Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione, una delle fasi più drammatiche del ciclo di vita delle piante. Il processo strettamente controllato e altamente dinamico della biosintesi della clorofilla viene innescato durante il passaggio dal buio alla luce nelle piante da fiore. Nel momento in cui le piantine eziolate sono esposte alle prime tracce di luce solare, la rapida (in ordine di secondi) conversione della protoclorofilla in clorofilla è mediata da complessi proteici unici che accettano la luce, portando attraverso le successive fasi metaboliche alla produzione di clorofilla completamente funzionale. Le tecniche standard per l'analisi del contenuto di clorofilla includono l'estrazione di pigmenti da tessuti vegetali distaccati, che non si applica allo studio di processi così veloci. Per studiare la cinetica della clorofilla in vivo con elevata precisione e risoluzione spazio-temporale nelle prime ore dopo la de-eziolazione indotta dalla luce, sono stati sviluppati uno strumento e un protocollo. Qui, presentiamo una procedura dettagliata progettata per una quantificazione statisticamente robusta della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis .

La deeziolazione rappresenta la fase più drammatica del ciclo vitale della pianta, caratterizzata da una serie di cambiamenti morfologici e da un completo riarrangiamento del metabolismo della pianta (da etero- ad auto-tropico)¹. La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione indotta dalla luce nelle piante e un processo molto dinamico. La formazione di clorofilla dai precursori protoclorofillidi prodotti dall'oscurità deve essere strettamente coordinata per evitare danni dovuti a sottoprodotti reattivi². La riduzione della protoclorofillide a clorofillide è catalizzata dalle protoclorofillide ossidoreduttasi (POR) dipendenti dalla luce, enzimi unici attivati direttamente dalla luce. La reazione è molto veloce, avviene nell'ordine da ms a s³, portando ad un accumulo riconoscibile di clorofilla entro pochi minuti dall'irradiazione della piantina^{eziolata 4,5,6}. È necessario più tempo (da ore a giorni) affinché la biogenesi dei cloroplasti stabilisca un apparato fotosintetico completamente funzionante³.

Esistono vari metodi per analizzare il contenuto di clorofilla, tra cui la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) o la spettrofotometria. Di solito, queste tecniche richiedono la distruzione del tessuto vegetale ^4,5,6, limitando la determinazione delle variazioni dei livelli di clorofilla nel tempo. I metodi che consentono l'instaurazione di una cinetica clorofilliana non invasiva possono aprire una prospettiva completamente nuova per studiare le piante in diversi aspetti che vanno da domande di ricerca fondamentale, come l'analisi del processo di sintesi della clorofilla nel tempo e nello spazio, ad applicazioni più pratiche, come la valutazione della tolleranza allo stress o l'effetto dei biostimolanti sulla cinetica della clorofilla. In considerazione di ciò, abbiamo introdotto un sistema per monitorare la formazione di clorofilla, iReenCAM⁷. Incorpora una telecamera CCD, filtri di emissione, sorgenti luminose e una tubazione per l'analisi automatizzata della fluorescenza (Figura 1). La caratteristica principale del dispositivo sviluppato è l'elevata risoluzione spaziale e temporale, le prestazioni superiori nei parametri utilizzati negli approcci attuali e la sensibilità e specificità sufficienti rispetto ai metodi analitici standard⁷.

La procedura non invasiva qui descritta richiede una quantità minima di reagenti e comprende semplici passaggi, che consentono di ottenere un profilo cinetico della clorofilla nelle piantine vive di Arabidopsis durante le primissime fasi di de-eziolamento. Il protocollo può essere utile per lo studio di processi altamente dinamici di sintesi della clorofilla influenzati da una serie di fattori, sia esogeni (salsedine, siccità, biostimolanti, metalli pesanti, ecc.) che endogeni (tipicamente associati a cambiamenti nell'attività genica) di origine senza la necessità di staccare alcun tessuto vegetale, evitando così ulteriori stress.

