애기장대 탈에티올화의 초기 단계 동안 엽록소 생합성 역학 측정을 위한 비침습적 분석

여기에서는 애기장대 묘목 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소 생합성 모니터링을 위해 설계된 고급 도구에 대해 설명합니다. 이 새로운 방법론은 높은 공간 및 시간 분해능에서 비침습적 실시간 엽록소 형광 이미징을 제공합니다.

엽록소 생합성은 식물 수명 주기에서 가장 극적인 단계 중 하나인 탈에티올화의 특징입니다. 엽록소 생합성의 엄격하게 제어되고 매우 역동적인 과정은 현화 식물에서 어둠에서 빛으로 이동하는 동안 촉발됩니다. 에티올화된 묘목이 햇빛의 첫 번째 흔적에 노출되는 순간, 프로토클로로필라이드가 클로로필라이드로 빠르게(초 순서로) 전환되는 것은 독특한 빛을 받아들이는 단백질 복합체에 의해 매개되어 후속 대사 단계를 통해 완전한 기능의 엽록소 생산으로 이어집니다. 엽록소 함량 분석을 위한 표준 기법에는 분리된 식물 조직에서 색소를 추출하는 것이 포함되는데, 이는 이러한 빠른 과정을 연구하는 데 적용되지 않습니다. 빛에 의한 탈에티올레이션 후 처음 몇 시간 동안 높은 정확도와 시공간 분해능으로 in vivo 엽 록소 역학을 조사하기 위해 기기와 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에서는 애기장대 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소의 통계적으로 강력한 정량화를 위해 고안된 자세한 절차를 제시합니다.

탈에티올레이션(de-etiolation)은 식물 생애 주기에서 가장 극적인 단계를 나타내며, 식물 대사의 여러 형태학적 변화와 완전한 재배열(이질영양에서 자가수로)^을 특징으로 합니다1. 엽록소 생합성은 식물에서 빛에 의한 탈에티올화의 특징이며 매우 역동적인 과정입니다. 어둡게 생성된 전구체 프로토클로로필라이드(protochlorophyllide)로부터의 엽록소 형성은 반응성 부산물로 인한 손상을 피하기 위해 긴밀하게 조정되어야 한다². 클로로필라이드로의 프로토클로로필라이드 환원은 빛에 의해 직접 활성화되는 독특한 효소인 광 의존성 프로토클로로필라이드 산화환원효소(POR)에 의해 촉매됩니다. 반응은 매우 빠르며, ms 내지 s³ 의 순서로 일어나며, 에티올화 묘목 조사 ^4,5,6 후 몇 분 이내에 인식 가능한 엽록소 축적을 유도한다. 엽록체 생물 발생이 완전한 기능을 하는 광합성 장치를 확립하기 위해서는 더 많은 시간(몇 시간에서 며칠)이 필요하다³.

엽록소 함량을 분석하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 분광광도법을 포함한 다양한 방법이 있습니다. 일반적으로 이러한 기술은 식물 조직 ^4,5,6의 파괴를 요구하여 시간 경과에 따른 엽록소 수준의 변화를 측정하는 것을 제한합니다. 비침습적 엽록소 역학 확립을 허용하는 방법은 시간과 공간에서 엽록소 합성 과정을 분석하는 것과 같은 기초 연구 질문에서 응력 내성 또는 엽록소 역학에 대한 생체 자극제의 효과 평가와 같은 보다 실용적인 응용 분야에 이르기까지 다양한 측면에서 식물을 연구하는 완전히 새로운 관점을 열 수 있습니다. 이를 고려하여 엽록소 형성을 모니터링하는 시스템인 iReenCAM⁷을 도입했습니다. 여기에는 CCD 카메라, 방출 필터, 광원 및 자동 형광 분석을 위한 파이프라인이 통합되어 있습니다(그림 1). 개발된 장치의 주요 특징은 높은 공간 및 시간 분해능, 현재 접근 방식에 사용되는 매개변수에서 우수한 성능, 표준 분석 방법과 비교할 때 충분한 민감도 및 특이성입니다⁷.

