Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

O cavalo de batalha da biologia do desenvolvimento é o microscópio confocal, que permite aos pesquisadores determinar a localização tridimensional de moléculas marcadas dentro de amostras biológicas complexas. Enquanto os microscópios confocais tradicionais permitem resolver duas fontes de pontos fluorescentes adjacentes localizadas a algumas centenas de nanômetros de distância, observar os detalhes mais finos da biologia subcelular requer a capacidade de resolver sinais da ordem de dezenas de nanômetros. Numerosos métodos baseados em hardware para microscopia de super-resolução foram desenvolvidos para permitir que os pesquisadores contornem tais limites de resolução, embora esses métodos exijam microscópios especializados que não estão disponíveis para todos os pesquisadores. Um método alternativo para aumentar o poder de resolução é ampliar isotropicalmente a própria amostra por meio de um processo conhecido como microscopia de expansão (ExM), que foi descrito pela primeira vez pelo grupo de Boyden em 2015. A ExM não é um tipo de microscopia em si , mas sim um método para inchar uma amostra, preservando a organização espacial relativa de suas moléculas constituintes. A amostra expandida pode então ser observada em uma resolução efetivamente aumentada usando um microscópio confocal tradicional. Aqui, descrevemos um protocolo para implementação de ExM em embriões de Drosophila de montagem inteira, que é usado para examinar a localização de Par-3, miosina II e mitocôndrias dentro das células epiteliais de superfície. Esse protocolo aumenta aproximadamente quatro vezes o tamanho da amostra, permitindo a detecção de detalhes subcelulares que não são visíveis com a microscopia confocal convencional. Como prova de princípio, um anticorpo anti-GFP é usado para distinguir pools distintos de miosina-GFP entre córtices celulares adjacentes, e estreptavidina fluorescentemente marcada é usada para detectar moléculas endógenas biotiniladas para revelar os detalhes finos da arquitetura da rede mitocondrial. Este protocolo utiliza anticorpos e reagentes comuns para marcação de fluorescência, e deve ser compatível com muitos protocolos de imunofluorescência existentes.

Na biologia celular e do desenvolvimento, ver é acreditar, e a capacidade de determinar com precisão os padrões de localização das proteínas é fundamental para muitos tipos de experimentos. A microscopia confocal de varredura a laser é a ferramenta padrão para obter imagens de proteínas marcadas fluorescentemente em três dimensões dentro de amostras intactas. Microscópios confocais convencionais são incapazes de distinguir (resolver) sinais fluorescentes adjacentes que estão separados por menos da metade do comprimento de onda da luz que emitem¹. Em outras palavras, duas fontes pontuais devem ser separadas por pelo menos 200-300 nm na direção lateral (500-700 nm na direção axial) para resolvê-las como dois sinais distintos. Essa barreira técnica é conhecida como limite de difração e é um obstáculo fundamental para estudos de estruturas subcelulares complexas (por exemplo, redes citoesqueléticas ou mitocondriais de actomiosina) com características espaciais abaixo do limite de difração. Portanto, técnicas para aumentar o poder de resolução dos microscópios confocais convencionais são de interesse geral para a comunidade biológica.

Para contornar o limite de difração, várias tecnologias de microscopia de super-resolução foram desenvolvidas que permitem resolução na ordem de dezenas de nanômetros ou menos ^1,2,3, revelando um mundo de complexidade biológica que antes só era acessível via microscopia eletrônica. Apesar das vantagens óbvias desses métodos baseados em hardware, os microscópios de super-resolução geralmente têm requisitos específicos de marcação de amostras e longos tempos de aquisição, limitando sua flexibilidade, ou podem simplesmente ser muito caros para alguns laboratórios acessarem. Uma alternativa à super-resolução baseada em microscópio é a microscopia de expansão (ExM), que não é um tipo de microscopia em si, mas sim um método para inchar uma amostra, preservando a organização espacial relativa de suas moléculas constituintes⁴. As amostras expandidas isotropicalmente podem então ser observadas em uma resolução efetivamente aumentada usando um microscópio confocal de fluorescência tradicional. A ExM foi descrita pela primeira vez pelo grupo de Boyden em 2015⁵ e, desde então, a técnica básica foi adaptada para uso em uma variedade de experimentos ^6,7,8. A ExM também foi adaptada para uso em embriões de montagem inteira, notavelmente em Drosophila 9,10,11, C. elegans¹² e zebrafish ^13, tornando-se uma ferramenta poderosa para biólogos do desenvolvimento.

