Использование расширительной микроскопии для физического увеличения эмбрионов дрозофилы для визуализации сверхвысокого разрешения

Представлен протокол реализации расширительной микроскопии у ранних эмбрионов дрозофилы для получения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа.

Рабочей лошадкой биологии развития является конфокальный микроскоп, который позволяет исследователям определять трехмерную локализацию меченых молекул в сложных биологических образцах. В то время как традиционные конфокальные микроскопы позволяют разрешать два соседних источника флуоресцентных точек, расположенных на расстоянии нескольких сотен нанометров друг от друга, наблюдение за более тонкими деталями субклеточной биологии требует способности разрешать сигналы порядка десятков нанометров. Для того, чтобы позволить исследователям обойти такие ограничения разрешения, было разработано множество аппаратных методов для микроскопии сверхвысокого разрешения, хотя эти методы требуют специализированных микроскопов, которые доступны не всем исследователям. Альтернативным методом увеличения разрешающей способности является изотропное увеличение самого образца с помощью процесса, известного как расширительная микроскопия (ExM), который был впервые описан группой Бойдена в 2015 году. ExM не является разновидностью микроскопии как таковой , а скорее представляет собой метод набухания образца с сохранением относительной пространственной организации составляющих его молекул. Затем расширенный образец можно наблюдать с эффективно увеличенным разрешением с помощью традиционного конфокального микроскопа. В данной статье мы опишем протокол реализации ExM в эмбрионах дрозофилы , который используется для изучения локализации Par-3, миозина II и митохондрий в поверхностных эпителиальных клетках. Этот протокол позволяет увеличить размер образца примерно в четыре раза, что позволяет обнаруживать субклеточные детали, которые не видны при обычной конфокальной микроскопии. В качестве доказательства принципа, анти-GFP антитело используется для различения отдельных пулов миозина-GFP между соседними клеточными корами, а флуоресцентно меченный стрептавидин используется для обнаружения эндогенных биотинилированных молекул, чтобы выявить мелкие детали архитектуры митохондриальной сети. Этот протокол использует общие антитела и реагенты для флуоресцентного мечения, и он должен быть совместим со многими существующими протоколами иммунофлуоресценции.

В клеточной биологии и биологии развития увидеть — значит поверить, и способность точно определять паттерны локализации белков является основополагающей для многих типов экспериментов. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия является стандартным инструментом для визуализации флуоресцентно меченных белков в трех измерениях в интактных образцах. Обычные конфокальные микроскопы не способны различать (разрешать) соседние флуоресцентные сигналы, разделенные менее чем половиной длины волны^{излучаемого} ими света. Другими словами, два точечных источника должны находиться на расстоянии не менее 200-300 нм в боковом направлении (500-700 нм в осевом направлении), чтобы они были различимы как два различных сигнала. Этот технический барьер известен как дифракционный предел, и он является фундаментальным препятствием для изучения сложных субклеточных структур (например, цитоскелетных или митохондриальных сетей актомиозина) с пространственными особенностями ниже дифракционного предела. Поэтому методы повышения разрешающей способности обычных конфокальных микроскопов представляют общий интерес для биологического сообщества.

Чтобы обойти дифракционный предел, был разработан ряд различных технологий микроскопии сверхвысокого разрешения, которые позволяют получать разрешение порядка десятков нанометров или менее ^1,2,3, раскрывая мир биологической сложности, который ранее был доступен только с помощью электронной микроскопии. Несмотря на очевидные преимущества этих аппаратных методов, микроскопы сверхвысокого разрешения часто предъявляют особые требования к маркировке образцов и длительному времени сбора, что ограничивает их гибкость или они могут быть просто слишком дорогими для доступа к ним в некоторых лабораториях. Альтернативой микроскопу сверхвысокого разрешения является расширительная микроскопия (ExM), которая не является разновидностью микроскопии как таковой, а скорее представляет собой метод набухания образца с сохранением относительной пространственной организации составляющих его молекул⁴. Изотропно расширенные образцы затем можно наблюдать с эффективно увеличенным разрешением с помощью традиционного флуоресцентного конфокального микроскопа. ExM был впервые описан группой Бойдена в 2015 г.⁵, и с тех пор базовая методика была адаптирована для использования в различных экспериментах 6,7,8. ExM также был адаптирован для использования на цельных эмбрионах, в частности, у дрозофилы 9,10,11, C. elegans¹² и рыбки данио-рерио ^13, что делает его мощным инструментом для биологов развития.