여기에 설명된 비침습적 절차는 최소한의 시약을 필요로 하며 간단한 단계로 구성되므로 탈에티올화의 매우 초기 단계에서 살아있는 애기장대 묘목에서 엽록소 역학 프로파일을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 식물 조직을 분리할 필요 없이 기원에서 외인성(염분, 가뭄, 생물 자극제, 중금속 등) 및 내인성(일반적으로 유전자 활성의 변화와 관련됨)의 여러 요인에 의해 영향을 받는 매우 역동적인 엽록소 합성 과정의 연구에 유용할 수 있으므로 추가 스트레스를 피할 수 있습니다.

1. 배지 준비

1. 유리병에 겔화제 0.75g과 멸균 탈이온수 50mL를 혼합하여 페트리 플레이트(120 x 120 x 17mm) 1개에 대해 1.5%(w/v) 농도를 달성하여 배양 배지를 준비합니다. 혼합물을 부드럽게 흔든 다음 겔화제가 녹을 때까지 끓을 때까지 전자레인지에 가열합니다(용액이 투명해짐).
2. 다음 단계를 진행하기 전에 매체를 58-60°C로 식히십시오. 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 후드 내의 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
3. 측정 중 과도한 광선 광 반사와 높은 배경 자가형광을 피하기 위해 빛이 새지 않는 가장자리가 있는 페트리 플레이트를 사용하십시오. 이를 위해 검은색 접착 테이프(또는 사용 가능한 다른 방법)를 적용하여 빈 페트리 플레이트의 모든 면을 덮습니다(그림 2).
4. 테이프를 붙인 후 살균제 UV 램프를 20-30분 동안 조사하여 플레이트를 살균합니다.
5. 실험에 화학적 처리(예: 비생물적/생물적 스트레스 요인, 식물 호르몬 및/또는 성장 조절제 등)가 포함된 경우 적절한 양의 해당 화학 물질을 배지에 직접 첨가합니다. 선택한 화학적 안정성이 매체에 추가되는지 알고 있어야 합니다(예: 화학 물질이 내열성이 아닌 경우 플레이트에 붓기 직전에 냉각될 때 매체에 추가). 화학 물질이 고르게 분포되도록 흔들어 매체를 완전히 혼합하십시오.
6. 매체를 부은 후 UV 광선에 대한 플레이트의 조명을 피하십시오(실험을 방해할 수 있는 산소 라디칼 생성으로 이어질 수 있음).
7. 준비된 배지를 정사각형 페트리 플레이트에 붓고 매체가 실온에서 응고되도록 합니다.

2. 종자 표면 살균 및 식물 성장 조건

1. 스톡 보크(10-20mg)에서 필요한 양의 애기장대 thaliana Col-0 씨앗을 가져와 2mL 미세 원심분리 튜브에 추가합니다.
   참고: 다른 애기장대 라인(에코타입/돌연변이 라인)으로 작업하는 동안 특정 수정이 필요하지 않습니다. 톱질 그리드의 수정 및 측정 단계는 종자 크기, 발아 속도 및 묘목 크기의 차이를 고려하여 다른 식물 종에 대해 수행되어야 합니다.
2. 애기장대 씨앗을 튜브에 70% 에탄올을 2분 동안 첨가하여 표면 살균합니다. 멸균하는 동안 튜브를 부드럽게 흔듭니다.
3. 씨앗이 손실되지 않도록 주의하면서 조심스럽게 피펫팅하여 에탄올을 제거합니다. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 5분 동안 튜브에 멸균수를 추가하여 씨앗을 씻습니다(세척 기간 동안 튜브를 부드럽게 흔듭니다).
4. 중력에 의해 씨앗이 튜브 바닥에 침전되도록하고 남은 물을 제거하십시오.
5. 2.3단계에서 설명한 대로 멸균수로 씨앗을 다시 헹구어 에탄올 특성이 없는지 확인합니다. 중력에 의해 씨앗이 튜브 바닥에 침전되도록하고 남은 물을 제거하십시오.
6. 씨앗이 들어있는 튜브에 동일한 양의 멸균수를 추가하여 씨앗-물 현탁액을 만듭니다.
7. 파종 그리드를 사용하여 주어진 유전자형의 종자-물 현탁액을 중간 플레이트의 선택된 영역에 고르게 분포시킵니다(그림 2 및 보충 그림 1). 넓은 피펫 팁을 사용하여 각 영역에 씨앗(약 30-40개)을 일렬로 분배합니다.
8. 씨앗 부분에서 물을 약 30분 동안 건조시키고 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 플레이트를 열어 둡니다. 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일로 감쌉니다.
9. 어둠 속에서 4 °C에서 3 일 동안 씨앗을 층화하여 (사용 된 생태 유형에 따라 다름) 종자 휴면을 극복하고 / 또는 균일 한 발아를 촉진합니다.
10. 층화된 씨앗이 있는 플레이트를 백색광(150μmol/m²/s)에 1시간 동안 옮겨 발아를 유도합니다(광 처리를 위해서만 호일의 포장을 풉니다).
11. 광처리 후 알루미늄 호일로 판을 싸서 씨앗을 빛으로부터 보호하고 생장실에 수직으로 놓고 21°C의 어두운 곳에서 4일간 재배합니다.

