Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung. Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der Entetiolierung, einer der dramatischsten Phasen im Lebenszyklus der Pflanze. Der streng kontrollierte und hochdynamische Prozess der Chlorophyllbiosynthese wird bei Blütenpflanzen beim Übergang vom Dunkeln zum Hellen ausgelöst. In dem Moment, in dem etiolierte Sämlinge den ersten Spuren von Sonnenlicht ausgesetzt sind, wird die schnelle Umwandlung (in Sekundenordnung) von Protochlorophyllid in Chlorophyllid durch einzigartige lichtakzeptierende Proteinkomplexe vermittelt, die über nachfolgende Stoffwechselschritte zur Produktion von voll funktionsfähigem Chlorophyll führen. Zu den Standardtechniken für die Analyse des Chlorophyllgehalts gehört die Pigmentextraktion aus abgelöstem Pflanzengewebe, was für die Untersuchung solch schneller Prozesse nicht gilt. Um die Chlorophyllkinetik in vivo mit hoher Genauigkeit und raumzeitlicher Auflösung in den ersten Stunden nach der lichtinduzierten Deetiolierung zu untersuchen, wurden ein Instrument und ein Protokoll entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren vor, das für eine statistisch robuste Quantifizierung von Chlorophyll in den frühen Stadien der Arabidopsis-De-Etiolierung entwickelt wurde.

Die De-etiolation stellt die dramatischste Phase im Pflanzenlebenszyklus dar, die durch eine Reihe morphologischer Veränderungen und eine vollständige Neuordnung des Pflanzenstoffwechsels (von hetero- zu autotrop) gekennzeichnet ^ist1. Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der lichtinduzierten Entetiolierung in Pflanzen und ein sehr dynamischer Prozess. Die Bildung von Chlorophyll aus dunkel produzierten Vorläufer-Protochlorophyllid muss eng koordiniert werden, um Schäden durch reaktive Nebenprodukte zu vermeiden². Die Protochlorophyllidreduktion zu Chlorophyllid wird durch lichtabhängige Protochlorophyllid-Oxidoreduktasen (PORs) katalysiert, einzigartige Enzyme, die direkt durch Licht aktiviert werden. Die Reaktion ist sehr schnell und findet in der Größenordnung von ms bis^{s 3} statt, was zu einer erkennbaren Chlorophyllakkumulation innerhalb von Minuten nach etiolierter Keimlingsbestrahlung führt ^4,5,6. Für die Chloroplastenbiogenese ist mehr Zeit (von Stunden bis Tagen) erforderlich, um einen voll funktionsfähigen Photosyntheseapparat zu etablieren³.

Zur Analyse des Chlorophyllgehalts gibt es verschiedene Methoden, darunter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Spektrophotometrie. Normalerweise erfordern diese Techniken die Zerstörung von Pflanzengewebe ^4,5,6, was die Bestimmung von Veränderungen des Chlorophyllgehalts im Laufe der Zeit einschränkt. Methoden, die eine nicht-invasive Chlorophyllkinetik ermöglichen, können eine völlig neue Perspektive eröffnen, um Pflanzen in verschiedenen Aspekten zu untersuchen, die von grundlegenden Forschungsfragen wie der Analyse des Prozesses der Chlorophyllsynthese in Zeit und Raum bis hin zu praktischeren Anwendungen wie der Bewertung der Stresstoleranz oder der Wirkung von Biostimulanzien auf die Chlorophyllkinetik reichen. Vor diesem Hintergrund haben wir ein System zur Überwachung der Chlorophyllbildung eingeführt, iReenCAM⁷. Es umfasst eine CCD-Kamera, Emissionsfilter, Lichtquellen und eine Pipeline für die automatisierte Fluoreszenzanalyse (Abbildung 1). Das Hauptmerkmal des entwickelten Geräts ist eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, die die in aktuellen Ansätzen verwendeten Parameter übertrifft, sowie eine ausreichende Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Standardanalysemethoden⁷.

Das hier beschriebene nicht-invasive Verfahren erfordert ein Minimum an Reagenzien und umfasst einfache Schritte, die es ermöglichen, ein Chlorophyll-Kinetikprofil in lebenden Arabidopsis-Sämlingen in sehr frühen Stadien der Entetiolierung zu erhalten. Das Protokoll kann für die Untersuchung des hochdynamischen Prozesses der Chlorophylsynthese nützlich sein, der von einer Reihe von Faktoren beeinflusst wird, sowohl exogen (Salz, Dürre, Biostimulanzien, Schwermetalle usw.) als auch endogen (typischerweise verbunden mit Veränderungen in der Genaktivität) im Ursprung, ohne dass Pflanzengewebe abgelöst werden muss, wodurch zusätzlicher Stress vermieden wird.