1. Preparazione media

1. Preparare il terreno di coltura mescolando 0,75 g di gelificante con 50 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone di vetro per ottenere una concentrazione dell'1,5% (p/v) per una piastra di Petri (120 x 120 x 17 mm). Agitare delicatamente la miscela e poi riscaldarla nel microonde fino all'ebollizione per sciogliere il gelificante (la soluzione diventa limpida).
2. Lasciare raffreddare il terreno a 58-60 °C prima di procedere ai passaggi successivi. Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili all'interno di una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.
3. Utilizzare piastre di Petri con bordi a tenuta di luce per evitare un'eccessiva riflessione della luce attinica e un'elevata autofluorescenza di fondo durante le misurazioni. A tale scopo, applicare del nastro adesivo nero (o altri mezzi disponibili) per coprire tutti i lati della piastra di Petri vuota (Figura 2).
4. Eseguire la sterilizzazione della/e piastra/e dopo l'applicazione del nastro mediante irradiazione con lampada UV germicida per 20-30 min.
5. Se l'esperimento prevede un trattamento chimico (ad esempio, fattori di stress abiotici/biotici, ormoni vegetali e/o regolatori della crescita, ecc.), aggiungere la quantità appropriata di sostanza chimica corrispondente direttamente al terreno. Prestare attenzione alla stabilità chimica scelta aggiunta al mezzo (ad esempio, se il prodotto chimico non è termostabile, aggiungerlo al mezzo quando si è raffreddato subito prima di versarlo nel piatto). Mescolare accuratamente il terreno agitando per garantire una distribuzione uniforme della sostanza chimica.
6. Evitare l'illuminazione delle lastre alla luce UV dopo che il terreno è stato versato (porterebbe alla produzione di radicali dell'ossigeno che potrebbero interferire con l'esperimento).
7. Versare il terreno preparato nella/e piastra/e di Petri quadrata/e e lasciare che il terreno si solidifichi a temperatura ambiente.

2. Sterilizzazione della superficie del seme e condizioni di crescita delle piante

1. Prelevare la quantità necessaria di semi di Arabidopsis thaliana Col-0 dal brodo (10-20 mg) e aggiungerla a una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
   NOTA: Non sono necessarie modifiche specifiche quando si lavora con diverse linee di Arabidopsis (linee di ecotipi/mutanti). La revisione della griglia di taglio e delle fasi di misurazione deve essere eseguita per altre specie vegetali tenendo conto della differenza nelle dimensioni dei semi, nel tasso di germinazione e nelle dimensioni delle piantine.
2. Sterilizzare in superficie i semi di Arabidopsis aggiungendo etanolo al 70% nella provetta per 2 minuti. Agitare delicatamente le provette durante la sterilizzazione.
3. Rimuovere l'etanolo pipettando con cura, facendo attenzione a non perdere i semi. Lavare i semi aggiungendo acqua sterile al tubo per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo (scuotere delicatamente i tubi durante il periodo di lavaggio).
4. Lascia che i semi sedimentino sul fondo del tubo per gravità, rimuovi l'acqua rimanente.
5. Sciacquare nuovamente i semi 2 volte con acqua sterile come descritto nel passaggio 2.3 per assicurarsi che siano privi di qualsiasi tratto di etanolo. Lascia che i semi sedimentino sul fondo del tubo per gravità, rimuovi l'acqua rimanente.
6. Aggiungere un volume uguale di acqua sterile al tubo contenente i semi per creare una sospensione di acqua e semi.
7. Utilizzare una griglia di semina per distribuire uniformemente la sospensione di seme-acqua del genotipo dato sulle aree selezionate della piastra del terreno (Figura 2 e Figura 1 supplementare). Distribuire i semi (circa 30-40) in fila in ogni zona utilizzando una punta larga per pipetta.
8. Lasciare asciugare l'acqua nelle aree di semina per circa 30 minuti, mantenendo le piastre aperte in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Sigillare la piastra con nastro adesivo microporoso e avvolgerla con un foglio di alluminio.
9. Stratificare i semi per 3 giorni a 4 °C al buio per (a seconda dell'ecotipo utilizzato) superare la dormienza del seme e/o favorire una germinazione uniforme.
10. Trasferire la piastra con i semi stratificati alla luce bianca (150 μmol/m²/s) per 1 ora per indurre la germinazione (scartare la pellicola solo per il trattamento della luce).
11. Dopo il trattamento con luce, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per proteggere i semi dalla luce e posizionarla in posizione verticale in una camera di crescita e coltivare per 4 giorni al buio a 21 °C.