ExM основан на двух различных химических составах гидрогелей: 1) набухающие полиэлектролитные гидрогели, которые значительно увеличиваются в размерах при замачивании в воде¹⁴, и 2) полиакриламидные гидрогели, которые имеют чрезвычайно маленькое расстояние между полимерами, что позволяет изотропно расширять образец¹⁵. Несмотря на то, что существует множество опубликованных протоколов ExM, они, как правило, имеют следующие общие этапы: фиксация образца, маркировка, активация, гелеобразование, расщепление и расширение⁴. Условия фиксации и стратегии флуоресцентного мечения, конечно, будут варьироваться в зависимости от потребностей эксперимента и системы, а в некоторых протоколах маркировка происходит после расширения. Молекулы-мишени в образце должны быть загрунтованы (активированы) для связывания с гидрогелем, что может быть достигнуто с использованием различных химических составов⁴. На этапах гелеобразования образец насыщают мономерами будущего гидрогеля (акрилатом натрия, акриламидом и сшивающим агентом бисакриламидом), а затем гидрогель формируют путем свободнорадикальной полимеризации, катализируемой инициатором, таким как персульфат аммония (APS), и ускорителем, таким как тетраметилендиамин (TEMED)⁴. После гелеобразования образец ферментативно сбраживают для гомогенизации устойчивости образца к набуханию и обеспечения изотропного расширения гидрогеля⁴. Наконец, сброженный гидрогель помещают в воду, что заставляет его расширяться примерно в четыре раза по сравнению с первоначальным линейным размером⁴.

Рисунок 1: Обзор расширительной микроскопии эмбрионов дрозофилы . ExM — это многоступенчатый протокол, который занимает не менее 4 дней. Забор, фиксация и девителлинизация эмбрионов занимают 1 день или более в зависимости от того, объединены ли эмбрионы из нескольких коллекций. Иммунофлуоресцентное мечение занимает 1 или 2 дня в зависимости от того, инкубируются ли эмбрионы в течение ночи с первичными антителами. Активация, гелеобразование, расщепление и расширение эмбриона могут быть выполнены в течение одного дня. Гели могут быть установлены и сфотографированы сразу после расширения, хотя из практических соображений часто желательно начать визуализацию на следующий день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

В этом протоколе описывается, как проводить ExM на эмбрионах дрозофилы ¹⁶ на ранних и средних стадиях развития для визуализации паттернов локализации субклеточных белков в сверхвысоком разрешении (рис. 1). Этот метод использует химический состав N-гидроксисукцинимидилового эфира метилакриловой кислоты (MA-NHS) для активации и привязки белковых молекул к гидрогелю¹⁷ и является модификацией ранее опубликованного протокола ExM для использования на поздних стадиях эмбрионов и тканей дрозофилы ¹¹. В этом протоколе используются лунки из полидиметилсилоксана (PDMS) для формования гидрогелей и облегчения обмена раствором во время активации и гелеобразования. Альтернативный метод, не требующий создания лунок PDMS, включает опускание эмбрионов, прикрепленных к покровным стеклам, в капли раствора мономера, сидящие на куске лабораторной герметизирующей пленки^22. Кроме того, в этом протоколе описан метод ручного удаления непроницаемой вителлиновой мембраны, окружающей эмбрионы дрозофилы, что является обязательным условием для иммунофлуоресцентного окрашивания. Важно отметить, что этот метод ручной очистки эмбрионов может быть использован для отбора только правильно расположенных эмбрионов дрозофилы перед маркировкой образцов, что значительно повышает вероятность получения расширенных образцов правильной стадии и ориентации и, таким образом, делает последующий сбор данных гораздо более эффективным.

Этот протокол соответствует рекомендациям Университета Арканзаса (UARK) по исследованиям беспозвоночных животных, таких как Drosophila melanogaster, и был одобрен Институциональным комитетом по биобезопасности UARK (протокол #20001).

1. Фиксация и девителлинизация эмбрионов дрозофилы

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1 описывает процедуру (ручной пилинг) для ручного удаления вителлиновой мембраны, прозрачной непроницаемой мембраны, которая окружает эмбрион. Важно отметить, что ручной пилинг позволяет выбрать правильно расположенные эмбрионы в начале протокола ExM, тем самым значительно повышая вероятность получения эмбрионов в пригодной для использования ориентации в конце протокола ExM. Тем не менее, этот протокол ExM полностью совместим с объемным забором эмбрионов и стандартными процедурами удаления вителлиновой мембраны на основе метанола, и в этом случае можно сразу перейти к шагу 2 (иммунофлуоресцентное мечение).