3. 엽록소 형광 측정 및 분석

1. iReenCAM 시스템을 켜고 시스템이 준비되고 자동으로 시작된 PS 서버 소프트웨어에서 올바르게 구성되었는지 확인합니다(예: 실험 데이터를 위한 충분한 저장 공간이 있는 경우, 형광 카메라가 PC에 연결된 경우 등).
2. 스케줄러 소프트웨어를 활성화하여 실험 > 새 실험을 클릭하여 측정을 위한 실험 계획을 생성합니다. 실험에 대한 설명이 포함된 이름을 제공하고 세부 정보(설명)를 입력합니다.
3. Add Action(작업 추가)을 클릭하여 실험에 필요한 작업을 설정하면 실험 작업 일정이 표시됩니다.
   알림: 여기서 액션이라는 단어는 완전한 실험(즉, 하나의 플레이트 측정을 수행하는 데 필요한 모든 단계 포함)을 수행하는 것을 의미합니다.
4. 단일 라운드 측정을 위한 조건(즉, 명암/암흑 기간의 길이)을 지정합니다.
5. 목록 생성(Generate List)을 클릭하여 라운드 측정 사이의 시간 간격을 정의합니다. 라운드가 시작되고 끝나는 시간(총 4시간)과 라운드 사이의 간격(현재 설정에서는 2분마다 한 라운드)을 선택합니다.
6. Generate(생성)를 클릭하고 화면 왼쪽에 생성된 목록을 확인하여 조명 임펄스 사이의 시간 프레임과 간격이 올바른지 확인합니다.
7. 측정 프로토콜을 선택합니다(보충 그림 2). 나중에 참조할 수 있도록 데이터베이스에 대한 모든 수정 사항을 저장합니다.
8. 측정이 시작되기 직전에 암실 내부에서 저강도의 녹색 조명( 재료 표 참조)을 사용하고 페트리 플레이트에서 호일을 제거하기 전에 측정 챔버 내부의 선반 높이를 조정하거나 기타 준비 단계를 수행합니다. 그런 다음 조명을 끄고 완전한 어둠 속에서 플레이트를 측정 챔버로 옮깁니다.
9. 4일 된 묘목이 들어 있는 페트리 플레이트를 덮고 있는 알루미늄 호일을 조심스럽게 제거합니다. 페트리 플레이트를 장치 측정 챔버 내부에 수평으로 놓습니다. 챔버 내부에서 광선 펄스를 유도하고 3.1-3.7단계에서 설정한 실험 계획(작업)에 따라 이미징을 수행합니다.
   알림: 측정 챔버에 넣기 전에 에티올화된 묘목이 있는 플레이트의 조명을 피하는 것이 중요합니다. 에티올화된 묘목이 있는 플레이트를 사용한 조작은 암실/챔버에서 수행해야 합니다(가능한 실험 설정은 보충 그림 3 참조).