A ExM é baseada em duas químicas diferentes de hidrogel: 1) hidrogéis de polieletrólitos incháveis, que aumentam muito de tamanho quando embebidos em água¹⁴, e 2) hidrogéis de poliacrilamida, que têm espaçamento de polímero extremamente pequeno para permitir a expansão isotrópica da amostra¹⁵. Embora existam muitos protocolos de ExM publicados, eles geralmente compartilham as seguintes etapas: fixação da amostra, rotulagem, ativação, gelificação, digestão e expansão⁴. As condições de fixação e as estratégias de marcação por fluorescência variam de acordo com as necessidades do experimento e do sistema e, em alguns protocolos, a marcação ocorre após a expansão. As moléculas-alvo da amostra devem ser preparadas (ativadas) para se ligarem ao hidrogel, o que pode ser obtido usando diferentes químicas⁴. Durante as etapas de gelificação, a amostra é saturada com monômeros do futuro hidrogel (acrilato de sódio, acrilamida e o reticulante bisacrilamida), e o hidrogel é então formado pela polimerização por radicais livres catalisada por um iniciador, como o persulfato de amônio (APS), e um acelerador, como a tetrametilenodiamina (TEMED)⁴. Após a gelificação, a amostra é digerida enzimaticamente para homogeneizar a resistência da amostra ao inchamento e garantir a expansão isotrópica do hidrogel⁴. Finalmente, o hidrogel digerido é colocado em água, o que faz com que ele se expanda para aproximadamente quatro vezes seu tamanho linear original⁴.

Figura 1: Visão geral da microscopia de expansão em embriões de Drosophila . O ExM é um protocolo de várias etapas que leva pelo menos 4 dias para ser concluído. A coleta, fixação e desvitellinização de embriões levam 1 dia ou mais, dependendo se os embriões de várias coleções são agrupados. A marcação por imunofluorescência leva 1 dia ou 2 dias, dependendo se os embriões são incubados durante a noite com os anticorpos primários. A ativação, gelificação, digestão e expansão do embrião podem ser realizadas em um único dia. Os géis podem ser montados e fotografados imediatamente após a expansão, embora, por razões práticas, muitas vezes seja desejável iniciar a imagem no dia seguinte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve como realizar a ExM em embriões de Drosophila de montagem completa em estágio inicial a médio¹⁶ para visualizar padrões de localização de proteínas subcelulares em super-resolução (Figura 1). Este método utiliza a química do ácido metilacrílico N-hidroxisuccinimidil éster (MA-NHS) para ativar e ancorar moléculas proteicas ao hidrogel¹⁷, e é uma modificação de um protocolo de ExM publicado anteriormente para uso em embriões e tecidos de Drosophila em estágio avançado¹¹. Este protocolo utiliza poços de polidimetilsiloxano (PDMS) para moldar os hidrogéis e facilitar a troca da solução durante a ativação e gelificação. Um método alternativo que não requer a criação de poços PDMS envolve a redução de embriões presos a lamínulas em gotas de solução de monômero assentadas em um pedaço de filme de vedação de laboratório²². Além disso, este protocolo descreve um método para remover manualmente a membrana impermeável vitelina que envolve embriões de Drosophila , que é um pré-requisito para a coloração por imunofluorescência. É importante ressaltar que esse método de descascamento manual de embriões pode ser usado para selecionar apenas embriões de Drosophila adequadamente estadiados antes da marcação da amostra, o que aumenta muito a probabilidade de acabar com amostras expandidas do estágio e orientação corretos e, assim, torna a coleta de dados a jusante muito mais eficiente.

Este protocolo segue as diretrizes da Universidade do Arkansas (UARK) para pesquisa em animais invertebrados, como Drosophila melanogaster, e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança da UARK (protocolo #20001).

1. Fixação e desvio de embriões de Drosophila

NOTA: O passo 1 descreve um procedimento (peeling manual) para a remoção manual da membrana vitelina, uma membrana impermeável transparente que envolve o embrião. É importante ressaltar que o peeling manual permite a seleção de embriões adequadamente estagiados no início do protocolo ExM, aumentando consideravelmente a probabilidade de obter embriões em uma orientação utilizável no final do protocolo ExM. No entanto, este protocolo ExM é completamente compatível com a coleta de embriões em massa e procedimentos padrão para remoção da membrana vitelínica à base de metanol, caso em que pode-se pular diretamente para a etapa 2 (marcação por imunofluorescência).

