão, utilize a imagem adquirida após 180 min de medição (round 91) para definir o valor mínimo de intensidade do sinal de fluorescência, possibilitando a subtração do ruído de fundo. Para isso, remova o tick do Auto Threshold e defina um Limite Manual em 0 (Figura 4 Suplementar).
8. Clique em Visualizar para garantir que a máscara da bandeja cubra todas as áreas necessárias (genótipos) na imagem da placa. Para isso, escolha a rodada 91 e clique em Atualizar visualização.
9. Entre no menu Executar clicando em Executar. Execute a análise exclusivamente para a rodada 91, colocando um tick apenas na rodada 91. Em seguida, escolha o caminho de saída e clique em Iniciar análise.
10. Após a conclusão da análise, o menu Concluir será aberto automaticamente. Escolha a rodada executada (será a única) dos experimentos e clique em Alternar Analisador para Dados Analisados para exportar os dados para este ponto de tempo específico (rodada 91).
11. Extraia o arquivo .xsel do arquivo exportado, pois esse arquivo contém as informações essenciais da máscara de planta clicando no ícone Abrir Parte de Exportação .
12. Reabra o experimento clicando no ícone Abrir Parte de Análise Local . Entre no menu do Construtor de Máscaras novamente, clique em Carregar Imagem, escolha a rodada 1 e, em seguida, Carregar do Arquivo no canto superior direito da tela e carregue o arquivo .xsel extraído anteriormente. A imagem da placa será mostrada com a máscara da bandeja aplicada.
13. Salve a máscara clicando em Armazenar Tipo de Bandeja e aplique-a selecionando seu nome na opção Alterar por Tipo de Bandeja .
14. Gere a máscara de planta ajustando o limiar de intensidade do sinal de fluorescência. Aumente o valor de Limiar Manual até que a máscara gerada no menu Visualizar se ajuste perfeitamente à ROI (por exemplo, cotilédones) em cada um dos genótipos (Figura Suplementar 4). Verifique se a máscara se encaixa em todas as rodadas das medidas rolando ao longo das rodadas (verificar o posicionamento adequado da máscara nas rodadas 1, 61 e 121 deve ser suficiente) no menu Visualização .
15. Realizar a análise para todas as rodadas de medição e exportar dados.
    NOTA: O arquivo de saída inclui valores de fluorescência de clorofila de um determinado genótipo para cada ponto de tempo, permitindo a construção de gráficos de escolha e facilitando a avaliação estatística adicional.

O resultado típico obtido usando o procedimento recém-desenvolvido em mudas de Arabidopsis desetioladas de 4 dias de idade do tipo selvagem (WT), ecótipo Columbia-0 (Col-0) é mostrado na Figura 3. Sob condições de controle (meio MS suplementado com DMSO), a curva biossintética da clorofila inicia-se com uma explosão inicial da síntese de clorofila, na qual o pool de protoclorfilídeos sintetizado durante a fase escotomorfogênica do crescimento é rapidamente convertido em clorofila devido aos PORs induzidos pela luz ^7,8,9. A fase inicial do acúmulo rápido de clorofila leva aproximadamente 10 min e é seguida por uma fase lag, durante a qual os mínimos do protoclorofilide sintetizado no escuro são atingidos (aproximadamente 30 min após a irradiação; para a curva de protoclorofilida medida por HPLC, ver⁷). Durante a fase lag, os genes biossintéticos da clorofila são upregulated¹⁰, levando à produção de protoclorofilida induzida pela luz. O protoclorofilídeo recém-sintetizado é prontamente convertido em clorofila, detectável como fase exponencial (no caso de WT Col-0 iniciando-se aproximadamente 120 min após a irradiação), terminando com outra fase lag aproximadamente 4 h após a irradiação das plântulas desetioladas (Figura 3). Na presença de 6-benzilaminopurina (BAP), as primeiras diferenças significativas são detectáveis durante a fase exponencial⁷, sugerindo efeito negativo da BAP sobre a cinética da clorofila em estágios posteriores da biossíntese de clorofila (cerca de 2 h após o início da iluminação com luz actínica; Gráfico 3).

Para comparação de diferentes condições e/ou genótipos, a normalização dos dados brutos é necessária. Como nenhuma clorofila foi detectada por CLAE em diversas condições e/ou genótipos diferentes em plântulas etioladas, foi realizada a normalização (F/F0) para os níveis de fluorescência de T0 (F0) medidos para o tratamento correspondente e/ou genótipo⁷. Para demonstrar a importância da normalização, apresentamos os dados brutos e os dados normalizados para o valor médio de fluorescência da clorofila do controle medido em T0 (F0; Figura 3A e Figura 3B, respectivamente).