1. Подготовьте или приобретите несколько тонких стеклянных игл. Фактические размеры кончика иглы не имеют решающего значения, но они должны быть достаточно жесткими и острыми, чтобы проколоть вителлиновые мембраны фиксированных эмбрионов. Изготовьте иглы из стеклянных капиллярных трубок (наружный диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,75 мм) с помощью микропипетки, как при подготовке игл для микроинъекций эмбрионам¹⁸; В качестве альтернативы приобретите предварительно вытянутые иглы.
2. Забор эмбрионов с использованием стандартных методов дрозофилы¹⁹ путем помещения >100 взрослых дрозофил в вентилируемый пластиковый стаканчик, закрытый пластиной²⁰ с фруктовым соком/агаром. Используйте временные окна сбора для обогащения эмбрионов соответствующей стадии¹⁶. Например, чтобы обогатить для гаструляции (стадия 6) и конвергентно-экстенсивной (стадия 7), замените пластину фруктового сока, собирайте эмбрионы в течение 2 ч при 25 °C, затем удалите пластину и выдержите ее еще 2 ч при 25 °C, чтобы получить эмбрионы возрастом ~2-4 часа.
3. Чтобы удалить из зародышей хорион, похожий на яичную скорлупу, покройте поверхность пластинок фруктового сока 50%-ным хлорным известником (табл. 1), освободите зародыши от поверхности агара, взбалтывая их маленькой кистью, и подождите 3 мин, пока хорион растворится.
4. Перенесите дехорионизированные эмбрионы с помощью кисти в сцинтилляционный флакон объемом 30 мл, содержащий 4 мл гептана (органическая верхняя фаза) и 4 мл фиксирующего буфера (водная нижняя фаза; Таблица 1). Свежеразбавленный формальдегид из свежеприготовленного или недавно открытого бульона и смешайте с 10-кратным PBS и деионизированной водой непосредственно перед добавлением эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте формальдегид из параформальдегида или 16% ЭМ-формальдегида в стеклянных ампулах. Можно использовать запасы концентрированного формальдегида (например, 37% формальдегида), хотя результаты могут быть менее стабильными.
5. Эмбрионы будут накапливаться на границе между органической и водной фазами. Добавьте столько эмбрионов, сколько будет образовывать один слой на границе раздела. Если в пробирку добавлено слишком много эмбрионов, они не приживутся.
6. С помощью прочной ленты иммобилизовать сцинтилляционные флаконы по бокам на настольном шейкере и перемешивать их в течение 20 мин при 220 об/мин. Для оптимальной фиксации поддерживайте энергичную эмульсию между органической и водной фазами в течение всей фиксации.
7. За время фиксации подготовьте для каждого из образцов один из следующих образцов.
   1. Возьмите пластиковую основу чашки Петри диаметром 6 см, заполненную наполовину 3% агаром, и нарежьте в агаре прямоугольник размером ~5 см х 3 см лезвием бритвы или скальпелем. Для этой цели также можно использовать пластины для фруктового сока/агара.
   2. С помощью небольшого лабораторного шпателя удалите агаровую плиту. Переверните основание чашки Петри и поставьте ее на скамью. Положите пластину агара на перевернутую посуду (Рисунок 2А).
   3. Возьмите крышку чашки Петри и убедитесь, что она сухая. Надев перчатки, поместите внутрь крышки кусок двустороннего скотча (кусок скотча должен быть немного больше, чем агаровая плита; Рисунок 2Б).
8. Выньте флаконы из шейкера, поставьте их вертикально на стол и дайте органической и водной фазам разделиться. Правильно зафиксированные эмбрионы остаются на границе между двумя фазами.
9. Перенесите зафиксированные эмбрионы на агаровую пластину с помощью стеклянной пипетки Пастера с латексной колбой. Чтобы предотвратить прилипание эмбрионов к внутренней части пипетки, старайтесь держать эмбрионы в узком горлышке пипетки и переносить эмбрионы несколькими небольшими партиями, а не все сразу. После того, как все эмбрионы окажутся на агаровой пластине, удалите большую часть остаточного гептана вокруг эмбрионов с помощью пипеттора P200. Выполняйте этот шаг как можно быстрее (<3 мин), чтобы избежать высыхания зафиксированных эмбрионов, что может негативно повлиять на морфологию.
10. С высоты ~2 см опустите крышку с двусторонним скотчем на агаровую пластину, чтобы приклеить эмбрионы к ленте (Рисунок 2C). Осторожно снимите крышку с агаровой плиты, положите ее вверх дном на стол, а затем добавьте достаточное количество PBS-Tween (Таблица 1), чтобы покрыть эмбрионы крышкой.
11. Используя стерео препарирующий микроскоп с примерно 100-кратным увеличением при непрямом освещении, идентифицируйте правильно расположенные эмбрионы с помощью морфологических маркеров. Для эмбрионов 6-й стадии используйте такие маркеры, как видимая головная борозда и инвагинированная мезодерма; для эмбрионов 7 стадии используйте маркеры, такие как удлиненная зародышевая полоса; Для эмбрионов на стадии 11 используйте такие маркеры, как полностью вытянутая зародышевая полоса и видимая сегментация вдоль оси¹⁶ от головы до хвоста.
    1. Чтобы собрать желаемые эмбрионы, сначала проткните вителлиновую мембрану (прозрачную овальную оболочку вокруг эмбриона) возле переднего или заднего конца эмбриона тонкой стеклянной иглой; Мембрана немного сдуется по мере сброса давления. Затем с помощью тонких щипцов или металлического зонда осторожно протолкните эмбрион с другого конца через отверстие; Мембрана Vitellline останется приклеенной к двустороннему скотчу. Оставьте нежелательные эмбрионы, прилипшие к ленте.
12. Периодически собирайте плавающие девителлинизированные эмбрионы стеклянной пастеровской пипеткой и перемещайте их в пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл.
13. На этом этапе выполните одно из следующих действий.
    1. Переходите непосредственно к этапам иммунофлуоресцентного мечения. Девителлинизированные эмбрионы могут попадать непосредственно в блокирующий раствор (шаг 2.2). Не позволяйте эмбрионам оставаться в PBS-Tween или блокирующем растворе (Таблица 1) дольше 16 ч, прежде чем перейти к следующему этапу.
    2. Переместите эмбрионы в метанол для хранения. Удалите как можно больше PBS-Tween, а затем добавьте 1 мл метанола. Как только эмбрионы осядут, удалите как можно больше метанола и добавьте 1 мл свежего метанола. Храните эмбрионы при температуре −20 °C неограниченное время. Хранение метанола также позволяет объединять эмбрионы из нескольких коллекций.