1. Mittlere Zubereitung

1. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 0,75 g Geliermittel mit 50 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer Glasflasche mischen, um eine Konzentration von 1,5 % (w/v) für eine Petriplatte (120 x 120 x 17 mm) zu erreichen. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig und erhitzen Sie sie dann in der Mikrowelle, bis sie kocht, um das Geliermittel aufzulösen (die Lösung wird klar).
2. Lassen Sie das Medium auf 58-60 °C abkühlen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Alle nachfolgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Verwenden Sie Petriplatten mit lichtdichten Kanten, um übermäßige aktinische Lichtreflexionen und hohe Hintergrundautofluoreszenz während der Messungen zu vermeiden. Bringen Sie dazu schwarzes Klebeband (oder andere verfügbare Mittel) an, um alle Seiten der leeren Petriplatte abzudecken (Abbildung 2).
4. Führen Sie die Sterilisation der Platte(n) nach dem Aufbringen des Klebebandes durch Bestrahlung mit einer keimtötenden UV-Lampe für 20-30 Minuten durch.
5. Wenn das Experiment eine chemische Behandlung beinhaltet (d. h. abiotische/biotische Stressoren, Pflanzenhormone und/oder Wachstumsregulatoren usw.), geben Sie die entsprechende Menge der entsprechenden Chemikalie direkt in das Medium. Achten Sie darauf, dass dem Medium eine bestimmte chemische Stabilität zugesetzt wird (z. B. wenn die Chemikalie nicht thermostabil ist, fügen Sie sie dem Medium hinzu, wenn es abgekühlt ist, bevor Sie es in die Platte gießen). Mischen Sie das Medium gründlich durch Schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung der Chemikalie zu gewährleisten.
6. Vermeiden Sie die Beleuchtung der Platten mit UV-Licht nach dem Gießen des Mediums (würde zu einer Produktion von Sauerstoffradikalen führen, die das Experiment stören könnten).
7. Gießen Sie das vorbereitete Medium in die quadratische(n) Petriplatte(n) und lassen Sie das Medium bei Raumtemperatur erstarren.

2. Sterilisation der Saatgutoberfläche und Pflanzenwachstumsbedingungen

1. Holen Sie sich die erforderliche Menge an Arabidopsis thaliana Col-0-Samen aus dem Stamm (10-20 mg) und geben Sie sie in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Bei der Arbeit mit verschiedenen Arabidopsis-Linien (Ökotyp-/Mutantenlinien) sind keine spezifischen Modifikationen erforderlich. Die Überarbeitung des Sägerasters und der Messschritte sollte für andere Pflanzenarten unter Berücksichtigung der Unterschiede in der Samengröße, der Keimrate und der Sämlingsgröße durchgeführt werden.
2. Arabidopsis-Samen oberflächensterilisieren, indem Sie 70% Ethanol für 2 Minuten in das Röhrchen geben. Schütteln Sie die Röhrchen während der Sterilisation vorsichtig.
3. Entfernen Sie Ethanol durch vorsichtiges Pipettieren und achten Sie darauf, keine Samen zu verlieren. Waschen Sie die Samen, indem Sie dem Röhrchen 5 Minuten lang steriles Wasser hinzufügen, um Ethanolreste zu entfernen (schütteln Sie die Röhrchen während der Waschzeit vorsichtig).
4. Lassen Sie die Samen durch die Schwerkraft auf den Boden des Rohrs sedimentieren und entfernen Sie das restliche Wasser.
5. Spülen Sie die Samen erneut 2x mit sterilem Wasser ab, wie in Schritt 2.3 beschrieben, um sicherzustellen, dass sie frei von Ethanolmerkmalen sind. Lassen Sie die Samen durch die Schwerkraft auf den Boden des Rohrs sedimentieren und entfernen Sie das restliche Wasser.
6. Geben Sie eine gleiche Menge sterilen Wassers in das Röhrchen mit den Samen, um eine Samenwassersuspension zu erzeugen.
7. Verwenden Sie ein Aussaatgitter, um die Samenwassersuspension des angegebenen Genotyps gleichmäßig auf den ausgewählten Bereichen der mittleren Platte zu verteilen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Verteilen Sie die Samen (ca. 30-40) in einer Reihe in jedem Bereich mit einer breiten Pipettenspitze.
8. Lassen Sie das Wasser in den Samenbereichen etwa 30 Minuten trocknen und halten Sie die Platte(n) in einer Laminar-Flow-Haube offen, um eine Kontamination zu vermeiden. Versiegeln Sie die Platte mit Mikroporenband und wickeln Sie sie mit Alufolie ein.
9. Stratifizieren Sie die Samen 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln, um (je nach verwendetem Ökotyp) die Samenruhe zu überwinden und/oder eine gleichmäßige Keimung zu fördern.
10. Übertragen Sie die Platte mit geschichteten Samen für 1 h in weißes Licht (150 μmol/m²/s), um die Keimung einzuleiten (wickeln Sie die Folie nur für die Lichtbehandlung aus).
11. Wickeln Sie die Platte nach der Lichtbehandlung mit Alufolie ein, um die Samen vor Licht zu schützen, und legen Sie sie senkrecht in eine Wachstumskammer und kultivieren Sie sie 4 Tage lang im Dunkeln bei 21 °C.

