Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

Qui viene presentato un protocollo per l'implementazione della microscopia ad espansione nei primi embrioni di Drosophila per ottenere immagini a super-risoluzione utilizzando un microscopio confocale convenzionale a scansione laser.

Il cavallo di battaglia della biologia dello sviluppo è il microscopio confocale, che consente ai ricercatori di determinare la localizzazione tridimensionale delle molecole marcate all'interno di campioni biologici complessi. Mentre i microscopi confocali tradizionali consentono di risolvere due sorgenti puntiformi fluorescenti adiacenti situate a poche centinaia di nanometri di distanza, l'osservazione dei dettagli più fini della biologia subcellulare richiede la capacità di risolvere segnali nell'ordine delle decine di nanometri. Sono stati sviluppati numerosi metodi basati su hardware per la microscopia a super-risoluzione per consentire ai ricercatori di aggirare tali limiti di risoluzione, sebbene questi metodi richiedano microscopi specializzati che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Un metodo alternativo per aumentare il potere risolutivo consiste nell'ingrandire isotropicamente il campione stesso attraverso un processo noto come microscopia ad espansione (ExM), che è stato descritto per la prima volta dal gruppo di Boyden nel 2015. L'ExM non è un tipo di microscopia di per sé , ma è piuttosto un metodo per gonfiare un campione preservando la relativa organizzazione spaziale delle molecole che lo costituiscono. Il campione espanso può quindi essere osservato con una risoluzione effettivamente maggiore utilizzando un microscopio confocale tradizionale. Qui, descriviamo un protocollo per l'implementazione di ExM in embrioni di Drosophila a montaggio intero, che viene utilizzato per esaminare la localizzazione di Par-3, miosina II e mitocondri all'interno delle cellule epiteliali di superficie. Questo protocollo produce un aumento di circa quattro volte della dimensione del campione, consentendo il rilevamento di dettagli subcellulari che non sono visibili con la microscopia confocale convenzionale. Come prova di principio, un anticorpo anti-GFP viene utilizzato per distinguere pool distinti di miosina-GFP tra cortecce cellulari adiacenti e la streptavidina marcata con fluorescenza viene utilizzata per rilevare molecole biotinilate endogene per rivelare i dettagli fini dell'architettura della rete mitocondriale. Questo protocollo utilizza anticorpi e reagenti comuni per la marcatura a fluorescenza e dovrebbe essere compatibile con molti protocolli di immunofluorescenza esistenti.

Nella biologia cellulare e dello sviluppo, vedere per credere, e la capacità di determinare con precisione i modelli di localizzazione delle proteine è fondamentale per molti tipi di esperimenti. La microscopia confocale a scansione laser è lo strumento standard per l'imaging di proteine marcate con fluorescenza in tre dimensioni all'interno di campioni intatti. I microscopi confocali convenzionali non sono in grado di distinguere (risolvere) i segnali fluorescenti adiacenti che sono separati da meno della metà della lunghezza d'onda della luce che emettono¹. In altre parole, due sorgenti puntiformi devono essere separate da almeno 200-300 nm in direzione laterale (500-700 nm in direzione assiale) per risolverle come due segnali distinti. Questa barriera tecnica è nota come limite di diffrazione, ed è un ostacolo fondamentale per lo studio di strutture subcellulari complesse (ad esempio, le reti citoscheletriche o mitocondriali dell'actomiosina) con caratteristiche spaziali al di sotto del limite di diffrazione. Pertanto, le tecniche per aumentare il potere risolutivo dei microscopi confocali convenzionali sono di interesse generale per la comunità biologica.

Per aggirare il limite di diffrazione, sono state sviluppate diverse tecnologie di microscopia a super-risoluzione che consentono una risoluzione dell'ordine di decine di nanometri o meno ^1,2,3, rivelando un mondo di complessità biologica che in precedenza era accessibile solo tramite microscopia elettronica. Nonostante gli ovvi vantaggi di questi metodi basati su hardware, i microscopi a super-risoluzione hanno spesso requisiti specifici per l'etichettatura dei campioni e lunghi tempi di acquisizione, limitando la loro flessibilità, o potrebbero semplicemente essere troppo costosi per alcuni laboratori. Un'alternativa alla super-risoluzione basata sul microscopio è la microscopia ad espansione (ExM), che non è un tipo di microscopia di per sé, ma è piuttosto un metodo per gonfiare un campione preservando l'organizzazione spaziale relativa delle molecole che lo costituiscono^. I campioni espansi isotropicamente possono quindi essere osservati con una risoluzione effettivamente aumentata utilizzando un microscopio confocale a fluorescenza tradizionale. ExM è stato descritto per la prima volta dal gruppo di Boyden nel 2015⁵ e da allora la tecnica di base è stata adattata per l'uso in una varietà di esperimenti ^6,7,8. ExM è stato anche adattato per l'uso in embrioni interi, in particolare in Drosophila 9,10,11, C. elegans¹² e zebrafish ^13, rendendolo un potente strumento per i biologi dello sviluppo.