2. Иммунофлуоресцентное мечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо этапов инкубации антител, точное количество жидкости и время в этом разделе не имеют значения. Чтобы выполнить промывание или промывку, дайте эмбрионам осесть на дно пробирки, удалите как можно больше жидкости, не всасывая эмбрионы, а затем добавьте ~1 мл новой жидкости; используйте стеклянную пипетку Пастера с латексной колбой для оптимальной прозрачности и контроля. На этапе промывки эмбрионы не раскачивают, а просто дают им осесть; На этапе промывки эмбрионы качают на нутаторе в течение указанного количества времени, а затем дают им отстояться.

1. Если эмбрионы не хранились в метаноле, переходите к шагу 2.2. Если эмбрионы хранились в метаноле, дважды промыть PBS-Tween, а затем дважды промыть в течение 20 минут PBS-Tween.
2. Промывают эмбрионы в течение 30-60 мин в 1 мл блокирующего раствора.
3. Инкубируют эмбрионы с первичными антителами, разведенными в растворе антител (Таблица 1), в течение 2 ч при комнатной температуре или, предпочтительно, в течение ночи при 4 °C. Выполняйте этот этап в как можно меньшем объеме (50-300 мкл), чтобы сохранить первичные антитела; Качание на нутаторе строго не требуется.
   1. Увеличьте количество первичных антител, используемых в типичном иммунофлуоресцентном эксперименте, по крайней мере, на 50% для ExM. Используйте следующие концентрации первичных антител: 1:200 для поликлональных антител морской свинки²¹ и 1:100 для поликлональных анти-GFP кроликов.
4. Удалите первичный раствор антител (при желании сохраните при температуре 4 °C), дважды промойте PBS-Tween, а затем промойте в течение 15 минут четыре раза PBS-Tween.
5. Инкубируют эмбрионы с флуоресцентными вторичными антителами в конечном объеме 300 мкл (разведенных в растворе антител) в течение 1 ч при комнатной температуре на нутаторе. На этом этапе можно добавить флуоресцентно меченный стрептавидин. Начиная с этого этапа, по возможности защищайте эмбрионы от чрезмерного и длительного воздействия света, например, накрыв пробирки непрозрачной крышкой коробки или храня образцы в ящике.
   1. Используйте следующие концентрации: 1:500 для антикроличьего поликлонального козьего IgG, слитого с Alexa Fluor 488; 1:500 для поликлонального IgG козы, анти-морской свинки, слитого с Alexa Fluor 568; и 1:1000 для стрептавидина-Alexa Fluor 488.
6. Извлеките и утилизируйте вторичный раствор антител. Промывают эмбрионы дважды PBS-Tween и промывают в течение 15 мин четыре раза PBS-Tween.
7. На этом этапе эмбрионы можно хранить при температуре 4 °C в темноте, но обрабатывать образцы как можно быстрее (<24 ч).

3. Подготовка скважин PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины PDMS могут быть сделаны за 2 недели.

1. Установите инкубатор или конфорку на 55 °C, а центрифугу, которая может вращать конические пробирки, на 15 °C.
2. Для приготовления раствора ПДМС (табл. 1) поместите коническую пробирку объемом 50 мл во вторичную емкость на весах и с помощью шприца добавьте в пробирку 10 г основы из силиконового эластомера. Затем добавьте 1 г отвердителя силиконового эластомера и несколько раз переверните трубку, чтобы перемешать.
3. Создайте балансировочную пробирку, добавив соответствующее количество воды во вторую коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют раствор ПДМС при 500 х г в течение 3 мин при 15 °С, а затем переливают его в чашку Петри диаметром 10 см на глубину ~1 мм. При необходимости удалите пузырьки, аккуратно подув на раствор воздушным шлангом. Дайте раствору PDMS затвердеть в течение ночи при температуре 55 °C.
4. После того, как плита PDMS затвердеет, с помощью скальпеля надрежьте квадратные участки, которые немного меньше, чем покровный лист размером 22 мм x 22 мм. Внутри каждого квадрата надрежьте и удалите квадрат шириной ~8 мм.
5. Перенесите каждый квадратный PDMS на покровный лист размером 22 мм x 22 мм и плотно приклейте его (рис. 2D). Подготовка шести или более покровных стекол должна дать большое количество разросшихся эмбрионов для визуализации.