3. Chlorophyllfluoreszenzmessung und -analyse

1. Schalten Sie das iReenCAM-System ein und stellen Sie sicher, dass das System in der automatisch initiierten PS-Server-Software bereit und ordnungsgemäß konfiguriert ist (z. B. wenn genügend Speicherplatz für die Experimentdaten vorhanden ist, wenn die Fluoreszenzkamera an den PC angeschlossen ist usw.).
2. Aktivieren Sie die Scheduler-Software, um den Versuchsplan für die Messung zu erstellen, indem Sie auf Experimente > Neues Experiment klicken. Geben Sie einen beschreibenden Namen für das Experiment an, und geben Sie die Details (Beschreibung) ein.
3. Legen Sie die erforderlichen Aktionen für das Experiment fest, indem Sie auf Aktion hinzufügen klicken, was zum Zeitplan der experimentellen Aktionen führt.
   HINWEIS: Das Wort Aktion bedeutet hier die Durchführung eines vollständigen Experiments (d. h. einschließlich aller Schritte, die zur Durchführung einer Plattenmessung erforderlich sind).
4. Geben Sie die Bedingungen für eine einzelne runde Messung an (d. h. die Länge der Licht-/Dunkelperiode).
5. Durch Klicken auf Liste generieren definieren Sie die Zeitintervalle zwischen den Messrunden. Wählen Sie die Zeit, zu der die Runde beginnt und endet (insgesamt 4 Stunden) und die Intervalle zwischen den Runden (im aktuellen Setup eine Runde alle 2 Minuten).
6. Klicken Sie auf Generieren und stellen Sie sicher, dass der Zeitrahmen und die Intervalle zwischen den Lichtimpulsen korrekt sind, indem Sie die auf der linken Seite des Bildschirms generierte Liste überprüfen.
7. Wählen Sie das Messprotokoll (Ergänzende Abbildung 2). Speichern Sie alle Änderungen in der Datenbank, um später darauf zurückgreifen zu können.
8. Verwenden Sie kurz vor Beginn der Messung grünes Licht mit geringer Intensität (siehe Materialtabelle) in der Dunkelkammer und stellen Sie die Höhe des Regals in der Messkammer ein oder führen Sie andere Vorbereitungsschritte durch, bevor Sie die Folie von der Petriplatte entfernen. Schalten Sie dann das Licht aus und bringen Sie die Platten in völliger Dunkelheit in die Messkammer.
9. Entfernen Sie vorsichtig die Aluminiumfolie, die die Petriplatte mit den 4 Tage alten Sämlingen bedeckt. Legen Sie die Petriplatte horizontal in die Messkammer des Geräts. Induzieren Sie in der Kammer aktinische Lichtimpulse und führen Sie die Bildgebung gemäß dem in den Schritten 3.1-3.7 festgelegten Versuchsplan (Aktionen) durch.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Platten nicht mit etiolierten Sämlingen beleuchtet werden, bevor sie in die Messkammer gelegt werden. Die Manipulation mit der Platte mit etiolierten Keimlingen muss in der Dunkelkammer/Kammer durchgeführt werden (für einen möglichen Versuchsaufbau siehe Ergänzende Abbildung 3).