3. Misurazione e analisi della fluorescenza della clorofilla

1. Accendere il sistema iReenCAM e assicurarsi che il sistema sia pronto e configurato correttamente nel software del server PS avviato automaticamente (ad esempio, se c'è abbastanza spazio di archiviazione per i dati dell'esperimento, se la telecamera a fluorescenza è collegata al PC, ecc.).
2. Attivare il software Scheduler per creare il piano sperimentale per la misurazione facendo clic su Esperimenti > Nuovo esperimento. Specificare un nome descrittivo per l'esperimento e inserire i dettagli (descrizione).
3. Impostare le azioni necessarie per l'esperimento facendo clic su Aggiungi azione che condurrà alla pianificazione delle azioni sperimentali.
   NOTA: La parola azione qui significa eseguire un esperimento completo (cioè, compresi tutti i passaggi necessari per eseguire una misurazione su piastra).
4. Specificare le condizioni per una singola misurazione circolare (ad esempio, la durata del periodo di luce/oscurità).
5. Facendo clic su Genera elenco , definire gli intervalli di tempo tra i cicli di misurazione. Scegli l'ora in cui il round inizierà e finirà (4 ore in totale) e gli intervalli tra i round (nella configurazione attuale un round ogni 2 minuti).
6. Fare clic su Genera e assicurarsi che l'intervallo di tempo e gli intervalli tra gli impulsi luminosi siano corretti controllando l'elenco generato sul lato sinistro dello schermo.
7. Scegliere il protocollo di misurazione (Figura 2 supplementare). Salvare tutte le modifiche apportate al database per riferimento futuro.
8. Poco prima dell'inizio della misurazione, utilizzare una luce verde di bassa intensità (vedere Tabella dei materiali) all'interno della camera oscura e regolare il livello del ripiano all'interno della camera di misura o eseguire altre fasi di preparazione prima di rimuovere la pellicola dalla piastra di Petri. Quindi spegnere la luce e trasferire le piastre nella camera di misurazione nella completa oscurità.
9. Rimuovere con cautela il foglio di alluminio che copre la piastra di Petri contenente le piantine di 4 giorni. Posizionare la piastra di Petri orizzontalmente all'interno della camera di misura del dispositivo. All'interno della camera, indurre impulsi luminosi attinici ed eseguire l'imaging secondo il piano dell'esperimento (azioni) impostato nei passaggi 3.1-3.7.
   NOTA: È fondamentale evitare qualsiasi illuminazione delle piastre con piantine eziolate prima di inserirle nella camera di misurazione. La manipolazione con la piastra con piantine eziolate deve essere eseguita in camera oscura (per un eventuale setup sperimentale vedi Figura 3 supplementare).