4. Приклеивание эмбрионов к покровным стеклам

1. Нанесите достаточное количество 0,1% поли-L-лизина, чтобы покрыть поверхность покровного стекла внутри каждой лунки (~50 мкл), и поместите их в инкубатор с температурой 55 °C для сушки на воздухе. Повторите этот шаг, чтобы увеличить адгезию.
2. Кратковременно промывайте эмбрионы один раз в 1x PBS, чтобы удалить моющее средство Tween, а затем перенесите >10 эмбрионов в каждую из лунок, покрытых поли-L-лизином.
3. Дайте эмбрионам осесть на дно лунок. Удалите лишнюю жидкость из прилипших эмбрионов с помощью пипетки Пастера. Сразу переходите к следующему шагу.

5. Активация и гелеобразование

ПРИМЕЧАНИЕ: Активация относится к добавлению MA-NHS к эмбрионам, которые модифицируют образцы белков и антител таким образом, чтобы они могли связываться с гидрогелем. Гелеобразование относится к образованию гидрогеля внутри и вокруг эмбрионов в каждой лунке. Во время гелеобразования эмбрионы пропитывают раствором мономера, а затем обрабатывают раствором гелеобразования с образованием гидрогеля.

1. Активируйте эмбрионы в течение 1 ч при комнатной температуре, заполнив лунки активационным раствором (1 мМ MA-NHS, свежеразбавленным в 1x PBS; Таблица 1). Меняйте этот раствор примерно каждые 10 мин в течение 1 ч.
2. Промыть эмбрионы 1x PBS три раза. Инкубируют эмбрионы в растворе мономера (табл. 1) в течение 45 мин при 4 °С.
3. Пока эмбрионы находятся в растворе мономера, приготовьте раствор для гелеобразования (табл. 1). Приготовления ~2 мл раствора гелеобразования достаточно, чтобы покрыть лунки ПДМС из целой чашки Петри диаметром 10 см. Обязательно добавляйте APS в последнюю очередь, так как он инициирует полимеризацию и начнет гелеобразование.
   1. Разбавьте каталитический окислитель свежим из порошка (например, 1% TEMPO w/v в воде). Смешайте 1 960 мкл раствора мономера с 30 мкл 10% TEMED и 10 мкл 1% TEMPO.
   2. Чтобы избежать полимеризации всей партии гелерационного раствора сразу, работайте небольшими партиями. Расщепляют раствор гелеобразования (без APS) на аликвоты по 125 мкл между восемью пробирками ПЦР-полоски.
   3. Удалите раствор мономера из трех лунок PDMS с помощью вакуума, стараясь не повредить эмбрионы. Добавьте 5 мкл APS в одну из пробирок для ПЦР, содержащую раствор гелеобразования, чтобы инициировать полимеризацию. Быстрое распределение полимеризующего гелеобразующего раствора по лункам (~40 мкл на лунку). Повторяйте это до тех пор, пока все лунки и эмбрионы не будут закрыты.
4. Дайте образцам загустеть в течение 1,5-2,5 ч при 37 °C. Время от времени перемешивайте гидрогели, чтобы контролировать полимеризацию. Затвердевшие гидрогели не будут покачиваться. Более густым гидрогелям потребуется больше времени для полной полимеризации и затвердевания.

6. Пищеварение и расширение

ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстым и крупным гелям потребуется больше времени для расширения, а центру гелей может потребоваться несколько часов, чтобы полностью расшириться; Этот процесс можно ускорить, обрезав края геля. По мере того, как гели расширяются, их показатель преломления становится почти таким же, как у воды, и их становится очень трудно увидеть.

1. После завершения гелеобразования отклейте лунки PDMS от покровного стекла, стараясь не повредить гидрогели. При желании отрежьте лишний гидрогелевый материал.
2. Переложите гидрогели (все еще прикрепленные к покровным стеклам) по отдельности в лунки шестилуночной пластины (Рисунок 2E). Обратите внимание, что гидрогели могут немного расширяться во время пищеварения.
3. Полностью покрыть гели буфером для пищеварения (таблица 1) в течение 1 ч при 37 °C. Как правило, 30 мл пищеварительного буфера достаточно, чтобы покрыть гели в 6-луночной планшете.
4. После разложения переложите каждый гидрогель по отдельности в чашку Петри диаметром 6 см, сдвинув их с покровного стекла. Возможно, потребуется использовать второй покровный листок, чтобы вытеснить гель. Наполните каждую чашку Петри деионизированной водой, чтобы расширить гель. Меняйте воду три-четыре раза в течение 1-2 ч до полного раскрытия гелей (ожидайте примерно четырехкратного увеличения в ширину).