Figura 1: Visão geral do protocolo do dispositivo de medição. O esquema do pipeline de medição e análise iReenCAM. (A) Preparo de amostras por semeadura de sementes definidas por grade, estratificação, indução de luz da germinação e cultivo em placa de Petri orientada verticalmente no escuro. (B) Módulo de controle para aquisição automática e programável de imagens e gerenciamento de dados baseado na fenotipagem PlantScreen A caixa de ferramentas SW organiza a operação de todo o sistema controlando e sincronizando a operação de HW com o protocolo de medição e análise definido pelo usuário. (C) O protocolo de medição é projetado para medições dinâmicas das imagens fluorescentes da amostra em intervalos de 2 min por 4 h no total, ou seja, 120 rodadas de medição. Tempo de imagem representativa em falsa cor de mudas de Arabidopsis com 4 dias de idade orientadas verticalmente adquiridas no tempo 180 min é usado para geração de máscaras ROI. (D) A máscara que define a ROI para um tecido de interesse (por exemplo, cotilédone, hipocótilo ou zona radicular) é aplicada no período visual de tempo, a subtração de fundo é executada e os valores de fluorescência pixel a pixel para cada ROI (definida pela máscara da planta) de todas as rodadas de medição são extraídos. Finalmente, os dados brutos (fluorescência F) são normalizados para o valor médio de fluorescência em T0 (F0). Barras de escala = 1 cm (A) e 0,25 cm (C). O número foi modificado de⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Colocação das sementes. A figura mostra a colocação de sementes de Arabidopsis na placa de Petri com bordas à prova de luz usando a grade de serragem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Cinética de acúmulo de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis . Mudas de WT Col-0 etioladas foram cultivadas em meios suplementados com BAP ou DMSO (mock). (A) O valor médio ± DP (área sombreada), n=9 dos dados brutos e (B) os dados normalizados para o valor médio de fluorescência em T0 (F0). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Grelha de semeadura. Esquerda: Grade de semeadura com caixas retangulares delineadas para colocação das sementes de cada genótipo em um ponto de medição localizado na área de homogeneidade da luz actínica (intensidade luminosa ≥ 0,7 da intensidade luminosa máxima). Direita: Representação esquemática de mudas de Arabidopsis com 4 dias de idade cultivadas para análise. A grade de semeadura fornece um esquema possível para o posicionamento das sementes de Arabidopsis , garantindo homogeneidade leve e densidade de sementes adequada (cada slot pode ser usado para a colocação de sementes, pois o tamanho de uma fenda, a distância entre as ranhuras e a homogeneidade da luz na área da grade são unificados). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Protocolo de medição de fluorescência. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Configuração experimental que permite evitar a exposição indesejada à luz. (A) O dispositivo de medição é colocado no fitótron walk-in, (B) para a câmara separada por porta estanque. (C) As caixas de cultivo in vitro (ponta de seta vermelha) dedicadas ao crescimento das plântulas em condições definidas (temperatura e umidade relativa) são colocadas logo abaixo do dispositivo (ponta de seta amarela), garantindo o mínimo risco de exposição à luz. A fonte de luz fraca verde (ponta de seta azul) é montada na parede ao lado do PC de controle (ponta de seta laranja). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: Procedimento de geração de máscara no fluxo de trabalho usando o software analisador de dados PS. Print screenshots de etapas individuais a serem executadas para a geração da máscara de bandeja (passos 4.3-4.6) e máscara de planta (passo 4.12) e análise de dados (passos 4.7 e 4.13). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 5: Densidade de semeadura que afeta a variabilidade da medição. Cinética de acúmulo de clorofila em plântulas de Arabidopsis WT Col-0 com 4 dias de idade, cultivadas ( A) separadamente (como plântulas individuais, aqui n=5) ou em um grupo de (B) alta (HD, n=30-40) ou (C) baixa densidade (LD, n=10-15). O n corresponde ao número de mudas por fenda da malha de semeadura, os dados representam os valores médios ± DP (região sombreada). A alta ou baixa densidade corresponde ao número de mudas por fenda da malha de semeadura citada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: O intervalo de cultivo e o espaço requerem otimização específica da espécie. Crescimento de várias espécies vegetais utilizando o protocolo otimizado para Arabidopsis. (A) Colocação de sementes na grade de semeadura. (B) plântulas de Arabidopsis thaliana, Brassica napus e Crambe abyssinica, com 4 dias de idade. Clique aqui para baixar este arquivo.