ExM si basa su due diverse sostanze chimiche dell'idrogel: 1) idrogel di polielettrolita gonfiabili, che aumentano notevolmente di dimensioni quando vengono immersi in acqua¹⁴, e 2) idrogel di poliacrilammide, che hanno una spaziatura del polimero estremamente piccola per consentire l'espansione isotropa^{del campione 15}. Sebbene esistano molti protocolli ExM pubblicati, generalmente condividono le seguenti fasi: fissazione del campione, etichettatura, attivazione, gelificazione, digestione ed espansione⁴. Le condizioni di fissazione e le strategie di marcatura della fluorescenza variano ovviamente in base alle esigenze dell'esperimento e del sistema e, in alcuni protocolli, l'etichettatura avviene dopo l'espansione. Le molecole bersaglio nel campione devono essere innescate (attivate) per il legame con l'idrogel, che può essere ottenuto utilizzando diverse sostanze chimiche⁴. Durante le fasi di gelificazione, il campione viene saturo con monomeri del futuro idrogel (acrilato di sodio, acrilammide e bisacrilammide reticolante) e l'idrogel viene quindi formato mediante polimerizzazione di radicali liberi catalizzata da un iniziatore, come il persolfato di ammonio (APS), e da un acceleratore, come la tetrametilendiammina (TEMED)⁴. Dopo la gelificazione, il campione viene digerito enzimaticamente per omogeneizzare la resistenza del campione al rigonfiamento e garantire l'espansione isotropa dell'idrogel⁴. Infine, l'idrogel digerito viene posto in acqua, il che lo fa espandere fino a circa quattro volte la sua dimensione lineare originale⁴.

Figura 1: Panoramica della microscopia di espansione negli embrioni di Drosophila . ExM è un protocollo multi-step che richiede almeno 4 giorni per essere completato. La raccolta, la fissazione e la devitellinizzazione degli embrioni richiedono 1 giorno o più, a seconda che gli embrioni provenienti da più raccolte siano raggruppati. La marcatura in immunofluorescenza richiede 1 giorno o 2 giorni a seconda che gli embrioni vengano incubati durante la notte con gli anticorpi primari. L'attivazione, la gelificazione, la digestione e l'espansione dell'embrione possono essere eseguite in un solo giorno. I gel possono essere montati e sottoposti a imaging immediatamente dopo l'espansione, anche se per motivi pratici è spesso auspicabile iniziare l'imaging il giorno successivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo descrive come eseguire ExM su embrioni di Drosophila in stadio iniziale e intermedio¹⁶ per visualizzare i modelli di localizzazione delle proteine subcellulari a super-risoluzione (Figura 1). Questo metodo utilizza la chimica dell'estere N-idrossisuccinimidil dell'acido metilacrilico (MA-NHS) per attivare e ancorare le molecole proteiche all'idrogel¹⁷ ed è una modifica di un protocollo ExM precedentemente pubblicato per l'uso in embrioni e tessuti di Drosophila in fase avanzata¹¹. Questo protocollo utilizza pozzetti di polidimetilsilossano (PDMS) per modellare gli idrogel e facilitare lo scambio di soluzioni durante l'attivazione e la gelificazione. Un metodo alternativo che non richiede la creazione di pozzetti PDMS prevede l'abbassamento degli embrioni attaccati ai vetrini coprioggetti in gocce di soluzione monomerica che si trovano su un pezzo di pellicola sigillante da laboratorio²². Inoltre, questo protocollo descrive un metodo per rimuovere manualmente la membrana impermeabile vitellina che circonda gli embrioni di Drosophila , che è un prerequisito per la colorazione in immunofluorescenza. È importante sottolineare che questo metodo di peeling manuale degli embrioni può essere utilizzato per selezionare solo embrioni di Drosophila adeguatamente stadiati prima dell'etichettatura del campione, il che aumenta notevolmente la probabilità di ottenere campioni espansi dello stadio e dell'orientamento corretti e, quindi, rende la raccolta dei dati a valle molto più efficiente.

Questo protocollo segue le linee guida dell'Università dell'Arkansas (UARK) per la ricerca su animali invertebrati, come la Drosophila melanogaster, ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza dell'UARK (protocollo #20001).

1. Fissazione e devitellinizzazione dell'embrione di Drosophila

NOTA: La fase 1 descrive una procedura (peeling manuale) per la rimozione manuale della membrana vitellina, una membrana trasparente impermeabile che circonda l'embrione. È importante sottolineare che il peeling manuale consente la selezione di embrioni correttamente stadiati all'inizio del protocollo ExM, aumentando così notevolmente la probabilità di ottenere embrioni con un orientamento utilizzabile alla fine del protocollo ExM. Tuttavia, questo protocollo ExM è completamente compatibile con la raccolta di embrioni di massa e con le procedure standard per la rimozione della membrana vitellina a base di metanolo, nel qual caso si può passare direttamente alla fase 2 (marcatura in immunofluorescenza).