7. Монтаж и визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Вспененные гидрогели почти полностью состоят из воды, что делает их почти прозрачными и чрезвычайно хрупкими. Гелями можно манипулировать с помощью длинных покровных стекол, чтобы перемещать их и поднимать. Монтируйте и изображайте только один или два геля за раз, так как гели будут постепенно выделять воду и начнут скользить по покровному стекле.

1. Используя пипетку Пастера, удалите как можно больше лишней воды из чашки Петри, чтобы свести к минимуму смещение гелей при обращении.
2. Переместите каждый расширенный гель с эмбрионами на нижнюю поверхность на большой покровный лист (например, 24 мм x 40 мм) для визуализации.
3. Наклейте каждый покровный лист с гелем на объектив инвертированного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа. Правильно расположенные и ориентированные образцы с помощью режимов эпифлуоресценции или светлопольной микроскопии на микроскопе с воздушным объективом с малым (5x или 10x) или средним (20x) увеличением.
4. Чтобы получить изображение с высоким разрешением, переключитесь на объектив с большим увеличением (60x, 63x или 100x) для погружения в масло или воду. Для получения изображения поверхность эмбрионов должна находиться в пределах диапазона фокусировки объектива (<300 мкм от покровного стекла для объектива с 63-кратным увеличением).
5. Сбор данных с образцов с помощью лазерно-сканирующего конфокального режима на микроскопе. Обязательно собирайте ненасыщенные изображения с хорошим динамическим диапазоном, и используйте соответствующее количество пикселей на изображение, чтобы захватить максимально возможную информацию о образце²³.

Рисунок 2: Ручная девителлинизация и работа с гидрогелями . (А) Вырезание агаровой плиты из пластины с агаром/фруктовым соком. (B) Помещение двустороннего скотча внутрь крышки чашки Петри диаметром 6 см. (C) Прилипание эмбрионов к заклеенной крышке. (D) Плита PDMS с квадратным отверстием, приклеенным к покровному покрытию размером 22 мм x 22 мм. (E) Покровное стекло с лункой PDMS внутри 6-луночного планшета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы охарактеризовать общую эффективность ExM у цельных эмбрионов дрозофилы, длина эмбриона вдоль оси от головы до хвоста была измерена у нерасширенных контрольных эмбрионов по сравнению с расширенными эмбрионами (рис. 3A-C). Нерасширенные контрольные эмбрионы были подвергнуты тем же условиям фиксации и иммунофлуоресцентному мечению, что и расширенные эмбрионы, за исключением того, что они были установлены с использованием затвердевшей монтажной среды перед визуализацией. Отдельные нерасширенные эмбрионы охватывали примерно половину поля зрения при использовании 10-кратного объектива (рис. 3A). Напротив, расширенные эмбрионы охватывали примерно два полных поля зрения при использовании одного и того же 10-кратного объектива (рис. 3B). Чтобы оценить, как изменяется степень экспансии как внутри, так и между экспериментами, один и тот же протокол ExM был выполнен в трех отдельных случаях, и длина эмбриона была измерена в трех разных гелях в каждом отдельном эксперименте. Средняя длина от головы до хвоста у нерасширенных контрольных эмбрионов составила 398,8 мкм (стандартное отклонение [SD] = 22,93 мкм; n = 74; Рисунок 3В). Для экспериментов 1, 2 и 3 средняя длина эмбриона составила 1596 мкм (SD = 159,9 мкм; n = 57), 1868 мкм (SD = 150,5 мкм; n = 51) и 1954 мкм (SD = 120,3 мкм; n = 44) соответственно, что соответствует коэффициентам расширения 4,0, 4,7 и 4,9 раза соответственно (рис. 3C). Внутриэкспериментальная вариабельность между гелями была значительно менее заметной, чем межэкспериментальная, которая составляла примерно 20% (рис. 3В). Для оценки влияния ExM на морфологию клеток и эмбрионов было использовано антитело против компонента адгезивного соединения Par-3 (Bazooka)21 для мечения апикальных клеточных мембран, и мы визуализировали развивающиеся ротовые сегменты эмбрионов дрозофилы ^11-й стадии — стадии со сложной сегментированной структурой (рис. 3D-F). В контрольной выборке клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 4,76 мкм (SD = 1,053 мкм, n = 25; Рисунок 3D,F). В расширенных образцах, полученных с использованием того же 40-кратного объектива и коэффициента масштабирования (1x), клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 19,10 мкм (SD = 3,966 мкм, n = 18; 3E,F), представляющий собой 4,0-кратное расширение. Таким образом, в соответствии с предыдущими отчетами¹¹, мы смогли увеличить целые эмбрионы дрозофилы примерно в четыре раза по линейным размерам с помощью ExM без разрыва образца или явных искажений в клеточной или тканевой морфологии.