4. Estrazione e analisi dei dati

1. Dopo aver completato la misurazione, aprire l'esperimento corrispondente nel software dell'analizzatore.
2. Per analizzare la fluorescenza delle piantine, genera due tipi di maschere: una maschera ruvida (vassoio) che copre l'area in cui si trovano le piantine e una maschera precisa (pianta) che copre solo il tessuto di interesse (tipicamente cotiledoni).
3. Generare una maschera di vassoio facendo clic sull'opzione Crea nuovo tipo di vassoio . Assegnare i nomi di genotipo appropriati alle rispettive aree sull'immagine della piastra.
4. Per assegnare il genotipo, scegli un numero di immagine in Round e quindi fai clic su Carica immagine nella parte superiore dello schermo. L'immagine della targa verrà visualizzata sullo schermo. Facendo clic su uno qualsiasi dei pulsanti che rappresentano diversi strumenti di disegno delle forme (Figura 4 supplementare), accedere alla modalità Nuova forma che consente di disegnare l'area di interesse sull'immagine della lastra. Scegli le aree necessarie (ad esempio, diversi genotipi sul piatto) e fornisci la loro denominazione appropriata.
5. Fare clic su Esc per uscire dalla modalità forma. Salvare la maschera del vassoio generata (dopo averle assegnato un nome) facendo clic su Memorizza tipo di vassoio.
6. Tornate indietro di un passaggio e applicate la maschera generata nei passaggi precedenti selezionandone il nome dall'opzione Cambia per tipo di vassoio .
7. Per generare una maschera vegetale con elevata precisione, utilizzare l'immagine acquisita dopo 180 minuti di misurazione (round 91) per impostare il valore di soglia minimo per l'intensità del segnale di fluorescenza, abilitando la sottrazione del rumore di fondo. A tale scopo, rimuovere il segno di spunta da Soglia automatica e impostare una Soglia manuale su 0 (Figura 4 supplementare).
8. Fare clic su Anteprima per assicurarsi che la maschera del vassoio copra tutte le aree necessarie (genotipi) sull'immagine della piastra. A tale scopo, scegliete il round 91 e fate clic su Aggiorna anteprima.
9. Accedere al menu Esegui facendo clic su Esegui. Eseguire l'analisi esclusivamente per il round 91 mettendo un segno di spunta solo sul round 91. Scegliete quindi il percorso di output e fate clic su Avvia analisi (Start Analysis).
10. Al termine dell'analisi, si aprirà automaticamente il menu Fine. Selezionare il round eseguito (sarà l'unico) dagli esperimenti e fare clic su Passa analizzatore a dati analizzati per esportare i dati per questo punto temporale specifico (round 91).
11. Estrarre il file .xsel dall'archivio esportato, poiché questo file contiene le informazioni essenziali sulla maschera vegetale, facendo clic sull'icona Apri parte di esportazione .
12. Riaprire l'esperimento facendo clic sull'icona Apri parte di analisi locale . Entra di nuovo nel menu Mask Builder , fai clic su Carica immagine, scegli round 1 e poi Carica da file nell'angolo in alto a destra dello schermo e carica il file .xsel estratto in precedenza. L'immagine della lastra verrà visualizzata con la maschera vassoio applicata.
13. Salvare la maschera facendo clic su Memorizza tipo vassoio e applicarla selezionandone il nome nell'opzione Cambia per tipo di vassoio .
14. Generare la maschera vegetale regolando la soglia di intensità del segnale di fluorescenza. Aumentare il valore di Soglia manuale fino a quando la maschera generata nel menu Anteprima si adatta perfettamente al ROI (ad esempio, cotiledoni) in ciascuno dei genotipi (Figura 4 supplementare). Controlla se la maschera si adatta a tutti i giri delle misurazioni scorrendo i giri (controllare il corretto posizionamento della maschera al giro 1, 61 e 121 dovrebbe essere sufficiente) nel menu Anteprima .
15. Eseguire l'analisi per tutti i cicli di misura ed esportare i dati.
    NOTA: Il file di output include i valori di fluorescenza della clorofilla di un determinato genotipo per ogni punto temporale, consentendo la costruzione di grafici a scelta e facilitando un'ulteriore valutazione statistica.