1. Prepara o acquista un certo numero di aghi di vetro fine. Le dimensioni effettive della punta dell'ago non sono critiche, ma assicurano che gli aghi siano rigidi e sufficientemente affilati da perforare le membrane vitelline degli embrioni fissati. Realizzare aghi da tubi capillari di vetro (diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,75 mm) utilizzando un estrattore per micropipette, come si preparerebbero gli aghi per le microiniezioni embrionali¹⁸; In alternativa, acquista aghi pre-tirati.
2. Raccogliere gli embrioni utilizzando le tecniche standard di Drosophila¹⁹ mettendo >100 Drosophila adulte in un bicchiere di plastica ventilato sigillato con una piastra di succo di frutta/agar²⁰. Utilizzare finestre di raccolta temporizzate per arricchire gli embrioni dello stadio¹⁶ corretto. Ad esempio, per arricchire per le fasi di gastrulazione (stadio 6) e di estensione convergente (stadio 7), cambiare la piastra del succo di frutta, raccogliere gli embrioni per 2 ore a 25 °C, quindi rimuovere la piastra e invecchiarla per altre 2 ore a 25 °C per ottenere embrioni di ~2-4 ore.
3. Per rimuovere il corion simile a un guscio d'uovo dagli embrioni, coprire la superficie dei piatti di succo di frutta con candeggina al 50% (Tabella 1), staccare gli embrioni dalla superficie dell'agar agitandoli con un piccolo pennello e attendere 3 minuti affinché il corion si sciolga.
4. Trasferire gli embrioni decoroniati con un pennello in una fiala di scintillazione da 30 mL contenente 4 mL di eptano (fase superiore organica) e 4 mL di tampone di fissazione (fase inferiore acquosa; Tabella 1). Diluire la formaldeide appena preparata da un brodo appena preparato o aperto di recente e mescolare con PBS 10x e acqua deionizzata immediatamente prima di aggiungere gli embrioni.
   NOTA: Preparare la formaldeide dal potere della paraformaldeide o dalla formaldeide di grado EM al 16% in fiale di vetro. È possibile utilizzare scorte di formaldeide concentrata (ad esempio, formaldeide al 37%), anche se i risultati possono essere meno coerenti.
5. Gli embrioni si accumuleranno all'interfaccia tra la fase organica e quella acquosa. Aggiungi tanti embrioni quanti formeranno un singolo strato all'interfaccia. Se vengono aggiunti troppi embrioni a una fiala, non si risolveranno bene.
6. Usando del nastro adesivo, immobilizzare le fiale di scintillazione sui lati su uno shaker da tavolo e agitarle per 20 minuti a 220 giri/min. Per una fissazione ottimale, mantenere un'emulsione vigorosa tra la fase organica e quella acquosa durante l'intera fissazione.
7. Durante il tempo di fissazione, preparare uno dei seguenti per ciascuno dei campioni.
   1. Prendi una base di plastica per piastre di Petri di 6 cm riempita a metà con agar al 3% e incidi un rettangolo di ~5 cm x 3 cm nell'agar con una lama di rasoio o un bisturi. A questo scopo possono essere utilizzati anche piatti di succo di frutta/agar.
   2. Usando una piccola spatola da laboratorio, rimuovere la lastra di agar. Capovolgere la base della capsula di Petri e posizionarla sul banco. Posizionare la lastra di agar sopra la piastra capovolta (Figura 2A).
   3. Prendi il coperchio della capsula di Petri e assicurati che sia asciutto. Indossando i guanti, posizionare un pezzo di nastro biadesivo all'interno del coperchio (il pezzo di nastro dovrebbe essere leggermente più grande della lastra di agar; Figura 2B).
8. Rimuovere i flaconcini dallo shaker, posizionarli in posizione verticale sul banco e lasciare che le fasi organiche e acquose si separino. Gli embrioni correttamente fissati rimarranno all'interfaccia tra le due fasi.
9. Trasferire gli embrioni fissati sulla lastra di agar utilizzando una pipetta di vetro Pasteur dotata di un bulbo di lattice. Per evitare che gli embrioni aderiscano all'interno della pipetta, cerca di mantenere gli embrioni all'interno del collo stretto della pipetta e trasferisci gli embrioni in più piccoli lotti piuttosto che tutti in una volta. Una volta che tutti gli embrioni sono sulla lastra di agar, rimuovere la maggior parte dell'eptano residuo intorno agli embrioni utilizzando un pipettatore P200. Eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile (<3 min) per evitare che gli embrioni fissi si secchino, il che può influire negativamente sulla morfologia.
10. Da un'altezza di ~2 cm, far cadere il coperchio con il nastro biadesivo sulla lastra di agar per far aderire gli embrioni al nastro (Figura 2C). Rimuovere delicatamente il coperchio dalla lastra di agar, posizionarlo capovolto sul banco, quindi aggiungere una quantità sufficiente di PBS-Tween (Tabella 1) per coprire gli embrioni nel coperchio.
11. Utilizzando uno stereomicroscopio da dissezione a circa 100x di ingrandimento con illuminazione indiretta, identificare gli embrioni correttamente stadiati utilizzando marcatori morfologici. Per gli embrioni allo stadio 6, utilizzare marcatori come un solco cefalico visibile e un mesoderma invaginato; Per gli embrioni allo stadio 7, utilizzare marcatori come una banda germinale estesa; Per gli embrioni allo stadio 11, utilizzare marcatori come un germorbo completamente esteso e una segmentazione visibile lungo l'asse testa-coda¹⁶.
    1. Per raccogliere gli embrioni desiderati, pungere prima la membrana vitellina (una membrana ovale trasparente intorno all'embrione) vicino all'estremità anteriore o posteriore dell'embrione con un ago di vetro sottile; La membrana si sgonfierà un po' man mano che la pressione si rilascia. Quindi, utilizzando una pinza sottile o una sonda metallica, spingere delicatamente l'embrione dall'altra estremità attraverso il foro; La membrana vitellina rimarrà aderente al nastro biadesivo. Lasciare gli embrioni indesiderati attaccati al nastro.
12. Raccogliere periodicamente gli embrioni devitellinizzati galleggianti con una pipetta di vetro Pasteur e spostarli in una provetta da microfuge da 1,5 mL.
13. A questo punto, eseguire una delle seguenti operazioni.
    1. Passare direttamente alle fasi di etichettatura dell'immunofluorescenza. Gli embrioni devitellinizzati possono andare direttamente nella soluzione bloccante (fase 2.2). Non lasciare che gli embrioni rimangano in PBS-Tween o nella soluzione bloccante (Tabella 1) per più di 16 ore prima di procedere alla fase successiva.
    2. Spostare gli embrioni nel metanolo per la conservazione. Rimuovere la maggior quantità possibile di PBS-Tween, quindi aggiungere 1 mL di metanolo. Una volta che gli embrioni si sono insediati, rimuovere quanto più metanolo possibile e aggiungere 1 ml di metanolo fresco. Conservare gli embrioni a -20 °C a tempo indeterminato. La conservazione del metanolo consente anche di raggruppare embrioni provenienti da più collezioni.