4. Datenextraktion und -analyse

1. Öffnen Sie nach Abschluss der Messung das entsprechende Experiment in der Analysesoftware.
2. Um die Fluoreszenz der Sämlinge zu analysieren, generieren Sie zwei Arten von Masken - eine raue (Schalen-) Maske, die den Bereich abdeckt, in dem sich die Sämlinge befinden, und eine präzise (Pflanzen-) Maske, die nur das interessierende Gewebe (typischerweise Keimblätter) abdeckt.
3. Generieren Sie eine Fachmaske, indem Sie auf die Option Neuen Fachtyp erstellen klicken. Ordnen Sie den entsprechenden Bereichen auf dem Plattenbild die entsprechenden Genotypnamen zu.
4. Wählen Sie zum Zuweisen des Genotyps eine Bildnummer bei Runde und klicken Sie dann im oberen Teil des Bildschirms auf Bild laden . Das Bild der Platte wird auf dem Bildschirm angezeigt. Durch Klicken auf eine der Schaltflächen, die verschiedene Zeichenwerkzeuge darstellen (Ergänzende Abbildung 4), rufen Sie den Modus Neue Form auf, mit dem Sie den interessierenden Bereich auf dem Plattenbild zeichnen können. Wählen Sie die erforderlichen Bereiche (z. B. verschiedene Genotypen auf dem Teller) und geben Sie ihre entsprechende Benennung an.
5. Klicken Sie auf Esc , um den Formmodus zu beenden. Speichern Sie die generierte Fachmaske (nachdem Sie einen Namen dafür angegeben haben), indem Sie auf Fachtyp speichern klicken.
6. Gehen Sie einen Schritt zurück und wenden Sie die Maske an, die in den vorherigen Schritten generiert wurde, indem Sie ihren Namen aus der Option Nach Fachtyp ändern auswählen.
7. Um eine Pflanzenmaske mit hoher Genauigkeit zu erzeugen, verwenden Sie das Bild, das nach 180 Minuten Messung (Runde 91) aufgenommen wurde, um den minimalen Schwellenwert für die Intensität des Fluoreszenzsignals festzulegen und die Subtraktion von Hintergrundgeräuschen zu ermöglichen. Entfernen Sie dazu das Häkchen bei Auto Threshold und setzen Sie einen manuellen Schwellenwert auf 0 (Ergänzende Abbildung 4).
8. Klicken Sie auf Vorschau , um sicherzustellen, dass die Tray-Maske alle erforderlichen Bereiche (Genotypen) auf dem Plattenbild abdeckt. Wählen Sie dazu Runde 91 und klicken Sie auf Vorschau aktualisieren.
9. Rufen Sie das Menü Ausführen auf, indem Sie auf Ausführen klicken. Führen Sie die Analyse ausschließlich für Runde 91 durch, indem Sie nur für Runde 91 ein Häkchen setzen. Wählen Sie dann den Ausgabepfad und klicken Sie auf Analyse starten.
10. Nach Abschluss der Analyse wird das Menü Fertig stellen automatisch geöffnet. Wählen Sie die ausgeführte Runde (es wird die einzige sein) aus den Experimenten aus und klicken Sie auf Switch Analyzer to Analyze Data, um die Daten für diesen bestimmten Zeitpunkt (Runde 91) zu exportieren.
11. Extrahieren Sie die .xsel-Datei aus dem exportierten Archiv, da diese Datei die wesentlichen Pflanzenmaskeninformationen enthält, indem Sie auf das Symbol Exportteil öffnen klicken.
12. Öffnen Sie das Experiment erneut, indem Sie auf das Symbol Lokales Analyseteil öffnen klicken. Rufen Sie das Menü Mask Builder erneut auf, klicken Sie auf Bild laden, wählen Sie Runde 1 und dann Aus Datei laden in der oberen rechten Ecke des Bildschirms und laden Sie die zuvor extrahierte .xsel-Datei. Das Bild der Platte wird mit angewendeter Tablettmaske angezeigt.
13. Speichern Sie die Maske, indem Sie auf Fachtyp speichern klicken, und wenden Sie sie an, indem Sie ihren Namen in der Option Nach Fachtyp ändern auswählen.
14. Generieren Sie die Pflanzenmaske, indem Sie den Schwellenwert für die Intensität des Fluoreszenzsignals anpassen. Erhöhen Sie den Wert des manuellen Schwellenwerts , bis die im Vorschaumenü generierte Maske perfekt zum ROI (z. B. Keimblätter) in jedem der Genotypen passt (Ergänzende Abbildung 4). Überprüfen Sie, ob die Maske zu allen Runden der Messungen passt, indem Sie im Vorschaumenü durch die Runden scrollen (die Überprüfung der richtigen Maskenpositionierung bei Runde 1, 61 und 121 sollte ausreichen).
15. Führen Sie die Analyse für alle Messrunden durch und exportieren Sie Daten.
    HINWEIS: Die Ausgabedatei enthält Chlorophyllfluoreszenzwerte eines bestimmten Genotyps für jeden Zeitpunkt, was die Erstellung von Diagrammen nach Wahl ermöglicht und die weitere statistische Auswertung erleichtert.