4. 데이터 추출 및 분석

1. 측정을 완료한 후 분석기 소프트웨어에서 해당 실험을 엽니다.
2. 묘목의 형광을 분석하려면 묘목이 있는 영역을 덮는 거친(트레이) 마스크와 관심 조직(일반적으로 자엽)만 덮는 정밀한(식물) 마스크의 두 가지 유형의 마스크를 생성합니다.
3. Create New Tray Type(새 트레이 유형 만들기) 옵션을 클릭하여 트레이 마스크를 생성합니다. 플레이트 이미지의 각 영역에 적절한 유전자형 이름을 할당합니다.
4. 유전자형을 할당하려면 Round(라운드 )에서 이미지 번호를 선택한 후 화면 상단의 Load Image(이미지 불러오 기)를 클릭합니다. 플레이트의 이미지가 화면에 표시됩니다. 다양한 모양 그리기 도구(보충 그림 4)를 나타내는 버튼 세트 중 하나를 클릭하여 플레이트 이미지에 관심 영역을 그릴 수 있는 새 모양 모드로 들어갑니다. 필요한 영역(예: 플레이트의 다른 유전자형)을 선택하고 적절한 이름을 제공합니다.
5. Esc를 클릭하여 모양 모드를 종료합니다. Store Tray Type(트레이 유형 저장)을 클릭하여 생성된 트레이 마스크를 저장(이름을 제공한 후)합니다.
6. 한 단계 뒤로 돌아가서 트레이 유형별 변경 옵션에서 이름을 선택하여 이전 단계에서 생성된 마스크를 적용합니다.
7. 높은 정확도로 식물 마스크를 생성하려면 180분 측정(91분) 후 획득한 이미지를 사용하여 형광 신호 강도에 대한 최소 임계값을 설정하여 배경 노이즈를 제거할 수 있습니다. 이를 위해 Auto Threshold(자동 임계값 )에서 틱을 제거하고 Manual Threshold(수동 임계값 )를 0으로 설정합니다(보충 그림 4).
8. Preview(미리 보기)를 클릭하여 트레이 마스크가 플레이트 이미지에서 필요한 모든 영역(유전자형)을 포함하는지 확인합니다. 이를 위해 라운드 91을 선택하고 미리보기 새로 고침을 클릭합니다.
9. Run(실행)을 클릭하여 Run(실행) 메뉴로 들어갑니다. 91 라운드에만 체크 표시를 하여 91 라운드에 대해서만 분석을 실행합니다. 그런 다음 출력 경로를 선택하고 분석 시작을 클릭합니다.
10. 분석이 완료되면 마침 메뉴가 자동으로 열립니다. 실험에서 실행된 라운드(유일한 라운드)를 선택하고 분석기를 분석된 데이터로 전환 을 클릭하여 이 특정 시점(91라운드)에 대한 데이터를 내보냅니다.
11. 내보낸 아카이브에서 .xsel 파일을 추출합니다. 이 파일에는 부품 내보내기 열기(Open Export Part ) 아이콘을 클릭하여 필수 식물 마스크 정보가 포함되어 있습니다.
12. Open Local Analysis Part 아이콘을 클릭하여 실험을 다시 엽니다. 마스크 빌더 메뉴에 다시 들어가 이미지 로드를 클릭하고 1라운드를 선택한 다음 화면 오른쪽 상단의 파일에서 로드를 선택하고 이전에 추출한 .xsel 파일을 로드합니다. 트레이 마스크가 적용된 플레이트의 이미지가 표시됩니다.
13. Store Tray Type(트레이 유형 저장)을 클릭하여 마스크를 저장하고 Change by Tray Type(트레이 유형별 변경) 옵션에서 이름을 선택하여 적용합니다.
14. 형광 신호 강도 임계값을 조정하여 식물 마스크를 생성합니다. 미리보기 메뉴에서 생성된 마스크가 각 유전자형의 ROI(예: 자엽)에 완벽하게 맞을 때까지 수동 임계값 값을 늘립니다(보충 그림 4). 미리보기 메뉴에서 라운드 전체를 스크롤하여 마스크가 모든 측정 라운드에 맞는지 확인합니다(라운드 1, 61 및 121에서 적절한 마스크 위치를 확인하는 것으로 충분해야 함).
15. 모든 측정 라운드에 대한 분석을 수행하고 데이터를 내보냅니다.
    참고: 출력 파일에는 각 시점에 대해 주어진 유전자형의 엽록소 형광 값이 포함되어 있어 선택한 차트를 구성할 수 있고 추가 통계 평가를 용이하게 할 수 있습니다.