2. Marcatura a immunofluorescenza

NOTA: A parte le fasi di incubazione degli anticorpi, le quantità e i tempi esatti di liquido non sono critici in questa sezione. Per eseguire un risciacquo o un lavaggio, lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo della provetta, rimuovere quanto più liquido possibile senza aspirare gli embrioni, quindi aggiungere ~1 mL di nuovo liquido; utilizzare una pipetta Pasteur in vetro dotata di un bulbo in lattice per una chiarezza e un controllo ottimali. Per la fase di risciacquo, gli embrioni non vengono cullati, ma solo lasciati depositare; Per la fase di lavaggio, gli embrioni vengono fatti dondolare su un nutator per il tempo indicato e poi lasciati decantare.

1. Se gli embrioni non sono stati conservati nel metanolo, procedere al passaggio 2.2. Se gli embrioni sono stati conservati in metanolo, risciacquare due volte con PBS-Tween, quindi lavare per 20 minuti due volte con PBS-Tween.
2. Lavare gli embrioni per 30-60 minuti in 1 ml di soluzione bloccante.
3. Incubare gli embrioni con anticorpi primari diluiti in soluzione anticorpale (Tabella 1) per 2 ore a temperatura ambiente o preferibilmente per una notte a 4 °C. Eseguire questo passaggio nel volume più piccolo possibile (50-300 μL) per conservare gli anticorpi primari; Il dondolo su un nutator non è strettamente necessario.
   1. Aumentare la quantità di anticorpo primario utilizzato in un tipico esperimento di immunofluorescenza di almeno il 50% per ExM. Utilizzare le seguenti concentrazioni di anticorpi primari: 1:200 per il policlonale²¹ anti-Por-3 e 1:100 per il policlonale di coniglio anti-GFP.
4. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria (conservare a 4 °C se lo si desidera), risciacquare due volte con PBS-Tween, quindi lavare per 15 minuti quattro volte con PBS-Tween.
5. Incubare gli embrioni con anticorpi secondari fluorescenti in un volume finale di 300 μL (diluito in soluzione anticorpale) per 1 ora a temperatura ambiente su un nutator. Durante questa fase è possibile aggiungere streptavidina marcata con fluorescenza. Da questa fase in poi, quando possibile, proteggere gli embrioni da un'esposizione eccessiva e prolungata alla luce, ad esempio coprendo le provette con un coperchio opaco o conservando i campioni in un cassetto.
   1. Utilizzare le seguenti concentrazioni: 1:500 per policlonali di capra IgG anti-coniglio fusi con Alexa Fluor 488; 1:500 per il policlonale di capra IgG anti-cavia fuso con Alexa Fluor 568; e 1:1000 per streptavidina-Alexa Fluor 488.
6. Rimuovere e smaltire la soluzione anticorpale secondaria. Sciacquare gli embrioni due volte con PBS-Tween e lavare per 15 minuti quattro volte con PBS-Tween.
7. A questo punto, gli embrioni possono essere conservati a 4 °C al buio, ma processano i campioni il più rapidamente possibile (<24 h).

3. Preparazione dei pozzetti PDMS

NOTA: I pozzetti PDMS possono essere realizzati fino a 2 settimane in anticipo.

1. Impostare un'incubatrice o una piastra riscaldante a 55 °C e impostare una centrifuga in grado di far girare provette coniche a 15 °C.
2. Per preparare la soluzione PDMS (Tabella 1), posizionare una provetta conica da 50 mL in un contenitore secondario su una bilancia e aggiungere 10 g di base di elastomero siliconico alla provetta utilizzando una siringa. Quindi, aggiungere 1 g di indurente in elastomero siliconico e capovolgere più volte la provetta per mescolare.
3. Creare un tubo di bilanciamento aggiungendo una quantità adeguata di acqua a un secondo tubo conico da 50 mL. Centrifugare la soluzione PDMS a 500 x g per 3 minuti a 15 °C, quindi versarla in una capsula di Petri da 10 cm a una profondità di ~1 mm. Se necessario, rimuovere le bolle soffiando delicatamente sulla soluzione con un tubo dell'aria. Lasciare solidificare la soluzione PDMS per una notte a 55 °C.
4. Una volta che la lastra PDMS è solidificata, utilizzando un bisturi, incidete aree quadrate leggermente più piccole di un vetrino coprioggetto di 22 mm x 22 mm. All'interno di ogni quadrato, incidere e rimuovere un pozzetto quadrato largo ~8 mm.
5. Trasferire ogni pozzetto PDMS quadrato su un vetrino coprioggetti da 22 mm x 22 mm e farlo aderire saldamente (Figura 2D). La preparazione di sei o più vetrini coprioggetti dovrebbe produrre un buon numero di embrioni espansi da immaginare.