L'output tipico ottenuto utilizzando la procedura di nuova concezione nelle piantine di Arabidopsis deeziolate di 4 giorni di vita di tipo selvatico (WT), ecotipo Columbia-0 (Col-0) è mostrato nella Figura 3. In condizioni di controllo (terreni MS integrati con DMSO), la curva biosintetica della clorofilla inizia con un primo burst della sintesi clorofilliana, in cui il pool di protoclorofillidi sintetizzato durante la fase scotomorfogenica della crescita, viene rapidamente convertito in clorofilla a causa dei POR indotti dalla luce ^7,8,9. La fase iniziale di rapido accumulo di clorofilla dura circa 10 minuti ed è seguita da una fase di ritardo, durante la quale vengono raggiunti i minimi della protoclorofillide sintetizzata al buio (circa 30 minuti dopo l'irradiazione; per la curva della protoclorofillide misurata dall'HPLC, vedere⁷). Durante la fase di ritardo, i geni biosintetici della clorofilla vengono sovraregolati¹⁰, portando alla produzione di protoclorofillide indotta dalla luce. La protoclorofilla appena sintetizzata viene prontamente convertita in clorofilla, rilevabile come fase esponenziale (nel caso di WT Col-0 a partire da circa 120 minuti dopo l'irradiazione), terminando con un'altra fase di ritardo a circa 4 ore dopo l'irradiazione della piantina deeziolata (Figura 3). In presenza di 6-benzilamminopurina (BAP), le prime differenze significative sono rilevabili durante la fase esponenziale⁷, suggerendo un effetto negativo del BAP sulla cinetica della clorofilla nelle fasi successive della biosintesi della clorofilla (a circa 2 h dall'inizio dell'illuminazione con luce attinica; Figura 3).

Per il confronto di diverse condizioni e/o genotipi, è necessaria la normalizzazione dei dati grezzi. Poiché nessuna clorofilla era rilevabile utilizzando l'HPLC in varie condizioni e/o genotipi diversi nelle piantine eziolate, abbiamo eseguito la normalizzazione (F/F0) ai livelli di fluorescenza T0 (F0) misurati per il trattamento corrispondente e/o genotipo⁷. Per dimostrare l'importanza della normalizzazione, presentiamo sia i dati grezzi che i dati normalizzati al valore medio di fluorescenza della clorofilla del controllo misurato a T0 (F0; Figura 3A e Figura 3B, rispettivamente).