Рисунок 3: Четырехкратное расширение эмбрионов дрозофилы. (A) Нерасширенные и (B) расширенные эмбрионы дрозофилы, полученные с помощью 10-кратного объектива (0,3 NA) при 1-кратном увеличении. Отдельные поля зрения (FOV) обозначены пунктирными линиями. Эмбрионы экспрессировали GFP-меченую версию легкой цепи миозина и были окрашены антителами против GFP. (C) Количественная оценка длины эмбриона (вдоль оси «от головы до хвоста») в трех гидрогелях за эксперимент и в трех отдельных экспериментах ExM по сравнению с нерасширенной контрольной группой. (Д,Э) Верхнечелюстные сегменты из (D) нерасширенных и (E) расширенных эмбрионов дрозофилы 11-й стадии, визуализированные с помощью 40-кратного объектива (1,3 NA) при 1-кратном увеличении. Контуры клеток (адгезивные соединения) были обнаружены антителами против Par-3/Bazooka (белого цвета). (F) Количественная оценка ширины ячейки (длинная ось) из эквивалентных групп ячеек из (D) и (E). Ящичковые диаграммы на рисунках (C) и (F) показывают диапазоны 25-го, 50-го и 75-го процентилей; усы обозначают минимальное и максимальное значения; Символы «+» обозначают среднее значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы продемонстрировать, что ExM может быть использован для разрешения субклеточных деталей ниже типичного дифракционного предела, цитоскелет актомиозина был визуализирован в нерасширенном контроле по сравнению с расширенными эмбрионами, подвергающимися конвергентному расширению (стадия 7). События ремоделирования тканей гаструляции и конвергентного растяжения в значительной степени контролируются изменениями локализации моторного белка миозина II²⁴. Однако в плотно упакованном столбчатом эпителии ранней эктодермы дрозофилы трудно разглядеть многие мелкие детали картины локализации миозина II даже при 158-кратном увеличении (63-кратный объектив с 2,5-кратным оптическим зумом) — типичная максимальная разрешающая способность для лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Например, из-за того, что миозин II является кортикальным белком (расположенным непосредственно под плазматической мембраной), пулы миозина II²⁵ , расположенные по обе стороны от межклеточных контактов, были неразрешимы у эмбрионов 7-й стадии, и они выглядели как одна линия, где соседние клетки встречались (рис. Напротив, у расширенных эмбрионов 7-й стадии в межклеточных соединениях можно было наблюдать параллельные линии миозина II, представляющие собой пулы кортикальных белков в соседних клетках (рис. 4B). Расстояние между параллельными линиями миозина II в расширенных образцах составило 892,7 нм (SD = 0,171 нм, n = 12); При делении на четыре это дает предсказанное расстояние ~220 нм между линиями миозина в соседних клетках у нерасширенных эмбрионов, что действительно чуть ниже дифракционного предела для сигнала, обнаруженного с помощью Alexa 488 (пиковое излучение ~520 нм/2 = 260 нм).

Кроме того, мы также проверили, можно ли использовать ExM для разрешения архитектуры митохондриальной сети в плотно упакованных клетках гаструлирующих эмбрионов дрозофилы (стадия 6). Функция митохондрий тесно связана со структурой сети (т.е. сросшимися или фрагментированными органеллами), но детали организации митохондриальной сети трудно визуализировать с помощью обычной конфокальной микроскопии в типах клеток, которые не являются плоскими и/или тонкими. Митохондрии естественным образом богаты биотинилированными молекулами, и, таким образом, митохондрии могут быть помечены в раннем эмбрионе дрозофилы с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина²⁶. У нерасширенных эмбрионов 6-й стадии, помеченных стрептавидином-Alexa 488, сигнал проявлялся в виде цитоплазматических точек, которые часто перекрывались и трудно разрешались (рис. 4C). Напротив, у расширенных эмбрионов 6-й стадии было видно гораздо больше мелких деталей митохондриальной сети, а пункты были легче различимы (рис. 4D)^26,27. Эти результаты указывают на то, что ExM может быть использован для изучения организации митохондриальной сети в типах клеток, традиционно не подходящих для митохондриального анализа.