4. Adesione degli embrioni ai vetrini coprioggetti

1. Applicare una quantità sufficiente di poli-L-lisina allo 0,1% per coprire la superficie del vetrino coprioggetto all'interno di ciascun pozzetto (~50 μL) e metterli in un incubatore a 55 °C per farli asciugare all'aria. Ripetere questo passaggio per aumentare l'adesività.
2. Sciacquare brevemente gli embrioni una volta ogni 1x PBS per rimuovere il detersivo Tween, quindi trasferire >10 embrioni in ciascuno dei pozzetti rivestiti di poli-L-lisina.
3. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo dei pozzetti. Rimuovere il liquido in eccesso dagli embrioni aderenti utilizzando una pipetta Pasteur. Procedere immediatamente al passaggio successivo.

5. Attivazione e gelificazione

NOTA: L'attivazione si riferisce all'aggiunta di MA-NHS agli embrioni, che modificherà le proteine e gli anticorpi del campione in modo che possano legarsi all'idrogel. La gelificazione si riferisce alla generazione di un idrogel all'interno e intorno agli embrioni in ciascun pozzetto. Durante la gelificazione, gli embrioni vengono permeati con una soluzione di monomero e poi trattati con una soluzione di gelificazione per formare l'idrogel.

1. Attivare gli embrioni per 1 ora a temperatura ambiente riempiendo i pozzetti con la soluzione di attivazione (1 mM MA-NHS appena diluito in 1x PBS; Tabella 1). Cambiare questa soluzione ogni 10 minuti circa nel corso di 1 ora.
2. Sciacquare gli embrioni con 1x PBS tre volte. Incubare gli embrioni in soluzione di monomero (Tabella 1) per 45 minuti a 4 °C.
3. Mentre gli embrioni sono immersi nella soluzione di monomero, preparare la soluzione di gelificazione (Tabella 1). La preparazione di ~2 mL di soluzione di gelificazione è sufficiente per coprire i pozzetti PDMS da un'intera capsula di Petri da 10 cm. Assicurati di aggiungere l'APS per ultimo, poiché avvierà la polimerizzazione e inizierà la gelificazione.
   1. Diluire l'ossidante catalitico appena prelevato dalla polvere (ad es. 1% TEMPO p/v in acqua). Combinare 1.960 μL di soluzione di monomero con 30 μL di TEMED al 10% e 10 μL di TEMPO all'1%.
   2. Per evitare di polimerizzare l'intero lotto di soluzione di gelificazione in una sola volta, lavorare in piccoli lotti. Dividere la soluzione di gelificazione (senza APS) in aliquote da 125 μL tra le otto provette di una striscia PCR.
   3. Rimuovere la soluzione di monomero dai tre pozzetti PDMS utilizzando un vuoto, facendo attenzione a non distruggere gli embrioni. Aggiungere 5 μL di APS a una delle provette PCR contenenti la soluzione di gelificazione per avviare la polimerizzazione. Distribuire rapidamente la soluzione di gelificazione polimerizzante tra i pozzetti (~40 μL per pozzetto). Ripetere l'operazione fino a coprire tutti i pozzetti e gli embrioni.
4. Lasciare gelificare i campioni per 1,5-2,5 ore a 37 °C. Agitare gli idrogel di tanto in tanto per monitorare la polimerizzazione. Gli idrogel solidificati non si muovono. Gli idrogel più densi impiegheranno più tempo per completare la polimerizzazione e solidificare.

6. Digestione ed espansione

NOTA: I gel più spessi e più grandi impiegheranno più tempo ad espandersi e il centro dei gel potrebbe impiegare diverse ore per espandersi completamente; Questo può essere accelerato tagliando i bordi del gel. Man mano che i gel si espandono, il loro indice di rifrazione diventerà quasi identico a quello dell'acqua e diventeranno molto difficili da vedere.

1. Al termine della gelificazione, staccare i pozzetti PDMS dal vetrino coprioggetto cercando di non disturbare gli idrogel. Tagliare via il materiale idrogel in eccesso, se lo si desidera.
2. Trasferire gli idrogel (ancora attaccati ai vetrini coprioggetti) singolarmente nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti (Figura 2E). Si noti che gli idrogel possono espandersi leggermente durante la digestione.
3. Coprire completamente i gel con tampone digestivo (Tabella 1) per 1 ora a 37 °C. In generale, 30 ml di tampone di digestione sono sufficienti per coprire i gel in una piastra a 6 pozzetti.
4. Dopo la digestione, trasferire ogni idrogel singolarmente in una capsula di Petri da 6 cm facendoli scivolare fuori dal vetrino coprioggetti. Potrebbe essere necessario utilizzare un secondo vetrino coprioggetto per rimuovere il gel. Riempi ogni capsula di Petri con acqua deionizzata per espandere il gel. Cambiare l'acqua tre o quattro volte nel corso di 1-2 ore fino a quando i gel non sono completamente espansi (aspettarsi un aumento di circa quattro volte della larghezza).