Der typische Output, der mit dem neu entwickelten Verfahren in den 4 Tage alten entetiolierten Arabidopsis-Sämlingen des Wildtyps (WT), Ökotyp Columbia-0 (Col-0) erzielt wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt. Unter Kontrollbedingungen (DMSO-supplementierte MS-Medien) beginnt die Chlorophyll-Biosynthesekurve mit einem anfänglichen Ausbruch der Chlorophyllsynthese, bei dem der während der scotomorphogenen Phase des Wachstums synthetisierte Protochlorphyllidpool aufgrund der lichtinduzierten PORs schnell in Chlorophyll umgewandelt wird ^7,8,9. Die Anfangsphase der schnellen Chlorophyllakkumulation dauert ca. 10 min, gefolgt von einer Verzögerungsphase, in der die Minima des dunkelsynthetisierten Protochlorophyllids erreicht werden (ca. 30 min nach Bestrahlung; zur HPLC-gemessenen Protochlorophyllidkurve siehe⁷). Während der Verzögerungsphase werden die Chlorophyll-Biosynthesegene hochreguliert¹⁰, was zu einer lichtinduzierten Produktion von Protochlorophyllid führt. Das neu synthetisierte Protochlorophyllid wird umgehend in Chlorophyll umgewandelt, das als exponentielle Phase nachweisbar ist (im Falle von WT Col-0 ab ca. 120 min nach der Bestrahlung) und mit einer weiteren Verzögerungsphase etwa 4 h nach der Entetiolierung des Keimlings endet (Abbildung 3). In Gegenwart von 6-Benzylaminopurin (BAP) sind die ersten signifikanten Unterschiede während der exponentiellen Phase⁷ nachweisbar, was auf eine negative Wirkung von BAP auf die Chlorophyllkinetik in späteren Stadien der Chlorophyllbiosynthese hindeutet (etwa 2 h nach Beginn der Beleuchtung mit aktinischem Licht; Abbildung 3).

Für den Vergleich verschiedener Erkrankungen und/oder Genotypen ist eine Normalisierung der Rohdaten erforderlich. Da bei etiolierten Keimlingen unter verschiedenen Bedingungen und/oder unterschiedlichen Genotypen kein Chlorophyll mittels HPLC nachweisbar war, führten wir die Normalisierung (F/F0) auf die T0-Fluoreszenzwerte (F0) durch, die für die entsprechende Behandlung und/oder den Genotyp⁷ gemessen wurden. Um die Bedeutung der Normalisierung zu demonstrieren, präsentieren wir sowohl Rohdaten als auch die Daten, die auf den mittleren Chlorophyll-Fluoreszenzwert der Kontrolle normiert sind, gemessen bei T0 (F0; Abbildung 3A bzw. Abbildung 3B).