Figura 1: Panoramica del protocollo del dispositivo di misurazione. Lo schema della pipeline di misura e analisi iReenCAM. (A) Preparazione del campione mediante semina di semi definita dalla griglia, stratificazione, induzione della germinazione alla luce e coltivazione su piastra di Petri orientata verticalmente al buio. (B) Il modulo di controllo per l'acquisizione automatica e programmabile delle immagini e la gestione dei dati basato sul toolbox SW di fenotipizzazione PlantScreen organizza il funzionamento dell'intero sistema controllando e sincronizzando il funzionamento HW con il protocollo di misura e analisi definito dall'utente. (C) Il protocollo di misurazione è progettato per misurazioni dinamiche delle immagini del campione fluorescente a intervalli di 2 minuti per un totale di 4 ore, ovvero 120 cicli di misurazione. Il fotogramma visivo temporale dell'immagine rappresentativa a falsi colori di piantine di Arabidopsis di 4 giorni orientate verticalmente acquisite al tempo di 180 minuti viene utilizzato per la generazione della maschera ROI. (D) La maschera che definisce il ROI per un tessuto di interesse (ad esempio, cotiledone, ipocotil o zona radicale) viene applicata sul fotogramma visivo temporale, viene eseguita la sottrazione dello sfondo e vengono estratti i valori di fluorescenza pixel per pixel per ogni ROI (definito dalla maschera vegetale) da tutti i cicli di misurazione. Infine, i dati grezzi (fluorescenza F) vengono normalizzati al valore medio di fluorescenza a T0 (F0). Barre della scala = 1 cm (A) e 0,25 cm (C). La cifra è stata modificata da⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Posizionamento dei semi. La figura mostra il posizionamento dei semi di Arabidopsis sulla piastra di Petri con bordi a tenuta di luce utilizzando la griglia di taglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cinetica di accumulo della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis . Le piantine di WT Col-0 eziolate sono state coltivate su terreni integrati con BAP o DMSO (mock). (A) Il valore medio ± SD (area ombreggiata), n=9 dei dati grezzi e (B) dati normalizzati al valore medio di fluorescenza a T0 (F0). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Griglia di semina. A sinistra: Griglia di semina con scatole rettangolari delineate per posizionare i semi di ciascun genotipo in un punto di misurazione situato nell'area di omogeneità della luce attinica (intensità luminosa ≥ 0,7 dell'intensità luminosa massima). A destra: Rappresentazione schematica di piantine di Arabidopsis eziolate di 4 giorni di vita coltivate per l'analisi. La griglia di semina fornisce un possibile schema per il posizionamento dei semi di Arabidopsis garantendo l'omogeneità della luce e la corretta densità del seme (ogni fessura può essere utilizzata per il posizionamento del seme in quanto le dimensioni di una fessura, la distanza tra le fessure e l'omogeneità della luce nell'area della griglia sono unificate). Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Protocollo di misurazione della fluorescenza. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 3 supplementare: Configurazione sperimentale che consente di evitare l'esposizione indesiderata alla luce. (A) Il dispositivo di misurazione è posizionato nel fitotrone walk-in, (B) nella camera separata da una porta a tenuta di luce. (C) Le cassette di coltivazione in vitro (punta di freccia rossa) dedicate alla crescita delle piantine eziolate in condizioni definite (temperatura e umidità relativa) sono posizionate appena sotto il dispositivo (punta di freccia gialla), garantendo il minimo rischio di esposizione alla luce. La sorgente di luce fioca verde (punta di freccia blu) è montata sulla parete accanto al PC di controllo (punta di freccia arancione). Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 4 supplementare: Procedura di generazione della maschera nel flusso di lavoro utilizzando il software di analisi dei dati PS . Stampare le schermate dei singoli passaggi da eseguire per la generazione della maschera vassoio (passaggi 4.3-4.6) e della maschera vegetale (passaggio 4.12) e l'analisi dei dati (passaggi 4.7 e 4.13). Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 5 supplementare: Densità di semina che influisce sulla variabilità delle misure. Cinetica di accumulo della clorofilla in piantine di Arabidopsis WT Col-0 eziolate di 4 giorni coltivate (A) separatamente (come singole piantine, qui n=5) o in un gruppo di (B) alta (HD, n=30-40) o (C) bassa densità (LD, n=10-15). L'n corrisponde al numero di piantine per slot della griglia di semina, i dati rappresentano i valori medi ± SD (regione ombreggiata). L'alta o bassa densità corrisponde al numero di piantine per fessura della griglia di semina come accennato. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare 6: L'intervallo di coltivazione e lo spazio richiedono un'ottimizzazione specie-specifica. Crescita di varie specie vegetali utilizzando il protocollo ottimizzato per l'Arabidopsis. (A) Posizionamento dei semi sulla griglia di semina. (B) Piantine eziolate di 4 giorni di Arabidopsis thaliana, Brassica napus e Crambe abyssinica. Fare clic qui per scaricare il file.

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi: nessuna luce e prendersi cura della maschera
Come evidenziato direttamente nella descrizione del protocollo di cui sopra, è di fondamentale importanza evitare anche le tracce di luce sia durante la coltivazione delle piantine di piante eziolate che appena prima di iniziare il protocollo¹¹. Nella nostra configurazione, utilizziamo una camera oscura dedicata situata nel fitotrone walk-in e separata dal resto del fitotrone con una porta rotante a tenuta di luce (Figura 3 supplementare). La camera è dotata di spazio per la coltivazione delle piante e di un banco di lavoro che consente di alloggiare il dispositivo insieme al PC di controllo e alla cappa aspirante. Questo ci permette sia di coltivare le piante al buio che di iniziare la misurazione senza la necessità di trasportare la piastra.