7. Montaggio e imaging

NOTA: Gli idrogel espansi sono composti quasi interamente da acqua, il che li rende quasi trasparenti ed estremamente fragili. I gel possono essere manipolati utilizzando lunghi vetrini coprioggetti per spostarli e raccoglierli. Monta e visualizza solo uno o due gel alla volta, poiché i gel rilasceranno gradualmente acqua e inizieranno a scivolare intorno al vetrino coprioggetti.

1. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere quanta più acqua in eccesso possibile dalla capsula di Petri per ridurre al minimo il movimento dei gel durante la manipolazione.
2. Manovrare ogni gel espanso, con gli embrioni sulla superficie inferiore, su un vetrino coprioggetto di grandi dimensioni (ad esempio, 24 mm x 40 mm) per l'imaging.
3. Montare ogni vetrino coprioggetto con gel sull'obiettivo di un microscopio confocale a scansione laser invertita. Individua i campioni correttamente posizionati e orientati utilizzando le modalità di microscopia a epifluorescenza o in campo chiaro sul microscopio con obiettivi aerei a basso ingrandimento (5x o 10x) o a medio ingrandimento (20x).
4. Per ottenere immagini ad alta risoluzione, passare a un obiettivo a immersione in olio o acqua ad alto ingrandimento (60x, 63x o 100x). Per poter essere ripresi, la superficie degli embrioni deve trovarsi all'interno dell'intervallo di messa a fuoco dell'obiettivo (<300 μm dal vetrino coprioggetto per un obiettivo 63x).
5. Raccogli i dati dai campioni utilizzando la modalità confocale a scansione laser sul microscopio. Assicurarsi di raccogliere immagini non sature con una buona gamma dinamica e utilizzare un numero appropriato di pixel per immagine per acquisire il massimo delle informazioni possibili sul campione²³.

Figura 2: Devitellinizzazione manuale e lavoro con idrogel . (A) Taglio di una lastra di agar da una piastra di agar/succo di frutta. (B) Posizionamento di nastro biadesivo all'interno del coperchio di una capsula di Petri da 6 cm. (C) Adesione degli embrioni al coperchio nastrato. (D) Una lastra PDMS con un pozzetto quadrato aderente a un vetrino coprioggetto di 22 mm x 22 mm. (E) Vetrino coprioggetto con un pozzetto PDMS all'interno di una piastra a 6 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per caratterizzare l'efficacia generale di ExM negli embrioni di Drosophila a montaggio intero, la lunghezza dell'embrione lungo l'asse testa-coda è stata misurata negli embrioni di controllo non espansi rispetto agli embrioni espansi (Figura 3A-C). Gli embrioni di controllo non espansi sono stati sottoposti alle stesse condizioni di fissazione e alle stesse fasi di marcatura dell'immunofluorescenza degli embrioni espansi, tranne per il fatto che sono stati montati utilizzando un mezzo di montaggio solidificato prima dell'imaging. I singoli embrioni non espansi coprivano circa la metà di un campo visivo quando si utilizzava un obiettivo 10x (Figura 3A). Al contrario, gli embrioni espansi coprivano approssimativamente due campi visivi completi quando si utilizzava lo stesso obiettivo 10x (Figura 3B). Per valutare come il grado di espansione variasse sia all'interno che tra gli esperimenti, lo stesso protocollo ExM è stato eseguito in tre diverse occasioni e la lunghezza dell'embrione è stata misurata in tre diversi gel all'interno di ogni singolo esperimento. La lunghezza media dalla testa alla coda degli embrioni di controllo non espansi era di 398,8 μm (deviazione standard [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figura 3C). Per l'esperimento 1, l'esperimento 2 e l'esperimento 3, la lunghezza media degli embrioni era rispettivamente di 1.596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) e 1.954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), che rappresentano fattori di espansione rispettivamente di 4,0 volte, 4,7 volte e 4,9 volte (Figura 3C). La variazione intra-sperimentale tra i gel era molto meno evidente rispetto alla variazione inter-sperimentale, che era di circa il 20% (Figura 3C). Per valutare gli effetti di ExM sulla morfologia delle cellule e degli embrioni, è stato utilizzato un anticorpo contro il componente della giunzione aderente Par-3 (Bazooka)21 per marcare le membrane cellulari apicali e abbiamo analizzato i segmenti della bocca in via di sviluppo degli embrioni di Drosophila in stadio ¹¹, uno stadio con una struttura segmentata complessa (Figura 3D-F). Nel campione di controllo, le cellule del segmento mascellare avevano una larghezza media di 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figura 3D,F). Nei campioni espansi ripresi utilizzando lo stesso obiettivo 40x e lo stesso fattore di zoom (1x), le cellule nel segmento mascellare avevano una larghezza media di 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figura 3E,F), che rappresenta un'espansione di 4,0 volte. Pertanto, coerentemente con i precedenti rapporti¹¹, siamo stati in grado di espandere gli embrioni di Drosophila a montaggio intero di circa quattro volte in dimensioni lineari utilizzando ExM senza lacerazione del campione o evidenti distorsioni nella morfologia cellulare o tissutale.