Abbildung 1: Übersicht über das Messgeräteprotokoll. Das Schema der iReenCAM-Mess- und Analysepipeline. (A) Probenvorbereitung durch rasterdefinierte Saatgutaussaat, Schichtung, Lichtinduktion der Keimung und vertikal ausgerichtete Petriplattenkultivierung in der Dunkelheit. (B) Das Steuermodul für die automatische und programmierbare Bilderfassung und Datenverwaltung auf der Grundlage der PlantScreen-Phänotypisierungs-SW-Toolbox organisiert den Betrieb des gesamten Systems, indem es den HW-Betrieb mit dem benutzerdefinierten Mess- und Analyseprotokoll steuert und synchronisiert. (C) Das Messprotokoll ist für dynamische Messungen der fluoreszierenden Probenbilder in 2-Minuten-Intervallen für insgesamt 4 Stunden, d.h. 120 Messrunden, ausgelegt. Der visuelle Zeitrahmen des repräsentativen Falschfarbenbildes von vertikal ausgerichteten 4 Tage alten Arabidopsis-Sämlingen, die zum Zeitpunkt von 180 Minuten aufgenommen wurden, wird für die ROI-Maskengenerierung verwendet. (D) Die Maske, die den ROI für ein Gewebe von Interesse (z. B. Keimblatt, Hypokotyl oder Wurzelzone) definiert, wird auf den visuellen Zeitrahmen angewendet, die Hintergrundsubtraktion wird durchgeführt und die Pixel-für-Pixel-Fluoreszenzwerte für jeden ROI (definiert durch die Pflanzenmaske) aus allen Messrunden werden extrahiert. Schließlich werden die Rohdaten (Fluoreszenz F) auf den mittleren Fluoreszenzwert bei T0 (F0) normiert. Maßstabsleisten = 1 cm (A) und 0,25 cm (C). Die Zahl wurde von⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Saatgutablage. Die Abbildung zeigt das Platzieren von Arabidopsis-Samen auf der Petriplatte mit lichtdichten Kanten unter Verwendung des Sägegitters. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Chlorophyllakkumulationskinetik in den frühen Stadien der Arabidopsis-Deetiolierung . Etiolierte WT Col-0-Sämlinge wurden auf Medien gezüchtet, die mit BAP oder DMSO (Mock) ergänzt wurden. (A) Der Mittelwert ± SD (schattierter Bereich), n=9 der Rohdaten und (B) Daten, normiert auf den mittleren Fluoreszenzwert bei T0 (F0). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Aussaatgitter. Links: Aussaatgitter mit umrandeten rechteckigen Kästchen zum Platzieren der Samen jedes Genotyps in einem Messfleck, der sich im Bereich der aktinischen Lichthomogenität (Lichtintensität ≥ 0,7 der maximalen Lichtintensität) befindet. Rechts: Schematische Darstellung von 4 Tage alten, etiolierten Arabidopsis-Sämlingen , die für die Analyse gezüchtet wurden. Das Aussaatgitter bietet ein mögliches Schema für die Positionierung von Arabidopsis-Saatgut , das eine leichte Homogenität und eine angemessene Saatgutdichte gewährleistet (jeder Schlitz kann für die Saatgutablage verwendet werden, da die Größe eines Schlitzes, der Abstand zwischen den Schlitzen und die Lichthomogenität im Bereich des Gitters vereinheitlicht werden). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Fluoreszenzmessprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Experimentelle Konfiguration, die es ermöglicht, unerwünschte Lichteinwirkung zu vermeiden. (A) Das Messgerät wird im begehbaren Phytotron platziert, (B) in die durch eine lichtdichte Tür getrennte Kammer. (C) Die In-vitro-Kultivierungsboxen (rote Pfeilspitze), die für das Wachstum der etiolierten Sämlinge unter definierten Bedingungen (Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit) bestimmt sind, befinden sich direkt unter dem Gerät (gelbe Pfeilspitze), um das Risiko einer Lichteinwirkung zu minimieren. Die Quelle des grünen Dämmerlichts (blaue Pfeilspitze) ist an der Wand neben dem Steuer-PC (orangefarbene Pfeilspitze) montiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Verfahren zur Maskengenerierung im Workflow mit der PS Data Analyzer-Software. Drucken Sie Screenshots der einzelnen Schritte, die für die Generierung der Tray-Maske (Schritte 4.3-4.6) und Pflanzenmaske (Schritt 4.12) und Datenanalyse (Schritte 4.7 und 4.13) durchgeführt werden müssen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Die Aussaatdichte beeinflusst die Messvariabilität. Chlorophyllakkumulationskinetik in 4 Tage alten, etiolierten Arabidopsis WT Col-0-Sämlingen, die (A) separat (als einzelne Keimlinge, hier n=5) oder in einer Gruppe von (B) hoher (HD, n=30-40) oder (C) niedriger Dichte (LD, n=10-15) angebaut wurden. Das n entspricht der Anzahl der Setzlinge pro Schlitz des Aussaatgitters, die Daten stellen die Mittelwerte ± SD (schattierter Bereich) dar. Die hohe oder niedrige Dichte entspricht der Anzahl der Setzlinge pro Schlitz des Aussaatgitters wie erwähnt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Anbauintervall und Platz erfordern eine artspezifische Optimierung. Wachstum verschiedener Pflanzenarten unter Verwendung des Arabidopsis-optimierten Protokolls. (A) Saatgutablage auf dem Aussaatgitter. (B) 4 Tage alte, etiolierte Sämlinge von (von links nach rechts) Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Crambe abyssinica. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Kritische Schritte des Protokolls und Fehlerbehebung - kein Licht und kümmern Sie sich um die Maske
Wie direkt in der obigen Protokollbeschreibung hervorgehoben, ist es von entscheidender Bedeutung, selbst Spuren von Licht sowohl während der Kultivierung von etiolierten Pflanzensämlingen als auch kurz vor Beginn des Protokolls zu vermeiden¹¹. In unserem Aufbau verwenden wir eine spezielle dunkle Kammer, die sich im begehbaren Phytotron befindet und durch eine lichtdichte Drehtür vom Rest des Phytotrons getrennt ist (Ergänzende Abbildung 3). Die Kammer ist mit einem Pflanzenanbauraum und einer Werkbank ausgestattet, die es ermöglicht, das Gerät zusammen mit dem Steuer-PC und dem Abzug unterzubringen. Dies ermöglicht es uns, die Pflanzen sowohl im Dunkeln zu züchten als auch die Messung zu starten, ohne dass ein Plattentransport erforderlich ist.