1. Prepare ou compre uma série de agulhas de vidro fino. As dimensões reais da ponta da agulha não são críticas, mas certifique-se de que as agulhas sejam rígidas e afiadas o suficiente para perfurar as membranas vitelinas de embriões fixos. Fabricar agulhas a partir de tubos capilares de vidro (1 mm de diâmetro externo, 0,75 mm de diâmetro interno) utilizando um puxador de micropipetas, como se prepararia agulhas para microinjeções de embriões¹⁸; alternativamente, compre agulhas pré-puxadas.
2. Coletar embriões usando técnicas padrão de Drosophila¹⁹ colocando >100 adultos de Drosophila em um copo plástico ventilado selado com uma placa de suco de frutas/ágar²⁰. Utilizar janelas cronometradas de coleta para enriquecer embriões do estágio adequado¹⁶. Por exemplo, para enriquecer para os estágios de gastrulação (estágio 6) e extensão convergente (estágio 7), troque a placa de suco de fruta, colete os embriões por 2 h a 25 °C, depois remova a placa e envelheça-a por mais 2 h a 25 °C para obter embriões com ~2-4 h de idade.
3. Para remover o córion em forma de casca de ovo dos embriões, cubra a superfície das placas de suco de fruta com água sanitária a 50% (Tabela 1), solte os embriões da superfície do ágar agitando-os com um pequeno pincel e aguarde 3 min para que o córion se dissolva.
4. Transferir os embriões descorionados com pincel para um frasco de cintilação de 30 mL contendo 4 mL de heptano (fase orgânica superior) e 4 mL de tampão de fixação (fase inferior aquosa; Tabela 1). Diluir recentemente o formaldeído de um caldo recém-preparado ou recém-aberto e misturar com 10x PBS e água deionizada imediatamente antes de adicionar os embriões.
   NOTA: Prepare o formaldeído a partir de paraformaldeído ou formaldeído de grau 16% em ampolas de vidro. Estoques de formaldeído concentrado (por exemplo, formaldeído a 37%) podem ser usados, embora os resultados possam ser menos consistentes.
5. Os embriões se acumularão na interface entre as fases orgânica e aquosa. Adicione tantos embriões quantos formarão uma única camada na interface. Se muitos embriões forem adicionados a um frasco, eles não consertarão tão bem.
6. Usando fita adesiva forte, imobilize os frascos de cintilação nas laterais em um agitador de mesa e agite-os por 20 min a 220 rpm. Para uma fixação ideal, manter uma emulsão vigorosa entre as fases orgânica e aquosa durante toda a fixação.
7. Durante o tempo de fixação, prepare um dos seguintes itens para cada uma das amostras.
   1. Pegue uma base plástica de placa de Petri de 6 cm preenchida no meio do caminho com ágar 3% e marque um retângulo de ~5 cm x 3 cm no ágar com uma lâmina de barbear ou bisturi. Pratos de suco de frutas/ágar também podem ser usados para este fim.
   2. Usando uma pequena espátula de laboratório, remova a placa de ágar. Inverta a base da placa de Petri e coloque-a no banco. Coloque a laje de ágar em cima da placa invertida (Figura 2A).
   3. Pegue a tampa da placa de Petri e certifique-se de que está seca. Usando luvas, coloque um pedaço de fita dupla face dentro da tampa (o pedaço de fita deve ser um pouco maior do que a laje de ágar; Figura 2B).
8. Retire os frascos para injetáveis da agitadora, coloque-os na vertical na bancada e deixe separar as fases orgânica e aquosa. Embriões devidamente fixados permanecerão na interface entre as duas fases.
9. Transfira os embriões fixados para a laje de ágar usando uma pipeta de vidro Pasteur equipada com um bulbo de látex. Para evitar que os embriões adiram ao interior da pipeta, tente manter os embriões dentro do colo estreito da pipeta e transfira os embriões em vários pequenos lotes em vez de todos de uma só vez. Uma vez que todos os embriões estejam na laje de ágar, remova a maior parte do heptano residual ao redor dos embriões usando um pipetador P200. Realize esta etapa o mais rápido possível (<3 min) para evitar o ressecamento dos embriões fixados, o que pode afetar negativamente a morfologia.
10. A partir de uma altura de ~2 cm, solte a tampa com a fita dupla face sobre a laje de ágar para aderir os embriões à fita (Figura 2C). Retire suavemente a tampa da laje de ágar, coloque-a de cabeça para baixo na bancada e, em seguida, adicione PBS-Tween suficiente (Tabela 1) para cobrir os embriões na tampa.
11. Usando um microscópio dissecante estéreo em aumento de aproximadamente 100x com iluminação indireta, identifique embriões adequadamente estadiados usando marcadores morfológicos. Para embriões em estágio 6, utilizar marcadores como sulco cefálico visível e mesoderma invaginado; para embriões em estágio 7, use marcadores como uma banda germinativa estendida; Para embriões em estágio 11, utilizar marcadores como uma banda germinativa totalmente estendida e segmentação visível ao longo do eixo cabeça-cauda¹⁶.
    1. Para coletar os embriões desejados, primeiro pique a membrana vitelínica (uma membrana oval transparente ao redor do embrião) perto da extremidade anterior ou posterior do embrião com uma agulha de vidro fina; A membrana vai desinchar um pouco à medida que a pressão libera. Em seguida, usando pinças finas ou uma sonda de metal, empurre suavemente o embrião na outra extremidade através do orifício; A membrana vitelínica permanecerá aderida à fita dupla face. Deixe embriões indesejados aderidos à fita.
12. Coletar periodicamente os embriões desviatelinizados flutuantes com uma pipeta de vidro de Pasteur e movê-los para um tubo de microfuga de 1,5 mL.
13. Neste ponto, execute uma das seguintes etapas.
    1. Continue diretamente para as etapas de marcação de imunofluorescência. Os embriões desviados podem ir directamente para a solução de bloqueio (passo 2.2). Não permitir que os embriões permaneçam em PBS-Tween ou solução de bloqueio (Tabela 1) por mais de 16 h antes de prosseguir para a próxima etapa.
    2. Mova os embriões para metanol para armazenamento. Remova o máximo possível de PBS-Tween e, em seguida, adicione 1 mL de metanol. Uma vez que os embriões tenham se estabelecido, remova o máximo de metanol possível e adicione 1 mL de metanol fresco. Armazenar os embriões a -20 °C indefinidamente. O armazenamento de metanol também permite o agrupamento de embriões de várias coleções.