Etapas críticas do protocolo e solução de problemas - sem luz e cuide da máscara
Como destacado diretamente na descrição do protocolo acima, evitar até mesmo as quantidades residuais de luz, tanto durante o cultivo de mudas de plantas etioladas ou pouco antes de iniciar o protocolo, é de fundamental importância¹¹. Em nossa configuração, usamos uma câmara escura dedicada localizada no phytotron walk-in e separada do resto do phytotron com porta giratória à prova de luz (Figura Suplementar 3). A câmara é equipada com espaço de cultivo de plantas e bancada de trabalho, permitindo acomodar o dispositivo juntamente com o PC de controle e exaustor. Isso nos permite cultivar as plantas na escuridão e iniciar a medição sem a necessidade de transporte de placas.

A forma de cultivo das plantas e a geração de máscaras são críticas para a posterior quantificação do sinal de fluorescência da clorofila através do ensaio proposto. Deve-se evitar aglomerações de agente gelificante ou pequeno lixo/poeira visual na mídia, pois pode causar reflexão de luz. Como o reconhecimento da fluorescência da clorofila pelo software é limitado pela máscara, uma área da planta que não será coberta pela máscara simplesmente não será analisada pelo software. Durante a medição de 4 h, as mudas crescem/se movem um pouco, portanto, a máscara designada pode exigir ajustes, pois pode não se encaixar em todas as rodadas de medição para a quantificação precisa da intensidade do sinal. De acordo com nossa experiência, a definição de máscara imperfeita parece ser a principal fonte de variabilidade. Durante os experimentos de otimização, foram monitoradas as mudanças na variabilidade dos valores de fluorescência da clorofila obtidos para análise em i) plântulas individuais e um grupo de plântulas com ii) maior densidade (30-40 sementes) e iii) menor (10-15 sementes) de semeadura (Figura Suplementar 5). Utilizou-se maior densidade de semeadura por apresentar a menor variabilidade. A maior variabilidade observada no caso de plântulas individuais/semeadura de menor densidade decorre, em grande parte, da maior proporção de pixels localizados na borda entre o sinal e o fundo e do leve movimento das plântulas durante o intervalo de medição de 4 h.

Para garantir que todas as medições sejam precisas, verifique se a máscara de planta se encaixa na primeira rodada, depois na^15ª,^30ª,^45ª,^{60ª 75ª} e assim por diante até a última (escolhendo o número da rodada e clicando em Atualizar visualização). Isso levará apenas alguns minutos, mas garantirá que toda a área de cotilédones esteja sendo coberta e avaliada. Se em algum momento a máscara da planta não couber (a área necessária não está totalmente coberta), divida o experimento em várias partes. Em seguida, execute o protocolo a partir da Etapa 4 (4.1-4.13) para criar uma máscara específica separadamente para cada parte do experimento. Por exemplo, se você notar o deslocamento da máscara de planta na rodada 60-61 (ou um pouco antes), divida o experimento em duas partes -^1ª parte (1-60 rodadas) e^2ª parte (61-121 rodadas). Para a^1ª parte use a imagem da rodada 41 para gerar uma máscara de planta e para a^2ª parte use a rodada 91. Na Etapa 4.13, ao analisar os dados, tenha o cuidado de escolher as rodadas de acordo com a parte correspondente do experimento (por exemplo, arredondamentos 1-60 para a primeira parte e 61-121 para a segunda, como no exemplo acima) antes de clicar em Analisar. Ao trabalhar com Arabidopsis, o movimento das plantas é insignificante, pois elas crescem lentamente, mas se aplicar o protocolo para diferentes espécies (veja abaixo), o ritmo de crescimento deve ser levado em conta.

Modificações e limitações
O número de parâmetros pode ser modificado, incluindo a intensidade e o comprimento de onda da luz actínica e/ou a luz aplicada entre os intervalos de aplicação da luz actínica. O dispositivo de medição inclui a roda de filtro integrada, totalmente motorizada e controlada por software. Assim, o algoritmo de medição adequado para a quantificação de outros pigmentos, tipicamente também produtos da via biossintética do tetrapilo10,12, pode ser incluído no protocolo em caso de adição dos filtros apropriados.