Il modo in cui le piante coltivano e generano maschere è fondamentale per la successiva quantificazione del segnale di fluorescenza della clorofilla attraverso il saggio proposto. Si dovrebbero evitare di inserire grumi di gelificante o piccoli rifiuti/polvere visiva nei supporti in quanto potrebbero causare riflessi di luce. Poiché il riconoscimento della fluorescenza della clorofilla da parte del software è limitato dalla maschera, un'area della pianta che non sarà coperta dalla maschera semplicemente non verrà analizzata dal software. Durante la misurazione di 4 ore, le piantine crescono/si muovono un po', quindi la maschera designata potrebbe richiedere modifiche in quanto potrebbe non adattarsi a tutti i cicli di misurazione per la quantificazione accurata dell'intensità del segnale. Secondo la nostra esperienza, la definizione imperfetta della maschera sembra essere la principale fonte di variabilità. Durante gli esperimenti di ottimizzazione, abbiamo monitorato le variazioni nella variabilità dei valori di fluorescenza della clorofilla presi per l'analisi in i) singole piantine e un gruppo di piantine con ii) maggiore (30-40 semi) e iii) minore (10-15 semi) densità di semina (Figura supplementare 5). Abbiamo utilizzato una maggiore densità di semina poiché ha mostrato la variabilità più bassa. La maggiore variabilità osservata nel caso di singole piantine/semina a bassa densità deriva principalmente dalla maggiore percentuale di pixel situati al bordo tra il segnale e lo sfondo e dal leggero movimento delle piantine durante l'intervallo di misurazione di 4 ore.

Per assicurarti che tutte le misurazioni siano accurate, controlla se la maschera della pianta si adatta al primo round, poi al 15, 30, 45, 60^{th 75th} e così via fino all'ultimo (selezionando il numero del round e facendo clic su Aggiorna anteprima). Ci vorranno solo un paio di minuti, ma garantirà che l'intera area del cotiledone venga coperta e valutata. Se in qualsiasi round la maschera della pianta non si adatta (l'area richiesta non è completamente coperta), dividi l'esperimento in più parti. Quindi eseguire il protocollo a partire dal passaggio 4 (4.1-4.13) per creare una maschera specifica separatamente per ogni parte dell'esperimento. Ad esempio, se noti lo spostamento della maschera della pianta al giro 60-61 (o leggermente prima), dividi l'esperimento in due parti: 1a^{parte (}1-60 giri) e 2a^{parte (}61-121 giri). Per la^1ª parte usate l'immagine del giro 41 per generare una maschera vegetale e per la^2ª parte usate il giro 91. Al passaggio 4.13, quando si analizzano i dati, fare attenzione a scegliere i cicli in base alla parte corrispondente dell'esperimento (ad esempio, i cicli 1-60 per la prima parte e 61-121 per la seconda, come nell'esempio precedente) prima di fare clic su Analizza. Quando si lavora con l'Arabidopsis, il movimento delle piante è trascurabile in quanto crescono piuttosto lentamente, ma se si applica il protocollo per specie diverse (vedi sotto), è necessario tenere conto del ritmo di crescita.

Modifiche e limitazioni
È possibile modificare il numero di parametri, tra cui l'intensità e la lunghezza d'onda della luce attinica e/o la luce applicata tra gli intervalli di applicazione della luce attinica. Il dispositivo di misurazione include la ruota portafiltri integrata, completamente motorizzata e controllata da software. Pertanto, l'algoritmo di misura adatto alla quantificazione di altri pigmenti, tipicamente anche prodotti della via biosintetica tetrapyrolle^10,12, potrebbe essere incluso nel protocollo in caso di aggiunta di filtri appropriati.

Inoltre, come accennato in precedenza, il protocollo può essere utilizzato non solo per le piante di Arabidopsis . Tuttavia, quando si lavora con altre specie vegetali, ogni fase del protocollo dovrebbe essere rivista di conseguenza tenendo conto delle caratteristiche specifiche della specie, tra cui il tasso di germinazione e crescita e/o le dimensioni (figura supplementare 6).