2. Marcação por imunofluorescência

NOTA: Além das etapas de incubação de anticorpos, quantidades e tempos exatos de líquido não são críticos nesta seção. Para realizar um enxágue ou lavagem, deixe os embriões se acomodarem no fundo da trompa, remova o máximo de líquido possível sem sugar os embriões e, em seguida, adicione ~1 mL de novo líquido; use uma pipeta de vidro Pasteur equipada com uma lâmpada de látex para uma clareza e controle ideais. Para a etapa de enxágue, os embriões não são balançados, apenas deixados assentar; Para a etapa de lavagem, os embriões são balançados em um nutador pelo tempo indicado e, em seguida, deixados assentar.

1. Se os embriões não tiverem sido armazenados em metanol, avance para o passo 2.2. Se os embriões foram armazenados em metanol, enxaguar duas vezes com PBS-Tween e, em seguida, lavar por 20 min duas vezes com PBS-Tween.
2. Lave os embriões por 30-60 min em 1 mL de solução de bloqueio.
3. Incubar os embriões com anticorpos primários diluídos em solução de anticorpos (Tabela 1) durante 2 h à temperatura ambiente ou, de preferência, durante a noite a 4 °C. Realizar esta etapa no menor volume possível (50-300 μL) para conservar os anticorpos primários; balançar em um nutador não é estritamente necessário.
   1. Aumentar a quantidade de anticorpo primário usado em um experimento típico de imunofluorescência em pelo menos 50% para ExM. Use as seguintes concentrações primárias de anticorpos: 1:200 para anti-Par-3 cobaia policlonal²¹ e 1:100 para anti-GFP coelho policlonal.
4. Retire a solução de anticorpos primários (poupar a 4 °C, se desejado), enxaguar duas vezes com PBS-Tween e, em seguida, lavar durante 15 minutos quatro vezes com PBS-Tween.
5. Incubar os embriões com anticorpos secundários fluorescentes num volume final de 300 μL (diluído em solução de anticorpos) durante 1 h à temperatura ambiente num nutador. A estreptavidina fluorescente pode ser adicionada durante esta etapa. A partir deste passo, proteja os embriões da exposição excessiva e prolongada à luz quando possível, por exemplo, cobrindo os tubos com uma tampa de caixa opaca ou mantendo as amostras em uma gaveta.
   1. Use as seguintes concentrações: 1:500 para cabra anti-coelho IgG policlonal fundido a Alexa Fluor 488; 1:500 para cabra IgG anticobaia policlonal fusionada a Alexa Fluor 568; e 1:1000 para estreptavidina-Alexa Fluor 488.
6. Remova e elimine a solução de anticorpos secundários. Enxaguar os embriões duas vezes com PBS-Tween e lavar por 15 min quatro vezes com PBS-Tween.
7. Neste ponto, os embriões podem ser armazenados a 4 °C no escuro, mas processam as amostras o mais rápido possível (<24 h).

3. Preparação de poços PDMS

OBS: Os poços PDMS podem ser feitos com até 2 semanas de antecedência.

1. Ajuste uma incubadora ou placa quente a 55 °C e defina uma centrífuga que possa girar tubos cônicos a 15 °C.
2. Para preparar a solução de PDMS (Tabela 1), colocar um tubo cônico de 50 mL em um recipiente secundário em uma balança e adicionar 10 g de base de elastômero de silicone ao tubo usando uma seringa. Em seguida, adicione 1 g de elastômero de silicone e inverta o tubo várias vezes para misturar.
3. Crie um tubo de equilíbrio adicionando uma quantidade adequada de água a um segundo tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a solução de PDMS a 500 x g durante 3 min a 15 °C e, em seguida, deitá-la numa placa de Petri de 10 cm a uma profundidade de ~1 mm. Se necessário, remova as bolhas soprando suavemente sobre a solução com uma mangueira de ar. Deixe a solução PDMS solidificar durante a noite a 55 °C.
4. Uma vez que a laje do PDMS é solidificada, usando um bisturi, pontuar áreas quadradas que são ligeiramente menores do que uma lamínula de 22 mm x 22 mm. Dentro de cada quadrado, marque e remova um poço quadrado de ~8 mm de largura.
5. Transfira bem cada PDMS quadrado para uma lamínula de 22 mm x 22 mm e adera-o firmemente (Figura 2D). A preparação de seis ou mais lamínulas deve produzir um bom número de embriões expandidos para a imagem.