Рисунок 4: Детали цитоскелета и митохондрий актомиозина, выявленные с помощью расширительной микроскопии. (A,B) Локализация миозина II в клетках нейроэктодермы (зародышевой полосы), визуализированная с помощью 63-кратного объектива (1,4 NA) при 2,5-кратном увеличении на стадии 7 (A) нерасширенные и (B) расширенные эмбрионы. Миозин II был обнаружен у эмбрионов, экспрессирующих трансгенную GFP-меченую версию регуляторной легкой цепи миозина II (sqh-GFP), которая была обнаружена с антителом к GFP (красный). Отчетливые пулы кортикального миозина, расположенные в соседних клетках, могут быть разрешены в расширенном эмбрионе (белые стрелки). (С,Д) Митохондриальные сети в клетках нейроэктодермы, визуализированные с помощью объектива 63× (1,4 NA) при 2,5-кратном увеличении у нерасширенных (C) и расширенных (D) эмбрионов 6-й стадии. Митохондрии были обнаружены с помощью стрептавидина-Alexa 488 (зеленый), а контуры клеток были обнаружены с помощью антитела против Par-3/Bazooka (пурпурного). Эксперименты проводили с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Рецепты растворов. Состав для растворов, используемых в данном протоколе, в порядке появления. Все акции являются ликвидными, если не указано иное. Химические вещества были ресуспендированы или разбавлены в автоклавной фильтрованной воде, если не указано иное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Ручная девителлинизация
Большинство протоколов фиксации эмбрионов дрозофилы включают удаление вителлиновой мембраны путем встряхивания фиксированных эмбрионов в эмульсии метанола и гептана, что вызывает разрыв мембран в результате осмотического разрыва²⁶. В то время как девителлинизация на основе метанола (лопание метанола) эффективна и подходит для многих применений, ручная девителлинизация (ручной пилинг) имеет ряд существенных преимуществ. Во-первых, ручной пилинг позволяет выбрать точно поставленные эмбрионы для девителлинизации и сбора, что значительно повышает вероятность получения расширенных эмбрионов в пригодной для использования ориентации в конце эксперимента. Это обогащение имеет решающее значение при изучении специфических аспектов процессов быстрого развития (например, инвагинации мезодермы или конвергентного расширения), для которых эмбрионы с соответствующей стадией могут составлять всего несколько процентов всех эмбрионов, даже в пределах ограниченного по времени окна сбора. Конечно, для многих применений будет достаточно более традиционного массового вскрытия эмбрионов метанолом из окна сбора по времени, а ручная очистка может не стоить дополнительных усилий. Во-вторых, на связывание некоторых первичных антител и красителей отрицательно влияет предыдущее воздействие метанола на образец. По этой причине ручной пилинг может привести к значительному повышению качества сигнала иммунофлуоресценции по сравнению с образцами метанола, что делает его полезным общим методом для биологов развития дрозофилы .

Конфокальная микроскопия высокого разрешения для расширенных цельных эмбрионов дрозофилы
Несмотря на то, что выполнение конфокальной микроскопии с высоким разрешением на расширенных образцах концептуально такое же, как и на нерасширенных образцах, ExM создает некоторые технические препятствия. Примечательно, что ориентация эмбриона, которая является случайной, становится еще более важной по мере увеличения размера выборки, потому что объективы с большим увеличением и высокой NA способны фокусировать свет только из областей образца, которые находятся очень близко к покровному стеклу²⁷. Поэтому, как правило, можно сфокусироваться только на тех клетках, которые находятся на поверхности эмбриона или рядом с ней, которые оказались рядом с покровным стеклом в момент формирования геля. Лучший способ убедиться в том, что в конце исследования имеются образцы правильной ориентации, заключается в том, чтобы начать протокол ExM с строго поэтапного сбора фиксированных эмбрионов (например, с помощью ручного пилинга) и посеять много эмбрионов в каждую лунку (>10). Для визуализации клеток, расположенных глубоко внутри эмбриона, может потребоваться использование более специализированных установок визуализации, таких как световая микроскопия²⁸. Кроме того, мы обнаружили, что качество изображения можно улучшить, открыв конфокальное точечное отверстие до размера, превышающего одну единицу воздуха. Конечно, увеличение размера точечного отверстия будет происходить за счет снижения максимального разрешения, но на практике даже небольшое увеличение размера точечного отверстия может значительно повысить интенсивность сигнала (данные не показаны). В будущих исследованиях необходимо систематически изучать размер точечных отверстий и эффективное разрешение в образцах ExM.

Вариации базового ExM
Протокол, описанный здесь, является относительно простым примером ExM, который должен работать во многих приложениях и быть простым в реализации в большинстве лабораторий биологии развития. Тем не менее, существует множество вариаций базовой концепции ExM ^4,5,7, которые могут быть использованы для увеличения интенсивности сигнала^, достижения еще большей степени расширения и обнаружения молекул нуклеиновых кислот, а также белков. В этом протоколе эмбрионы инкубируются с антителами перед гелеобразованием и расширением. В качестве альтернативы, образцы могут быть обработаны антителами после того, как они расширены ^6,30, что может увеличить интенсивность сигнала из-за увеличения доступности эпитопов и уменьшения потери связанных антител на этапах расширения. Кроме того, специфические сшивающие молекулы могут быть использованы для присоединения молекул РНК к гидрогелю, что позволяет обнаруживать РНК в расширенных гелях с помощью метода гибридизационной цепной реакции³⁰. Наконец, образцы могут быть подвергнуты нескольким циклам расширения, как в итеративной расширительной микроскопии (iExM)31, pan-ExM³² и раскрытии расширения (ExR)³¹, для достижения еще более высоких степеней повышенного разрешения.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Мы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер Заллен за предоставление морскому свинке первичного антитела против Par-3. Эта работа была поддержана щедрым финансированием (1R15GM143729-01 и 1P20GM139768-01 5743) от Национального института общих медицинских наук (NIGMS), одного из членов Национальных институтов здоровья (NIH), а также Института биологических наук Арканзаса (ABI), который предоставил частичное финансирование для покупки нашего конфокального микроскопа.