Além disso, como foi mencionado anteriormente, o protocolo pode ser usado não apenas para plantas de Arabidopsis . No entanto, ao trabalhar com outras espécies vegetais, cada etapa do protocolo deve ser revisada de acordo, levando em consideração as características específicas da espécie, incluindo a taxa de germinação e crescimento e/ou o tamanho (Figura 6 Suplementar).

Uma das limitações importantes do protocolo é o tempo de duração, durante o qual a análise de quantificação de clorofila pode ser realizada. Após a integração da clorofila aos complexos do fotossistema, o sinal de fluorescência torna-se enviesado pelo consumo de energia da fotossíntese (o que é chamado de floração variável clorofila está presente), como tem sido observado durante estágios posteriores de desetiolação¹³. Como testado usando o ensaio de transientes OJIP^14,15, nenhum sinal de atividade fotossintética foi detectado usando este arranjo experimental durante as primeiras 4 h de desetiolação⁷. No entanto, se o período de tempo prolongado da fotomorfogênese for suposto/necessário ser avaliado, o nível de montagem dos fotossistemas e o possível efeito da fotossíntese sobre os níveis globais de fluorescência devem ser testados.

Finalmente, deve-se mencionar que nosso protocolo, baseado nas medidas de fluorescência, permite a quantificação relativa, não absoluta, de clorofila. Se for necessária uma quantificação absoluta, a calibração correspondente deve ser efectuada utilizando uma abordagem alternativa, por exemplo, por HPLC.

Significância em relação aos métodos existentes - quantificação simples, rápida e estatisticamente robusta de clorofila com alta resolução temporal e espacial
O procedimento aqui descrito permite a detecção e quantificação em tempo real de clorofila em plântulas vivas de Arabidopsis durante os estágios iniciais de desetiolização. Em comparação com outras abordagens que dependem principalmente da extração de clorofila a partir de material vegetal destacado^16,17 ou métodos ópticos recentemente desenvolvidos^18,19, esta abordagem é puramente não invasiva, permitindo a quantificação de clorofila por medidas in vivo da intensidade da fluorescência. Além disso, não há necessidade de reagentes adicionais necessários para a preparação de amostras, como acontece com outros métodos alternativos existentes, incluindo as abordagens baseadas em HPLC ou espectrofotometria acima mencionadas. O protocolo recém-introduzido é simples, rápido e preciso, como verificado anteriormente usando HPLC⁵. Usando as configurações padrão do protocolo, a curva final de uma única repetição biológica é feita de 120 pontos de medição (médias de intensidade de fluorescência) obtidos durante 4 h da medição, cada um consistindo de até 15 pontos de medição. Normalmente, a curva final inclui os dados de três réplicas biológicas (por exemplo, três placas preparadas independentemente) e três pontos de medição (três réplicas técnicas), cada um consistindo de 30-40 mudas. Assim, são ensaiadas cerca de 300 plântulas em cada intervalo de tempo, fornecendo dados estatisticamente robustos, permitindo detectar de forma confiável até mesmo pequenas diferenças, como demonstrado em mutantes afetados em várias etapas da biossíntese de^clorofila7. Aqui encorajamos o usuário a empregar a abordagem estatística recentemente desenvolvida baseada em modelos lineares mistos generalizados combinados com modelos clássicos de séries temporais como uma ferramenta adequada para a análise de dados de cinética de clorofila20.

Aplicações futuras da técnica - triagem rápida e barata
As características acima mencionadas tornam esta abordagem uma ferramenta útil adequada para triagem rápida e barata e quantificação altamente precisa de características associadas (direta ou indiretamente) à biossíntese de clorofila. Isso pode incluir estudos empregando o rastreamento genético avançado para melhor caracterizar as regulações complexas e multiníveis da biossíntese de clorofila 10,12,21. Considerando a possibilidade de vários tratamentos com compostos, o protocolo também é de grande valia para estudar, por exemplo, a importância de regulações hormonais mediadas pela luz^22,23 ou triagem de compostos de baixo peso molecular com possível impacto na cinética de acúmulo de clorofila.

Z.B. e K.P. são funcionários da PSI e Martin Trtilek é CEO e proprietário da empresa PSI que produz o iReenCAM. Todos esses autores estiveram envolvidos no desenvolvimento do instrumento conforme descrito^{anteriormente7}.

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – Projeto SINGING PLANT (nº. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Este projeto recebeu financiamento através do projeto MSCA4Ukraine (ID 1233580), que é financiado pela União Europeia. Somos gratos a Lenka Sochurkova pelo design gráfico da Figura 1.