4. Aderência dos embriões às lamínulas

1. Aplicar poli-L-lisina a 0,1% suficiente para cobrir a superfície de cobertura dentro de cada poço (~50 μL) e colocá-los em uma incubadora de 55 °C para secar ao ar. Repita este passo para aumentar a adesividade.
2. Enxaguar brevemente os embriões uma vez em 1x PBS para remover o detergente Tween e, em seguida, transferir >10 embriões para cada um dos poços revestidos com poli-L-lisina.
3. Deixe os embriões se acomodarem no fundo dos poços. Retire o excesso de líquido dos embriões aderidos utilizando uma pipeta de Pasteur. Prossiga imediatamente para a próxima etapa.

5. Ativação e gelificação

NOTA: A ativação refere-se à adição de MA-NHS aos embriões, que modificará as proteínas e anticorpos da amostra para que possam se ligar ao hidrogel. A gelificação refere-se à geração de um hidrogel dentro e ao redor dos embriões em cada poço. Durante a gelificação, os embriões são permeados com uma solução de monômero e, em seguida, tratados com uma solução de gelificação para formar o hidrogel.

1. Ativar os embriões por 1 h à temperatura ambiente, preenchendo os poços com solução de ativação (1 mM MA-NHS recém-diluído em 1x PBS; Tabela 1). Troque esta solução aproximadamente a cada 10 minutos ao longo de 1 h.
2. Enxaguar os embriões com 1x PBS três vezes. Incubar os embriões em solução de monómero (Tabela 1) durante 45 min a 4 °C.
3. Enquanto os embriões estiverem na solução do monômero, preparar a solução de gelificação (Tabela 1). Preparar ~2 mL de solução de gelificação é suficiente para cobrir os poços PDMS de uma placa de Petri inteira de 10 cm. Certifique-se de adicionar o APS por último, pois ele iniciará a polimerização e iniciará a gelificação.
   1. Diluir o oxidante catalítico na hora a partir do pó (por exemplo, 1% TEMPO p/v em água). Combinar 1.960 μL de solução monomérica com 30 μL de TEMED a 10% e 10 μL de TEMPO a 1%.
   2. Para evitar a polimerização de todo o lote de solução de gelificação de uma só vez, trabalhe em pequenos lotes. Dividir a solução de gelificação (sem SAF) em alíquotas de 125 μL entre os oito tubos de uma tira de PCR.
   3. Remova a solução de monômero dos três poços PDMS usando um vácuo, tomando cuidado para não interromper os embriões. Adicionar 5 μL de APS a um dos tubos de PCR contendo solução de gelificação para iniciar a polimerização. Distribuir rapidamente a solução de gelificação polimerizante entre os poços (~40 μL por poço). Repita isso até que todos os poços e embriões estejam cobertos.
4. Deixe as amostras gelar por 1,5-2,5 h a 37 °C. Agite os hidrogéis de vez em quando para monitorar a polimerização. Os hidrogéis solidificados não oscilam. Hidrogéis mais espessos levarão mais tempo para completar a polimerização e solidificar.

6. Digestão e expansão

NOTA: Géis mais espessos e maiores levarão mais tempo para se expandir, e o centro dos géis pode levar várias horas para se expandir completamente; Isso pode ser acelerado aparando as bordas do gel. À medida que os géis se expandem, seu índice de refração se tornará quase idêntico ao da água, e eles se tornarão muito difíceis de ver.

1. Depois que a gelificação estiver completa, descasque os poços de PDMS da lamínula enquanto tenta não perturbar os hidrogéis. Corte o excesso de material de hidrogel, se desejar.
2. Transfira os hidrogéis (ainda presos às lamínulas) individualmente para os poços de uma placa de seis poços (Figura 2E). Note que os hidrogéis podem expandir-se ligeiramente durante a digestão.
3. Cobrir completamente os géis com tampão de digestão (Tabela 1) durante 1 h a 37 °C. Em geral, 30 mL de tampão de digestão são suficientes para cobrir os géis em uma placa de 6 poços.
4. Após a digestão, transfira cada hidrogel individualmente para uma placa de Petri de 6 cm, deslizando-os para fora da lamínula. Pode ser necessário usar uma segunda lamínula para desalojar o gel. Encha cada placa de Petri com água deionizada para expandir o gel. Troque a água de três a quatro vezes ao longo de 1-2 h até que os géis estejam totalmente expandidos (espere um aumento aproximado de quatro vezes na largura).

7. Montagem e geração de imagens

NOTA: Os hidrogéis expandidos são compostos quase inteiramente de água, tornando-os quase transparentes e extremamente frágeis. Os géis podem ser manipulados usando longas lamínulas para movê-los e pegá-los. Monte e imagine apenas um ou dois géis de cada vez, pois os géis gradualmente liberam água e começam a deslizar ao redor da tampa.