Die Art und Weise der Pflanzenkultivierung und der Maskengenerierung ist entscheidend für die anschließende Quantifizierung des Chlorophyllfluoreszenzsignals über den vorgeschlagenen Assay. Man sollte vermeiden, Klumpen von Geliermittel oder kleinen visuellen Müll/Staub in die Medien zu bekommen, da dies zu Lichtreflexionen führen kann. Da die Erkennung der Chlorophyllfluoreszenz durch die Software durch die Maske begrenzt ist, wird ein Pflanzenbereich, der nicht von der Maske abgedeckt wird, einfach nicht von der Software analysiert. Während der 4-stündigen Messung wachsen/bewegen sich die Sämlinge ein wenig, daher kann die vorgesehene Maske Anpassungen erfordern, da sie möglicherweise nicht durch alle Messrunden passt, um die genaue Quantifizierung der Signalintensität zu gewährleisten. Unserer Erfahrung nach scheint die unvollkommene Maskendefinition die Hauptquelle der Variabilität zu sein. Während der Optimierungsexperimente überwachten wir die Veränderungen in der Variabilität der Chlorophyllfluoreszenzwerte, die für die Analyse in i) einzelnen Sämlingen und einer Gruppe von Sämlingen mit ii) höherer (30-40 Samen) und iii) niedrigerer (10-15 Samen) Aussaatdichte verwendet wurden (Ergänzende Abbildung 5). Wir haben eine höhere Dichte der Saatgutaussaat verwendet, da sie die geringste Variabilität aufwies. Die höhere Variabilität bei Einzelsämlingen/geringerer Aussaatdichte ist vor allem auf den höheren Anteil der Pixel am Rand zwischen Signal und Hintergrund und die leichte Bewegung der Keimlinge während des 4-stündigen Messintervalls zurückzuführen.

Um sicherzustellen, dass alle Maße korrekt sind, überprüfen Sie, ob die Pflanzenmaske in die erste Runde passt, dann in die 15^., 30^., 45^., 60^., 75^{. und so} weiter bis zur letzten (indem Sie die Nummer der Runde auswählen und auf Vorschau aktualisieren klicken). Dies dauert nur ein paar Minuten, stellt aber sicher, dass der gesamte Keimblattbereich abgedeckt und ausgewertet wird. Wenn die Pflanzenmaske in einer Runde nicht passt (der erforderliche Bereich ist nicht vollständig bedeckt), teilen Sie das Experiment in mehrere Teile. Führen Sie dann das Protokoll ab Schritt 4 (4.1-4.13) durch, um für jeden Teil des Experiments eine spezifische Maske separat zu erstellen. Wenn Sie beispielsweise die Verschiebung der Pflanzenmaske in der Runde 60-61 (oder etwas früher) bemerken, teilen Sie das Experiment in zwei Teile auf - 1^{. Teil (} 1-60 Runden) und 2^{. Teil (} 61-121 Runden). Für den 1^. Teil verwenden Sie das Bild von Runde 41, um eine Pflanzenmaske zu generieren, und für den 2^. Teil verwenden Sie Runde 91. Achten Sie bei der Analyse der Daten in Schritt 4.13 darauf, die Runden entsprechend dem entsprechenden Teil des Experiments auszuwählen (z. B. Runden 1-60 für den ersten Teil und 61-121 für den zweiten, wie im obigen Beispiel), bevor Sie auf Analysieren klicken. Bei der Arbeit mit Arabidopsis ist die Bewegung der Pflanzen vernachlässigbar, da sie eher langsam wachsen, aber wenn man das Protokoll für verschiedene Arten (siehe unten) anwendet, sollte das Wachstumstempo berücksichtigt werden.

Änderungen und Einschränkungen
Die Anzahl der Parameter kann geändert werden, einschließlich der Intensität und Wellenlänge des aktinischen Lichts und/oder des Lichts, das zwischen den Intervallen der aktinischen Lichtanwendung angewendet wird. Das Messgerät umfasst das integrierte, vollmotorisierte und softwaregesteuerte Filterrad. Somit könnte der Messalgorithmus, der für die Quantifizierung anderer Pigmente, typischerweise auch Produkte des Tetrapyroll-Biosynthesewegs ^10,12, geeignet ist, im Falle der Zugabe der entsprechenden Filter in das Protokoll aufgenommen werden.

Wie bereits erwähnt, kann das Protokoll nicht nur für Arabidopsis-Pflanzen verwendet werden. Bei der Arbeit mit anderen Pflanzenarten sollte jedoch jeder Schritt des Protokolls unter Berücksichtigung der artspezifischen Merkmale, einschließlich der Keim- und Wachstumsrate und/oder der Größe, entsprechend überarbeitet werden (Ergänzende Abbildung 6).

Eine der wichtigsten Einschränkungen des Protokolls ist die Zeitspanne, in der die Chlorophyll-Quantifizierungsanalyse durchgeführt werden kann. Nachdem Chlorophyll in die Photosystemkomplexe integriert wurde, wird das Fluoreszenzsignal durch den Energieverbrauch der Photosynthese verzerrt (die sogenannte variable Chlorophyllblüte ist vorhanden), wie in späteren Stadien der Entetiolierung beobachtet wurde¹³. Wie mit dem OJIP Transients Assay^14,15 untersucht, waren mit diesem Versuchsaufbau während der ersten 4 Stunden der Entetiolierung keine Anzeichen von photosynthetischer Aktivität nachweisbar⁷. Wenn jedoch angenommen wird, dass der verlängerte Zeitraum der Photomorphogenese untersucht wird, sollten der Grad der Photosystemassemblierung und der mögliche Einfluss der Photosynthese auf die Gesamtfluoreszenzwerte getestet werden.

