Инновационная вставка, напечатанная на 3D-принтере, предназначена для простого 2D- и 3D-культивирования клеток

В этой статье недавно разработанный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, представлен в качестве модели совместной культуры и подтвержден путем изучения паракринной межклеточной связи между эндотелиальными клетками и кератиноцитами.

Классический анализ непрямой коммуникации между различными типами клеток обуславливает необходимость использования кондиционированных сред. Более того, производство кондиционированных сред остается трудоемким и далеким от физиологических и патологических состояний. Несмотря на то, что несколько моделей кокультивирования коммерчески доступны, они по-прежнему ограничены специфическими анализами и в основном предназначены для двух типов клеток.

Здесь используются напечатанные на 3D-принтере вставки, совместимые с многочисленными функциональными анализами. Вкладыш позволяет разделить одну лунку 6-луночной пластины на четыре отсека. Можно установить широкий спектр комбинаций. Кроме того, в каждой стенке компартментов спроектированы окна таким образом, чтобы потенциальная межклеточная коммуникация между каждым компартментом была возможна в питательной среде в зависимости от объема. Например, паракринная межклеточная коммуникация может быть изучена между четырьмя типами клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или путем объединения обоих. Кроме того, в один и тот же отсек можно поместить различные типы клеток в формате 2D или 3D (органоиды). Отсутствие дна во вставках, напечатанных на 3D-принтере, позволяет использовать обычные условия культивирования на пластине, возможное нанесение покрытия на пластину, содержащую вкладыш, и прямую визуализацию с помощью оптической микроскопии. Наличие нескольких компартментов дает возможность собирать различные типы клеток независимо друг от друга или использовать в каждом компартменте разные реагенты для экстракции РНК или белка. В данном исследовании представлена подробная методология использования нового вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, в качестве системы совместного культивирования. Чтобы продемонстрировать некоторые возможности этой гибкой и простой модели, ранее опубликованные функциональные тесты клеточной коммуникации были выполнены в новых 3D-печатных вставках и продемонстрировали свою воспроизводимость. Напечатанные на 3D-принтере вставки и традиционная клеточная культура с использованием кондиционированных сред привели к аналогичным результатам. В заключение, напечатанная на 3D-принтере вставка, представляет собой простое устройство, которое может быть адаптировано к многочисленным моделям кокультур с адгезивными типами клеток.

In vivo клетки общаются друг с другом либо напрямую (контакт с клетками), либо опосредованно (путем секреции молекул). Для изучения клеточной коммуникации могут быть разработаны различные модели кокультур, такие как прямая кокультура (различные типы клеток находятся в прямом взаимодействии в одном и том же колодце) и компартментализированная кокультура (различные типы клеток находятся в непрямом взаимодействии в разных компартментах культуральной системы)¹. Кроме того, кондиционированные среды могут быть использованы для систем совместного культивирования, где непрямое взаимодействие обеспечивается за счет того, что секретируемые молекулы, содержащиеся в кондиционированных средах эффекторного типа клеток, переносятся в клетку-ответчик^{типа 1}.

В случае исследований паракринной клеточной коммуникации непрямые системы кокультур предоставляют модели, которые в полной мере отражают клеточные взаимодействия in vivo. Были разработаны и коммерциализированы системы косвенного совместного культивирования, позволившие создать модели косвенной кокультуры ^2,3. К сожалению, большинство косвенных систем совместного культивирования предусматривают только два отсека. Другие системы косвенного совместного культивирования предусматривают несколько компартментов, но они менее масштабируемы по сравнению с системой, представленной в настоящей рукописи. Некоторые из них не позволяют провести классическую визуализацию под микроскопом, и в них часто представлены специфические методы нанесения. В нескольких исследованиях паракринная связь между различными типами клеток исследуется с помощью модели^{условной} среды 4,5,6,7. Это более простой способ исследования по сравнению с системами косвенной совместной культуры, поскольку он не требует установления конкретных методов или материалов¹. С другой стороны, приготовление кондиционированных сред занимает много времени и позволяет получить информацию только об односторонней клеточной сигнализации (от эффектора к ответителю)¹.