야생형(WT), 생태형 Columbia-0(Col-0)의 4일 된 탈에티올화된 애기장대 묘목에서 새로 개발된 절차를 사용하여 얻은 일반적인 출력은 그림 3에 나와 있습니다. 제어 조건(DMSO 보충 MS 배지)에서 엽록소 생합성 곡선은 엽록소 합성의 초기 버스트로 시작하며, 여기서 성장의 스코토모르포겐 단계 동안 합성된 프로토클로르필라이드 풀은 빛에 의해 유도된 POR ^7,8,9로 인해 엽록소로 빠르게 전환됩니다. 빠른 엽록소 축적의 초기 단계는 약 10분이 소요되며, 그 후 지연 단계가 이어지며, 이 기간 동안 암흑 합성된 프로토클로로필라이드의 최소값에 도달합니다(조사 후 약 30분, HPLC 측정 프로토클로로필라이드 곡선은⁷ 참조). 지연 단계(lag phase) 동안, 엽록소 생합성 유전자는 상향 조절되어⁽¹⁰), 프로토클로로필라이드(protochlorophyllide)의 빛-유도 생산으로 이어진다. 새로 합성된 프로토클로로필라이드는 즉시 엽록소로 전환되어 지수 상(WT Col-0의 경우 방사선 조사 후 약 120분에 시작)으로 검출할 수 있으며, 탈에티올화된 묘목 조사 후 약 4시간에 또 다른 지연 단계로 마무리됩니다(그림 3). 6-벤질아미노퓨린(BAP)의 존재 하에서, 첫 번째 유의미한 차이는 지수 단계⁷ 동안 검출될 수 있으며, 이는 엽록소 생합성의 후기 단계에서 엽록소 역학에 대한 BAP의 부정적인 영향을 시사합니다(광선으로 조명 시작 후 약 2시간; 그림 3).

다양한 조건 및/또는 유전자형을 비교하려면 원시 데이터의 정규화가 필요합니다. 에티올화된 묘목에서 다양한 조건 및/또는 다른 유전자형에서 HPLC를 사용하여 엽록소를 검출할 수 없었기 때문에 해당 처리 및/또는 유전자형⁷에 대해 측정된 T0 형광 수준(F0)으로 정규화(F/F0)를 수행했습니다. 정규화의 중요성을 입증하기 위해 원시 데이터와 T0(F0; 그림 3A 및 그림 3B).