Abschließend sollte erwähnt werden, dass unser Protokoll, das auf den Fluoreszenzmessungen basiert, eine relative, nicht absolute Chlorophyllquantifizierung ermöglicht. Wenn eine absolute Quantifizierung erforderlich ist, muss eine entsprechende Kalibrierung mit einem alternativen, z. B. HPLC-Ansatz, durchgeführt werden.

Signifikanz gegenüber bestehenden Methoden - einfache, schnelle und statistisch robuste Chlorophyll-Quantifizierung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Echtzeit-Detektion und Quantifizierung von Chlorophyll in lebenden Arabidopsis-Keimlingen in frühen Stadien der Entetiolierung. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, die hauptsächlich auf der Chlorophyllextraktion aus abgelöstem Pflanzenmaterial^{beruhen 16,17} oder kürzlich entwickelten optischen Methoden^18,19 ist dieser Ansatz rein nicht-invasiv und ermöglicht die Quantifizierung von Chlorophyll durch In-vivo-Messung der Fluoreszenzintensität. Außerdem sind keine zusätzlichen Reagenzien für die Probenvorbereitung erforderlich, wie bei anderen bestehenden Alternativmethoden, einschließlich der oben genannten HPLC- oder Spektrophotometrie-basierten Ansätze. Das neu eingeführte Protokoll ist einfach, schnell und genau, wie zuvor mit HPLC⁵ verifiziert wurde. Unter Verwendung der Standardprotokolleinstellungen wird die endgültige Kurve einer einzelnen biologischen Wiederholung aus 120 Messpunkten (Fluoreszenzintensitätsmittel) erstellt, die während 4 h der Messung aufgenommen wurden und jeweils aus bis zu 15 Messpunkten bestehen. Typischerweise enthält die endgültige Kurve die Daten von drei biologischen Repliken (z. B. drei unabhängig präparierte Platten) und drei Messpunkten (drei technische Repliken), die jeweils aus 30-40 Sämlingen bestehen. Somit werden in jedem Zeitintervall etwa 300 Sämlinge untersucht, was einen statistisch robusten Datensatz liefert, der es ermöglicht, selbst kleine Unterschiede zuverlässig zu erkennen, wie sie an Mutanten gezeigt wurden, die in verschiedenen Schritten der Chlorophyllbiosynthese betroffen sind⁷. Hier ermutigen wir den Benutzer, den kürzlich entwickelten statistischen Ansatz auf der Grundlage verallgemeinerter linearer Mischmodelle in Kombination mit klassischen Zeitreihenmodellen als geeignetes Werkzeug für die Analyse der Chlorophyllkinetik²⁰ zu verwenden.

Zukünftige Anwendungen der Technik - schnelles und kostengünstiges Screening
Die oben genannten Eigenschaften machen diesen Ansatz zu einem nützlichen Werkzeug, das sich für ein schnelles und kostengünstiges Screening und eine hochpräzise Quantifizierung von Merkmalen eignet, die (direkt oder indirekt) mit der Chlorophyllbiosynthese verbunden sind. Dies könnte Studien umfassen, die das genetische Vorwärtsscreening einsetzen, um die komplexen und mehrstufigen Regulierungen der Chlorophyllbiosynthese besser zu charakterisieren 10,12,21. In Anbetracht der Möglichkeit einer Behandlung mit verschiedenen Verbindungen ist das Protokoll auch sehr wertvoll, um beispielsweise die Bedeutung lichtvermittelter hormoneller Regulation^22,23 oder das Screening auf niedermolekulare Verbindungen mit möglichen Auswirkungen auf die Kinetik der Chlorophyllakkumulation zu untersuchen.

Z.B. und K.P. sind Mitarbeiter des PSI und Martin Trtilek ist CEO und Eigentümer der PSI-Firma, die die iReenCAM herstellt. Alle diese Autoren waren an der Entwicklung des Instruments beteiligt, wie bereits beschrieben⁷.

Diese Arbeit wurde durch das Europäische Fonds für regionale Entwicklung-Projekt SINGING PLANT (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dieses Projekt wurde durch das Projekt MSCA4Ukraine (ID 1233580) gefördert, das von der Europäischen Union finanziert wird. Wir danken Lenka Sochurkova für die grafische Gestaltung von Abbildung 1.