Figura 3: Espansione quadruplicata degli embrioni di Drosophila. (A) Embrioni di Drosophila non espansi e (B) espansi ripresi utilizzando un obiettivo 10x (0,3 NA) con zoom 1x. I singoli campi visivi (FOV) sono indicati con linee tratteggiate. Gli embrioni esprimevano una versione marcata con GFP della catena leggera della miosina e sono stati colorati con un anticorpo anti-GFP. (C) Quantificazione della lunghezza dell'embrione (lungo l'asse testa-coda) in tre idrogel per esperimento e da tre esperimenti ExM separati rispetto ai controlli non espansi. (D,E) Segmenti mascellari di embrioni di Drosophila in stadio 11 non espansi e (E) espansi ripresi utilizzando un obiettivo 40x (1,3 NA) con zoom 1x. I contorni cellulari (giunzioni aderenti) sono stati rilevati con un anticorpo anti Par-3/Bazooka (bianco). (F) Quantificazione della larghezza della cella (asse lungo) da gruppi equivalenti di cellule di (D) e (E). I box plot in (C) e (F) mostrano gli intervalli del 25°, 50° e 75° percentile; i baffi indicano i valori minimo e massimo; I simboli "+" indicano la media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per dimostrare che ExM può essere utilizzato per risolvere i dettagli subcellulari al di sotto del tipico limite di diffrazione, il citoscheletro dell'actomiosina è stato visualizzato in controllo non espanso rispetto agli embrioni espansi sottoposti a estensione convergente (stadio 7). Gli eventi di rimodellamento tissutale della gastrulazione e dell'estensione convergente sono in gran parte controllati da cambiamenti nella localizzazione della proteina motoria miosina II²⁴. Tuttavia, nell'epitelio colonnare densamente impacchettato del primo ectoderma di Drosophila , è difficile osservare molti dettagli fini del modello di localizzazione della miosina II, anche quando viene ripreso con un ingrandimento di 158x (obiettivo 63x con uno zoom ottico 2,5x), un tipico potere risolutivo massimo per un microscopio confocale a scansione laser. Ad esempio, poiché la miosina II è una proteina corticale (situata direttamente sotto la membrana plasmatica), i pool di miosina II²⁵ situati su entrambi i lati dei contatti cellula-cellula non erano risolvibili negli embrioni allo stadio 7 e apparivano come un'unica linea in cui le cellule vicine si incontravano (Figura 4A). Al contrario, negli embrioni in stadio 7 espanso, è stato possibile osservare linee parallele di miosina II alle giunzioni cellula-cellula, che rappresentano pool proteici corticali nelle cellule adiacenti (Figura 4B). La distanza tra le linee parallele della miosina II nei campioni espansi è stata di 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); se diviso per quattro, questo produce una distanza prevista di ~220 nm tra le linee di miosina nelle cellule adiacenti in embrioni non espansi, che è effettivamente appena al di sotto del limite di diffrazione per un segnale rilevato con Alexa 488 (emissione di picco di ~520 nm/2 = 260 nm).

Inoltre, abbiamo anche testato se ExM potesse essere utilizzato per risolvere l'architettura della rete mitocondriale in cellule densamente impacchettate di embrioni di Drosophila gastrulanti (stadio 6). La funzione mitocondriale è strettamente legata alla struttura della rete (cioè organelli fusi e frammentati), ma i dettagli dell'organizzazione della rete mitocondriale sono difficili da visualizzare utilizzando la microscopia confocale convenzionale in tipi di cellule che non sono piatte e/o sottili. I mitocondri sono naturalmente ricchi di molecole biotinilate e, quindi, i mitocondri possono essere marcati nell'embrione precoce di Drosophila utilizzando la streptavidina²⁶ marcata in modo fluorescente. Negli embrioni non espansi in stadio 6 marcati con streptavidina-Alexa 488, il segnale è apparso come punti citoplasmatici spesso sovrapposti e difficili da risolvere (Figura 4C). Al contrario, negli embrioni in stadio 6 espanso, erano visibili molti più dettagli fini della rete mitocondriale e i punti erano più facilmente risolvibili (Figura 4D)^26,27. Questi risultati indicano che ExM può essere utilizzato per studiare l'organizzazione della rete mitocondriale in tipi di cellule non tradizionalmente adatte all'analisi mitocondriale.