그림 1: 측정 장치 프로토콜 개요. iReenCAM 측정 및 분석 파이프라인의 구성. (A) 격자 정의 종자 파종, 층화, 발아의 광 유도 및 어둠 속에서 수직 방향의 페트리 플레이트 재배에 의한 샘플 준비. (B) PlantScreen 표현형 SW 툴박스를 기반으로 하는 자동 및 프로그래밍 가능한 이미지 획득 및 데이터 관리를 위한 제어 모듈은 HW 작업을 제어하고 사용자 정의 측정 및 분석 프로토콜과 동기화하여 전체 시스템의 작동을 구성합니다. (C) 측정 프로토콜은 총 4시간 동안 2분 간격, 즉 120회 측정 라운드로 형광 샘플 이미지를 동적으로 측정하도록 설계되었습니다. 시간 180분에 획득한 수직 방향 4일 된 애기장대 묘목의 대표적인 가색 이미지의 시간 시각적 프레임을 ROI 마스크 생성에 사용합니다. (D) 관심 조직(예: 자엽, 하이포코틸 또는 뿌리 영역)에 대한 ROI를 정의하는 마스크를 시간 시각적 프레임에 적용하고, 배경 빼기를 수행하고, 모든 측정 라운드에서 각 ROI(식물 마스크에 의해 정의됨)에 대한 픽셀 단위 형광 값을 추출합니다. 마지막으로, 원시 데이터(형광 F)는 T0(F0)에서의 평균 형광 값으로 정규화됩니다. 눈금 막대 = 1cm(A) 및 0.25cm(C). 수치는⁷에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 시드 배치. 그림은 톱질 그리드를 사용하여 가볍고 단단한 가장자리가 있는 Petri 플레이트에 애기장대 씨앗을 배치하는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 애기장대 탈에티올화( Arabidopsis de-etiolation)의 초기 단계에서의 엽록소 축적 동역학. 에티올화 WT Col-0 묘목은 BAP 또는 DMSO(모의)가 보충된 배지에서 성장했습니다. (A) SD(음영 영역)± 평균값, 원시 데이터의 n=9 및 (B) T0(F0)에서 평균 형광 값으로 정규화된 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 파종 그리드. 왼쪽: 각 유전자형의 씨앗을 광선 균질성(최대 광도의 0.7 ≥ 광도) 영역에 위치한 측정 지점에 배치하기 위한 윤곽선이 있는 직사각형 상자가 있는 파종 그리드. 오른쪽: 분석을 위해 재배된 4일 된 에티올화 애기장대(etiolated Arabidopsis) 묘목의 개략도. 파종 그리드는 가벼운 균질성과 적절한 종자 밀도를 보장하는 애기장대 종자 위치 지정을 위한 가능한 계획을 제공합니다(각 슬롯은 슬롯의 크기, 슬롯 사이의 거리 및 그리드 영역의 가벼운 균질성이 통합됨에 따라 종자 배치에 사용할 수 있음). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 형광 측정 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 원치 않는 빛 노출을 피할 수 있는 실험 구성. (A) 측정 장치는 워크인 파이토트론에 배치되고, (B) 차광 도어로 분리된 챔버에 배치됩니다. (C) 정의된 조건(온도 및 상대 습도)에서 에티올화된 묘목 성장 전용 시험관 내 재배 상자(빨간색 화살촉)는 장치(노란색 화살촉) 바로 아래에 배치되어 빛 노출 위험을 최소화합니다. 녹색 희미한 빛의 소스(파란색 화살촉)는 제어 PC(주황색 화살촉) 옆 벽에 장착됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: PS 데이터 분석기 소프트웨어를 사용한 워크플로우의 마스크 생성 절차. 트레이 마스크(4.3-4.6단계) 및 식물 마스크(4.12단계) 생성 및 데이터 분석(4.7 및 4.13단계)을 위해 수행할 개별 단계의 스크린샷을 인쇄합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5: 측정 변동성에 영향을 미치는 파종 밀도. (A) 별도로(개별 묘목으로, 여기서는 n=5) 또는 (B) 고밀도(HD, n=30-40) 또는 (C) 저밀도(LD, n=10-15) 그룹에서 자란 4일 된 에티올레이티드 애기장대 WT Col-0 묘목의 엽록소 축적 동역학. n은 파종 그리드의 슬롯당 묘목 수에 해당하며 데이터는 SD(음영 영역)± 평균값을 나타냅니다. 고밀도 또는 저밀도는 앞서 언급한 파종 그리드의 슬롯당 묘목 수에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: 재배 간격과 공간에는 종별 최적화가 필요합니다. 애기장대에 최적화된 프로토콜을 사용한 다양한 식물 종의 성장. (A) 파종 그리드에 씨앗 배치. (B) (왼쪽에서 오른쪽으로) 애기장대(Arabidopsis thaliana), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 크람베 아비시니카(Crambe abyssinica)의 생후 4일 된 에티올레이트 묘목. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜 및 문제 해결의 중요한 단계 - 빛이 없고 마스크를 관리하십시오.
위의 프로토콜 설명에서 직접 강조한 바와 같이, 에티올화된 식물 묘목을 재배하는 동안 또는 프로토콜을 시작하기 직전에 미량의 빛조차도 피하는 것이 매우 중요하다¹¹. 이 설정에서는 워크인 파이토트론에 위치한 전용 다크 챔버를 사용하고 차광 회전 도어를 사용하여 나머지 파이토트론과 분리합니다(보충 그림 3). 챔버에는 식물 재배 공간과 작업대가 장착되어 있어 제어 PC 및 흄 후드와 함께 장치를 수용할 수 있습니다. 이를 통해 어둠 속에서 식물을 키우고 판재를 운반할 필요 없이 측정을 시작할 수 있습니다.