1. Usando uma pipeta de Pasteur, remova o máximo possível de água em excesso da placa de Petri para minimizar a movimentação dos géis quando manuseados.
2. Manobrar cada gel expandido, com os embriões na superfície inferior, em uma grande lamínula (por exemplo, 24 mm x 40 mm) para obtenção de imagens.
3. Monte cada lamínula com gel sobre a objetiva de um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Localize espécimes adequadamente estadiados e orientados usando os modos de microscopia de epifluorescência ou campo claro no microscópio com objetivas de ar de baixa magnificação (5x ou 10x) ou média (20x).
4. Para obter imagens em alta resolução, alterne para uma objetiva de imersão em óleo ou água de alta ampliação (60x, 63x ou 100x). A superfície dos embriões deve estar dentro da faixa de focalização da objetiva (<300 μm da lamínula para uma objetiva de 63x) para ser fotografada.
5. Coletar dados de amostras usando o modo confocal de varredura a laser no microscópio. Certifique-se de coletar imagens não saturadas com bom alcance dinâmico e use um número apropriado de pixels por imagem para capturar o máximo possível de informações sobre a amostra²³.

Figura 2: Devitellinização manual e trabalho com hidrogéis . (A) Corte de uma placa de ágar/suco de frutas. (B) Colocação de fita dupla face dentro da tampa de uma placa de Petri de 6 cm. (C) Embriões aderidos à tampa presa. (D) Laje PDMS com poço quadrado aderido a lamínula de 22 mm x 22 mm. (E) Tampa com um poço PDMS dentro de uma placa de 6 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para caracterizar a eficácia geral da ExM em embriões de Drosophila de montagem total, o comprimento do embrião ao longo do eixo cabeça-cauda foi medido em embriões controle não expandidos versus embriões expandidos (Figura 3A-C). Os embriões controle não expandidos foram submetidos às mesmas condições de fixação e etapas de marcação por imunofluorescência que os embriões expandidos, exceto que foram montados usando um meio de montagem solidificado antes da obtenção de imagens. Os embriões individuais não expandidos abrangeram aproximadamente metade de um campo de visão quando se utilizou uma objetiva de 10x (Figura 3A). Em contraste, os embriões expandidos abrangeram aproximadamente dois campos de visão completos quando se utilizou a mesma objetiva de 10x (Figura 3B). Para avaliar como o grau de expansão variou dentro e entre os experimentos, o mesmo protocolo de ExM foi realizado em três ocasiões distintas, e o comprimento do embrião foi medido em três géis diferentes dentro de cada experimento individual. O comprimento cabeça-cauda médio dos embriões controles não expandidos foi de 398,8 μm (desvio padrão [DP] = 22,93 μm; n = 74; Figura 3C). Para os experimentos 1, 2 e 3, os comprimentos médios dos embriões foram de 1.596 μm (DP = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (DP = 150,5 μm; n = 51) e 1.954 μm (DP = 120,3 μm; n = 44), respectivamente, representando fatores de expansão de 4,0, 4,7 e 4,9 vezes, respectivamente (Figura 3C). A variação intra-experimental entre os géis foi bem menos perceptível do que a variação interexperimental, que foi de aproximadamente 20% (Figura 3C). Para avaliar os efeitos da ExM na morfologia celular e embrionária, um anticorpo contra o componente da junção aderente Par-3 (Bazuca)21 foi usado para marcar as membranas celulares apicais, e obtivemos imagens dos segmentos da boca em desenvolvimento de embriões de Drosophila estágio ¹¹ – um estágio com uma estrutura segmentada complexa (Figura 3D-F). Na amostra controle, as células do segmento maxilar apresentaram largura média de 4,76 μm (DP = 1,053 μm, n = 25; Figura 3D,F). Nas amostras expandidas com a mesma objetiva e zoom de 40x (1x), as células do segmento maxilar apresentaram largura média de 19,10 μm (DP = 3,966 μm, n = 18; Figura 3E,F), representando uma expansão de 4,0 vezes. Portanto, consistente com relatos anteriores¹¹, conseguimos expandir embriões de Drosophila de montagem inteira aproximadamente quatro vezes em dimensões lineares usando ExM sem rasgamento da amostra ou distorções óbvias na morfologia celular ou tecidual.