Figura 4: Dettagli del citoscheletro dell'actomiosina e dei mitocondri rivelati dalla microscopia ad espansione. (A,B) Localizzazione della miosina II in cellule di neuroectoderma (banda germinale) visualizzate con un obiettivo 63x (1,4 NA) con zoom 2,5x in embrioni non espansi di stadio 7 (A) e (B) espansi. La miosina II è stata rilevata negli embrioni che esprimono una versione transgenica marcata con GFP della catena leggera regolatoria della miosina II (sqh-GFP), che è stata rilevata con un anticorpo anti-GFP (rosso). Pool distinti di miosina corticale situati nelle cellule adiacenti possono essere risolti nell'embrione espanso (frecce bianche). (C,D) Reti mitocondriali in cellule di neuroectoderma visualizzate con un obiettivo 63× (1,4 NA) con zoom 2,5x in embrioni non espansi (C) ed espansi (D) allo stadio 6. I mitocondri sono stati rilevati con streptavidina-Alexa 488 (verde) e i contorni cellulari sono stati rilevati con un anticorpo anti-Par-3/Bazooka (magenta). Gli esperimenti sono stati eseguiti con un microscopio confocale a scansione laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricette di soluzione. Composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo in ordine di apparizione. Tutte le scorte sono liquide, salvo diversa indicazione. Le sostanze chimiche sono state risospese o diluite in acqua filtrata in autoclave, salvo diversa indicazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Devitellinizzazione manuale
La maggior parte dei protocolli di fissazione embrionale di Drosophila prevede la rimozione della membrana vitellina scuotendo gli embrioni fissati in un'emulsione di metanolo ed eptano, che provoca lo scoppio delle membrane attraverso la rottura osmotica²⁶. Mentre la devitellinizzazione a base di metanolo (metanolo popping) è efficace e appropriata per molte applicazioni, la devitellinizzazione manuale (peeling manuale) offre alcuni vantaggi significativi. In primo luogo, il peeling manuale consente di scegliere embrioni in stadi precisi da devitellinizzare e raccogliere, aumentando notevolmente la probabilità di ottenere embrioni espansi in un orientamento utilizzabile alla fine dell'esperimento. Questo arricchimento è fondamentale quando si studiano aspetti specifici di processi di sviluppo rapidi (ad esempio, l'invaginazione del mesoderma o l'estensione convergente), per i quali gli embrioni stadiati in modo appropriato possono rappresentare solo una piccola percentuale di tutti gli embrioni, anche all'interno di una finestra di raccolta strettamente temporizzata. Naturalmente, per molte applicazioni, sarà sufficiente il più tradizionale spuntamento di metanolo di embrioni da una finestra di raccolta temporizzata, e il peeling manuale potrebbe non valere lo sforzo aggiuntivo. In secondo luogo, il legame di alcuni anticorpi e coloranti primari è influenzato negativamente dalla precedente esposizione del campione al metanolo. Per questo motivo, il peeling manuale può produrre aumenti significativi della qualità del segnale di immunofluorescenza rispetto ai campioni con metanolo, rendendolo una tecnica generale utile per i biologi dello sviluppo della Drosophila .

Microscopia confocale ad alta risoluzione in embrioni di Drosophila espansi a montaggio intero
Mentre l'esecuzione della microscopia confocale ad alta risoluzione su campioni espansi è concettualmente la stessa di quella su campioni non espansi, ExM introduce alcuni ostacoli tecnici. In particolare, l'orientamento dell'embrione, che è casuale, diventa ancora più importante con l'aumentare della dimensione del campione, perché gli obiettivi ad alto ingrandimento e ad alto NA sono in grado di focalizzare la luce solo dalle regioni del campione che sono molto vicine al vetrino coprioggetto²⁷. Pertanto, di solito è possibile concentrarsi solo sulle cellule in corrispondenza o vicino alla superficie dell'embrione che sono finite adiacenti al vetrino coprioggetto quando si è formato il gel. Il modo migliore per assicurarsi che ci siano campioni con l'orientamento corretto alla fine è quello di iniziare il protocollo ExM con una raccolta di embrioni fissi in fasi fitte (ad esempio, utilizzando il peeling manuale) e di seminare molti embrioni in ogni pozzetto (>10). Per visualizzare le cellule in profondità all'interno dell'embrione, potrebbe essere necessario utilizzare configurazioni di imaging più specializzate, come la microscopia a foglio di luce²⁸. Inoltre, troviamo che la qualità dell'immagine può essere migliorata aprendo il foro stenopeico confocale a una dimensione maggiore di un'unità airy. Naturalmente, un aumento delle dimensioni del foro stenopeico avrà il costo di una diminuzione della risoluzione massima, ma in pratica, anche piccoli aumenti della dimensione del foro stenopeico possono aumentare significativamente l'intensità del segnale (dati non mostrati). Gli studi futuri dovrebbero affrontare sistematicamente la dimensione del foro stenopeico e la risoluzione effettiva nei campioni ExM.

Variazioni sull'ExM di base
Il protocollo qui descritto è un esempio relativamente semplice di ExM che dovrebbe funzionare per molte applicazioni ed essere facile da implementare nella maggior parte dei laboratori di biologia dello sviluppo. Tuttavia, ci sono numerose variazioni sul concetto di base di ExM ^4,5,7 che possono essere utilizzate per aumentare l'intensità del segnale, raggiungere ulteriori gradi di espansione e rilevare molecole di acido nucleico e proteine. In questo protocollo, gli embrioni vengono incubati con anticorpi prima della gelificazione e dell'espansione. In alternativa, i campioni possono essere trattati con anticorpi dopo essere stati espansi ^6,30, il che può aumentare l'intensità del segnale a causa della maggiore accessibilità dell'epitopo e della diminuzione della perdita di anticorpi legati durante le fasi di espansione. Inoltre, specifiche molecole reticolanti possono essere utilizzate per legare molecole di RNA all'idrogel per consentire la rilevazione di RNA in gel espansi utilizzando il metodo della reazione a catena di ibridazione³⁰. Infine, i campioni possono essere sottoposti a cicli multipli di espansione, come nella microscopia ad espansione iterativa (iExM)31, pan-ExM³² e nella rivelazione di espansione (ExR)³¹, per ottenere gradi ancora più elevati di maggiore risoluzione.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Vorremmo ringraziare la dottoressa Jennifer Zallen per aver fornito l'anticorpo primario anti-Par-3 per porcellini d'India. Questo lavoro è stato sostenuto da un generoso finanziamento (1R15GM143729-01 e 1P20GM139768-01 5743) del National Institute of General Medical Science (NIGMS), uno dei membri del National Institutes of Health (NIH), nonché dell'Arkansas Biosciences Institute (ABI), che ha fornito finanziamenti parziali per l'acquisto del nostro microscopio confocale.