식물 재배 및 마스크 생성 방법은 제안된 분석을 통한 엽록소 형광 신호의 후속 정량화에 매우 중요합니다. 빛 반사를 유발할 수 있으므로 미디어에 겔화제 덩어리나 작은 시각적 쓰레기/먼지가 들어가지 않도록 해야 합니다. 소프트웨어에 의한 엽록소 형광 인식은 마스크에 의해 제한되기 때문에 마스크로 덮이지 않는 식물 영역은 소프트웨어에 의해 분석되지 않습니다. 4시간 측정 중에 묘목이 약간 성장/이동하므로 지정된 마스크는 정확한 신호 강도 정량화를 위해 모든 측정 라운드에 맞지 않을 수 있으므로 조정이 필요할 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 불완전한 마스크 정의가 변동성의 주요 원인인 것 같습니다. 최적화 실험 동안, 우리는 i) 개별 묘목과 ii) 더 높은(30-40개 종자) 및 iii) 더 낮은(10-15개 종자) 밀도 파종을 한 묘목 그룹에서 분석을 위해 취한 엽록소 형광 값의 변동성 변화를 모니터링했습니다(보충 그림 5). 우리는 가장 낮은 변동성을 보였기 때문에 더 높은 밀도의 종자 파종을 사용했습니다. 개별 묘목/저밀도 파종의 경우 나타나는 더 높은 변동성은 대부분 신호와 배경 사이의 가장자리에 위치한 픽셀의 비율이 높고 4시간 측정 간격 동안 묘목의 약간의 움직임에서 비롯됩니다.

모든 측정이 정확한지 확인하려면 식물 마스크가 첫 번째 라운드에 맞는지 확인한 다음 15^번째, 30^번째, 45^번째, 60^번째 75^번째 등으로 마지막 라운드까지 확인합니다 (라운드 번호를 선택하고 미리보기 새로 고침을 클릭하여). 이 작업은 몇 분 밖에 걸리지 않지만 전체 자엽 영역을 다루고 평가할 수 있습니다. 어떤 라운드에서든 식물 마스크가 맞지 않으면(필요한 영역이 완전히 덮이지 않음) 실험을 여러 부분으로 나눕니다. 그런 다음 4단계(4.1-4.13)부터 프로토콜을 수행하여 실험의 각 부분에 대해 개별적으로 특정 마스크를 만듭니다. 예를 들어, 라운드 60-61(또는 약간 이전)에서 식물 마스크의 변위가 발견되면 실험을 1^{번째 부분(} 1-60라운드)과 2^{번째 부분(} 61-121라운드)의 두 부분으로 나눕니다. 1^{번째 부분에는} 라운드 41의 이미지를 사용하여 식물 마스크를 생성하고 2^번째 파트에는 라운드 91을 사용합니다. 4.13단계에서 데이터를 분석할 때 분석을 클릭하기 전에 실험의 해당 부분에 따라 라운드를 신중하게 선택합니다(예: 앞서 언급한 예에서와 같이 첫 번째 파트의 경우 라운드 1-60, 두 번째 파트의 경우 라운드 61-121). 애기장대와 함께 작업할 때 식물의 움직임은 다소 느리게 자라기 때문에 무시할 수 있지만 다른 종(아래 참조)에 프로토콜을 적용하는 경우 성장 속도를 고려해야 합니다.

수정 및 제한 사항
파라미터의 수는 광선 빛의 강도 및 파장 및/또는 광선 적용 간격 사이에 적용되는 빛을 포함하여 수정할 수 있습니다. 측정 장치에는 통합형, 완전 전동식, 소프트웨어 제어 필터 휠이 포함됩니다. 따라서, 다른 안료의 정량화에 적합한 측정 알고리즘, 전형적으로 또한 테트라피롤 생합성 경로(^10,12)의 생성물은, 적절한 필터를 추가하는 경우에 프로토콜에 포함될 수 있다.

또한 앞서 언급했듯이 이 프로토콜은 애기장대 식물에만 사용할 수 있는 것이 아닙니다. 그러나 다른 식물 종과 함께 작업할 때는 발아 및 성장률 및/또는 크기를 포함한 종별 특징을 고려하여 프로토콜의 각 단계를 적절하게 수정해야 합니다(보충 그림 6).

프로토콜의 중요한 한계 중 하나는 엽록소 정량 분석을 수행할 수 있는 시간입니다. 엽록소가 광계 복합체에 통합된 후, 형광 신호는 광합성 에너지 소비(가변 엽록소 형광이라고 불리는 것이 존재함)에 의해 편향되며, 이는 탈에티올화(de-etiolation)의 후기 단계에서 관찰되었다¹³. OJIP 과도 분석^14,15를 사용하여 분석한 바와 같이, 탈에티올레이션⁷의 처음 4시간 동안 이 실험 설정을 사용하여 광합성 활성의 징후를 감지할 수 없었습니다. 그러나 광형성의 연장된 기간이 분석되어야 한다고 가정/필요한 경우, 광시스템 조립 수준과 광합성이 전체 형광 수준에 미치는 가능한 영향을 테스트해야 합니다.