Figura 3: Expansão quádrupla de embriões de Drosophila. (A) Embriões de Drosophila não expandidos e (B) expandidos fotografados usando uma objetiva de 10x (0,3 NA) com zoom de 1x. Os campos de visão individuais (FOV) são indicados com linhas tracejadas. Os embriões expressaram uma versão marcada com GFP da cadeia leve da miosina e foram corados com um anticorpo anti-GFP. (C) Quantificação do comprimento do embrião (ao longo do eixo cabeça-cauda) em três hidrogéis por experimento e a partir de três experimentos ExM separados em comparação com controles não expandidos. (D,E) Segmentos maxilares de embriões de Drosophila em estágio 11 não expandidos e (E) expandidos foram fotografados usando uma objetiva de 40x (1,3 NA) com zoom de 1x. Os contornos celulares (junções aderentes) foram detectados com um anticorpo anti Par-3/Bazuca (branco). (F) Quantificação da largura da célula (eixo longo) a partir de grupos equivalentes de células de (D) e (E). Os box plots em (C) e (F) mostram os intervalos dos percentis 25, 50 e 75; os bigodes indicam os valores mínimo e máximo; os símbolos "+" indicam a média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar que a ExM pode ser usada para resolver detalhes subcelulares abaixo do limite típico de difração, o citoesqueleto da actomiosina foi fotografado em controle não expandido versus embriões expandidos em extensão convergente (estágio 7). Os eventos de remodelação tecidual de gastrulação e extensão convergente são amplamente controlados por alterações na localização da proteína motora miosina II²⁴. No entanto, no epitélio colunar densamente compactado do ectoderma inicial de Drosophila , é difícil observar muitos detalhes finos do padrão de localização da miosina II, mesmo quando obtido o imaginário com aumento de 158x (objetiva de 63x com zoom óptico de 2,5x) — um poder de resolução máximo típico para um microscópio confocal de varredura a laser. Por exemplo, como a miosina II é uma proteína cortical (localizada diretamente abaixo da membrana plasmática), pools de miosina II²⁵ localizados em ambos os lados dos contatos célula-célula não foram resolúveis nos embriões do estágio 7, e eles apareceram como uma única linha onde as células vizinhas se encontravam (Figura 4A). Em contraste, nos embriões de estágio 7 expandido, linhas paralelas de miosina II puderam ser observadas nas junções célula-célula, representando pools de proteínas corticais em células adjacentes (Figura 4B). A distância entre as linhas paralelas da miosina II nas amostras expandidas foi de 892,7 nm (DP = 0,171 nm, n = 12); quando dividido por quatro, isso produz uma distância prevista de ~220 nm entre as linhas de miosina em células adjacentes em embriões não expandidos, que é de fato um pouco abaixo do limite de difração para um sinal detectado com Alexa 488 (emissão de pico de ~520 nm/2 = 260 nm).

Além disso, também testamos se a ExM poderia ser usada para resolver a arquitetura da rede mitocondrial em células densamente compactadas de embriões gastrulantes de Drosophila (estágio 6). A função mitocondrial está intimamente ligada à estrutura da rede (isto é, organelas fundidas versus fragmentadas), mas os detalhes da organização da rede mitocondrial são difíceis de visualizar usando a microscopia confocal convencional em tipos celulares que não são planos e/ou finos. As mitocôndrias são naturalmente ricas em moléculas biotiniladas e, assim, as mitocôndrias podem ser marcadas no embrião inicial de Drosophila usando estreptavidina fluorescentemente marcada²⁶. Nos embriões não expandidos do estágio 6 marcados com estreptavidina-Alexa 488, o sinal apareceu como pontos citoplasmáticos frequentemente sobrepostos e de difícil resolução (Figura 4C). Em contraste, nos embriões do estágio 6 expandido, muitos detalhes mais finos da rede mitocondrial eram visíveis e os pontos eram mais facilmente resolúveis (Figura 4D)^26,27. Estes resultados indicam que a ExM pode ser usada para estudar a organização de redes mitocondriais em tipos celulares não tradicionalmente adequados para análise mitocondrial.

Figura 4: Detalhes do citoesqueleto da actomiosina e mitocôndrias revelados por microscopia de expansão. (A,B) Localização da miosina II em células do neuroectoderma (banda germinativa) fotografadas com objetiva de 63x (1,4 NA) com zoom de 2,5x nos estágios 7 (A) embriões não expandidos e (B) expandidos. A miosina II foi detectada nos embriões expressando uma versão transgênica marcada com GFP da cadeia leve regulatória de miosina II (sqh-GFP), que foi detectada com um anticorpo anti-GFP (vermelho). Grupos distintos de miosina cortical localizados em células adjacentes podem ser resolvidos no embrião expandido (setas brancas). (C,D) Redes mitocondriais em células neuroectodérmicas imageadas com objetiva de 63× (1,4 NA) com zoom de 2,5x nos estágios 6 de embriões não expandidos (C) e expandidos (D). As mitocôndrias foram detectadas com estreptavidina-Alexa 488 (verde), e os contornos celulares foram detectados com um anticorpo anti-Par-3/Bazuca (magenta). Os experimentos foram realizados com microscópio confocal de varredura a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de solução. Composição das soluções utilizadas neste protocolo por ordem de aparecimento. Todos os estoques são líquidos, salvo indicação em contrário. Os produtos químicos foram ressuspensos ou diluídos em água filtrada autoclavada, salvo indicação em contrário. Clique aqui para baixar esta tabela.