Uno dei limiti importanti del protocollo è l'intervallo di tempo durante il quale può essere eseguita l'analisi di quantificazione della clorofilla. Dopo che la clorofilla si è integrata nei complessi del fotosistema, il segnale di fluorescenza diventa influenzato dal consumo di energia della fotosintesi (è presente quella che viene chiamata la florescenza variabile della clorofilla), come è stato osservato durante le fasi successive della deeziolazione¹³. Come analizzato utilizzando il saggio^14,15 sui transienti OJIP, nessun segno di attività fotosintetica è stato rilevabile utilizzando questa configurazione sperimentale durante le prime 4 ore di deeziolazione⁷. Tuttavia, se si suppone/deve essere analizzato il periodo di tempo prolungato della fotomorfogenesi, è necessario testare il livello di assemblaggio dei fotosistemi e il possibile effetto della fotosintesi sui livelli complessivi di fluorescenza.

Infine, va detto che il nostro protocollo, basato sulle misure di fluorescenza, permette una quantificazione della clorofilla relativa, non assoluta. Se è necessaria una quantificazione assoluta, la calibrazione corrispondente deve essere eseguita utilizzando un approccio alternativo, ad esempio HPLC.

Significatività rispetto ai metodi esistenti: quantificazione della clorofilla semplice, veloce e statisticamente robusta con un'elevata risoluzione temporale e spaziale
La procedura qui descritta consente di rilevare e quantificare in tempo reale la clorofilla nelle piantine viventi di Arabidopsis durante le prime fasi di de-eziolamento. Rispetto ad altri approcci che si basano principalmente sull'estrazione della clorofilla da materiale vegetale distaccato^16,17 o metodi ottici di recente sviluppo^18,19, questo approccio è puramente non invasivo, consentendo la quantificazione della clorofilla mediante misurazione in vivo dell'intensità della fluorescenza. Inoltre, non sono necessari reagenti aggiuntivi per la preparazione del campione come con altri metodi alternativi esistenti, inclusi i già citati approcci basati su HPLC o spettrofotometria. Il protocollo appena introdotto è semplice, veloce e accurato, come precedentemente verificato utilizzando HPLC⁵. Utilizzando le impostazioni standard del protocollo, la curva finale di una singola ripetizione biologica è costituita da 120 punti di misurazione (intensità di fluorescenza media) rilevati durante 4 ore di misurazione, ciascuno composto da un massimo di 15 punti di misurazione. Tipicamente, la curva finale include i dati di tre repliche biologiche (ad esempio, tre piastre preparate in modo indipendente) e tre punti di misurazione (tre repliche tecniche), ciascuno composto da 30-40 piantine. Pertanto, ci sono circa 300 piantine analizzate in ogni intervallo di tempo, fornendo un set di dati statisticamente robusto, che consente di rilevare in modo affidabile anche piccole differenze, come dimostrato sui mutanti colpiti in varie fasi della biosintesi della clorofilla⁷. Qui incoraggiamo l'utente ad utilizzare l'approccio statistico recentemente sviluppato basato su modelli misti lineari generalizzati combinati con modelli classici di serie temporali come strumento adatto per l'analisi dei dati di cinetica della clorofilla²⁰.

Applicazioni future della tecnica: screening rapido ed economico
Le caratteristiche sopra citate rendono questo approccio uno strumento utile adatto per uno screening rapido ed economico e per una quantificazione altamente precisa dei caratteri associati (direttamente o indirettamente) alla biosintesi della clorofilla. Ciò potrebbe includere studi che impiegano lo screening genetico in avanti per caratterizzare meglio le regolazioni complesse e multilivello della biosintesi della clorofilla 10,12,21. Considerando la possibilità di vari trattamenti composti, il protocollo è anche molto utile per studiare, ad esempio, l'importanza delle regolazioni ormonali mediate dalla luce^22,23 o lo screening di composti a basso peso molecolare con possibile impatto sulla cinetica di accumulo della clorofilla.

Z.B. e K.P. sono dipendenti del PSI e Martin Trtilek è CEO e proprietario della società PSI che produce l'iReenCAM. Tutti questi autori sono stati coinvolti nello sviluppo dello strumento come descritto in precedenza⁷.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto SINGING PLANT (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Questo progetto è stato finanziato attraverso il progetto MSCA4Ukraine (ID 1233580), finanziato dall'Unione Europea. Siamo grati a Lenka Sochurkova per il design grafico della Figura 1.