마지막으로, 형광 측정을 기반으로 하는 당사의 프로토콜은 절대적인 엽록소 정량이 아닌 상대적인 엽록소 정량을 허용한다는 점을 언급해야 합니다. 절대 정량 분석이 필요한 경우 HPLC 접근법과 같은 대안을 사용하여 해당 보정을 수행해야 합니다.

기존 분석법과 비교한 중요성 - 높은 시간 및 공간 분해능을 갖춘 간단하고 빠르며 통계적으로 강력한 엽록소 정량 분석
여기에 설명된 절차를 통해 탈에티올화의 초기 단계에서 살아있는 애기장대 묘목에서 엽록소를 실시간으로 검출하고 정량화할 수 있습니다. 분리된 식물 물질(^16,17)에서 엽록소 추출에 주로 의존하는 다른 접근법과 비교했을 때^{, 이 접근법}은 순전히 비침습적이며, 형광 강도의 생체 내 측정에 의한 엽록소 정량화가 가능합니다. 또한 앞서 언급한 HPLC 또는 분광광도계 기반 접근법을 포함한 기존의 다른 대체 방법과 마찬가지로 시료 준비에 필요한 추가 시약이 필요하지 않습니다. 새로 도입된 프로토콜은 이전에 HPLC⁵를 사용하여 검증된 바와 같이 간단하고 빠르며 정확합니다. 표준 프로토콜 설정을 사용하여 단일 생물학적 반복의 최종 곡선은 측정 4시간 동안 측정한 120개의 측정 지점(형광 강도 평균)으로 구성되며, 각 지점은 최대 15개의 측정 지점으로 구성됩니다. 전형적으로, 최종 곡선은 3개의 생물학적 복제품(예를 들어, 3개의 독립적으로 준비된 플레이트)과 3개의 측정 지점(3개의 기술적 복제품)의 데이터를 포함하며, 각각은 30-40개의 묘목으로 구성된다. 따라서 각 시간 간격에 약 300개의 묘목이 분석되어 통계적으로 강력한 데이터 세트를 제공하여 엽록소 생합성의 다양한 단계에서 영향을 받는 돌연변이에서 입증된 작은 차이도 안정적으로 감지할 수 있습니다⁷. 여기서 우리는 사용자가 엽록소 역학 데이터 분석⁽²⁰)에 적합한 도구로서 고전적 시계열 모델과 결합된 일반화된 선형 혼합 모델을 기반으로 최근에 개발된 통계적 접근법을 사용할 것을 권장합니다.

이 기술의 향후 응용 - 빠르고 저렴한 스크리닝
앞서 언급한 특징으로 인해 이 접근법은 엽록소 생합성과 관련된(직접 또는 간접적으로) 형질의 빠르고 저렴한 스크리닝 및 매우 정밀한 정량화에 적합한 유용한 도구입니다. 여기에는 엽록소 생합성의 복잡하고 다단계 조절을 더 잘 특성화하기 위해 순방향 유전자 스크리닝을 사용하는 연구가 포함될 수^있습니다 10,12,21. 다양한 화합물 처리의 가능성을 고려할 때, 이 프로토콜은 예를 들어 광 매개 호르몬 조절^22,23의 중요성 또는 엽록소 축적 역학에 영향을 미칠 수 있는 저분자 화합물에 대한 스크리닝을 연구하는 데에도 매우 가치가 있습니다.

Z.B.와 K.P.는 PSI의 직원이며 Martin Trtilek은 iReenCAM을 생산하는 PSI 회사의 CEO이자 소유주입니다. 이 모든 저자는 앞서 설명한 대로 기기 개발에 참여했습니다⁷.

이 작업은 유럽 지역 개발 기금 프로젝트 SINGING PLANT(No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)입니다. 이 프로젝트는 유럽 연합이 자금을 지원하는 MSCA4Ukraine 프로젝트(ID 1233580)를 통해 자금을 지원받았습니다. 그림 1의 그래픽 디자인을 해준 Lenka Sochurkova에게 감사의 뜻을 전합니다.