Devitellinização manual
A maioria dos protocolos de fixação embrionária de Drosophila envolve a remoção da membrana vitelínica, agitando embriões fixados em emulsão de metanol e heptano, o que provoca o rompimento das membranas por ruptura osmótica²⁶. Enquanto a devitellinização à base de metanol (popping de metanol) é eficaz e apropriada para muitas aplicações, a devitellinização manual (descascamento manual) oferece algumas vantagens significativas. Primeiro, o peeling manual permite escolher embriões precisamente estagiados para desviar e coletar, aumentando consideravelmente a probabilidade de obter embriões expandidos em uma orientação utilizável no final do experimento. Esse enriquecimento é fundamental ao estudar aspectos específicos de processos de desenvolvimento rápido (por exemplo, invaginação do mesoderma ou extensão convergente), para os quais embriões adequadamente estadiados podem representar apenas alguns por cento de todos os embriões, mesmo dentro de uma janela de coleta bem cronometrada. É claro que, para muitas aplicações, o estouro de metanol a granel mais tradicional de embriões a partir de uma janela de coleta cronometrada será suficiente, e a descasca manual pode não valer a pena o esforço extra. Em segundo lugar, a ligação de certos anticorpos e corantes primários é negativamente afetada pela exposição prévia da amostra ao metanol. Por esta razão, o peeling manual pode produzir aumentos significativos na qualidade do sinal de imunofluorescência em comparação com amostras com estalo de metanol, tornando-se uma técnica geral útil para biólogos de desenvolvimento de Drosophila .

Microscopia confocal de alta resolução em embriões expandidos de Drosophila de montagem total
Embora a realização de microscopia confocal de alta resolução em amostras expandidas seja conceitualmente a mesma que em amostras não expandidas, a ExM introduz alguns obstáculos técnicos. Notadamente, a orientação embrionária, que é aleatória, torna-se ainda mais importante à medida que o tamanho da amostra aumenta, pois as objetivas de alto aumento e alto NA só são capazes de focalizar a luz de regiões amostrais muito próximas da lamínula²⁷. Portanto, geralmente só é possível focar nas células na superfície do embrião ou perto dela que acabaram adjacentes à lamínula quando o gel foi formado. A melhor maneira de garantir que haja espécimes da orientação correta no final é iniciar o protocolo ExM com uma coleta rigorosamente estagiada de embriões fixos (por exemplo, usando descascamento manual) e semear muitos embriões em cada poço (>10). Para visualizar as células profundamente no interior do embrião, pode ser necessário utilizar equipamentos de imagem mais especializados, como a microscopia óptica²⁸. Além disso, descobrimos que a qualidade da imagem pode ser melhorada abrindo o orifício confocal para um tamanho maior do que uma unidade arejada. É claro que um aumento do tamanho do orifício virá ao custo da diminuição da resolução máxima, mas, na prática, mesmo pequenos aumentos no tamanho do orifício podem aumentar significativamente a intensidade do sinal (dados não mostrados). Estudos futuros devem abordar sistematicamente o tamanho do orifício e a resolução efetiva em amostras de MS.

Variações no ExM básico
O protocolo descrito aqui é um exemplo relativamente simples de ExM que deve funcionar para muitas aplicações e ser fácil de implementar na maioria dos laboratórios de biologia do desenvolvimento. No entanto, existem inúmeras variações no conceito básico de ExM ^4,5,7 que podem ser usadas para aumentar a intensidade do sinal^, alcançar graus ainda mais avançados de expansão e detectar moléculas de ácidos nucléicos e proteínas. Nesse protocolo, os embriões são incubados com anticorpos antes da gelificação e expansão. Alternativamente, as amostras podem ser tratadas com anticorpos após sua expansão ^6,30, o que pode aumentar a intensidade de sinal devido ao aumento da acessibilidade dos epítopos e à diminuição da perda de anticorpos ligados durante as etapas de expansão. Além disso, moléculas específicas de reticulantes podem ser usadas para ligar moléculas de RNA ao hidrogel para permitir a detecção de RNA em géis expandidos usando o método de reação em cadeia de hibridização³⁰. Finalmente, as amostras podem ser submetidas a múltiplas rodadas de expansão, como na microscopia de expansão iterativa (iExM)31, pan-ExM³² e revelação de expansão (ExR)³¹, para alcançar graus ainda mais altos de resolução aumentada.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Gostaríamos de agradecer à Dra. Jennifer Zallen por fornecer o anticorpo primário anti-Par-3 da cobaia. Este trabalho foi apoiado por generoso financiamento (1R15GM143729-01 e 1P20GM139768-01 5743) do National Institute of General Medical Science (NIGMS), um dos membros do National Institutes of Health (NIH), bem como do Arkansas Biosciences Institute (ABI), que forneceu financiamento parcial para a compra do nosso microscópio confocal.