В данной работе предложен новый, простой способ исследования клеточной коммуникации. Позволяя комбинировать несколько типов клеток в прямом или косвенном взаимодействии, а также в 2D или 3D форматах, напечатанные вставки предоставляют множество преимуществ для простой настройки моделей совместного культивирования. Напечатанная на 3D-принтере вставка, адаптированная для установки в лунки 6-луночных планшетов, имеет круглую форму и позволяет разделить лунку на четыре отсека (два больших и два маленьких; Рисунок 1А). Напечатанные на 3D-принтере вставки характеризуются отсутствием дна. Таким образом, ячейки находятся в непосредственном контакте с пластиной, на которую ставится вкладыш. Кроме того, каждый отсек может быть покрыт независимо от других. Кроме того, поведение клеток можно легко проследить под оптическими микроскопами. Наличие коммуникационных окон в каждой стенке вставки позволяет добавлять в оптимальное время общую среду для проведения различных экспериментов по со-культуре. Для изучения прямой и/или косвенной связи между несколькими типами клеток могут быть выполнены многочисленные комбинации кокультивирования. Например, может быть спроектирована модель непрямой кокультуры между четырьмя различными типами клеток в монослое и/или в 3D (сфероиды). Комбинация моделей прямой и непрямой совместной культуры также может быть выполнена путем смешивания различных типов клеток в одном и том же компартменте. Влияние сложных структур (органоидов, тканевых эксплантов и т.д.) на различные типы клеток может быть еще одним примером моделей, которые могут быть созданы. Кроме того, напечатанные на 3D-принтере вкладыши совместимы с функциональными анализами клеточной биологии (пролиферация, миграция, образование псевдотрубок, дифференцировка и т. д.) и биохимическими тестами (выделение ДНК, РНК, белка, липидов и т. д.). Наконец, напечатанные на 3D-принтере вкладыши обеспечивают широкий спектр экспериментальных схем моделей кокультур с возможностью одновременного комбинирования различных анализов в одном эксперименте в разных отсеках.

Представлены некоторые возможности напечатанных на 3D-принтере вставок, чтобы проверить их в качестве быстрой и простой в использовании модели совместной культуры. По сравнению с ранее опубликованным исследованием, проведенным по коммуникации паракринных клеток, продемонстрирована способность напечатанных на 3D-принтере вставок быть ценной моделью кокультуры. Для оценки этого момента было проведено сравнение регуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток кератиноцитами между напечатанной на 3D-принтере системой вкладышей и классической системой с использованием кондиционированных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют быстро получать результаты, аналогичные традиционным системам, использующим кондиционированные носители. Действительно, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают надежную модель для изучения клеточных взаимодействий в обоих направлениях без необходимости производства кондиционированных сред и с возможностью параллельного выполнения анализов пролиферации и миграции в одном и том же эксперименте.

В заключение в данной работе предлагается новая и готовая к использованию модель для изучения клеточной коммуникации. Совместимые со всеми типами адгезивных клеток, напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют выполнять многочисленные комбинации кокультур, которые направлены на то, чтобы быть ближе к условиям in vivo .

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-вставки (Рисунок 1A) приобретаются в промышленных масштабах и печатаются с использованием фотополимерной смолы, биосовместимой с клеточными культурами и автоклавированием (см. Таблицу материалов). В этом разделе описан подробный протокол для создания модели совместной культуры с помощью вставок (см. рис. 1B). Также приведены некоторые примеры приложений.

1. Размещение стерилизованного вкладыша в 6-луночные планшеты

1. Смешайте два компонента, входящие в комплект (см. Таблицу материалов), пищевой кремний (реагент А) и катализатор (реагент В), в соотношении 10:1 (v/v) в соответствии с инструкциями производителя. (Рисунок 1Ba). Используйте шпатель, стерилизованную 70% этанолом, чтобы смешать два компонента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем приготовляемой кремниевой смеси зависит от количества закрепляемых вставок. Избыток катализатора может привести к слишком быстрому затвердеванию кремниевой смеси.
2. Нанесите вставки на силиконовую смесь пинцетом так, чтобы смесь равномерно распределилась по нижнему краю вставок (рисунок 1Bb). Поместите вставки в лунки 6-луночного планшета и слегка надавите на пластины, чтобы убедиться, что вставки находятся в тесном контакте с планшетом, чтобы избежать утечки среды для клеточной культуры (Рисунок 1Bc).
3. Поставьте пластину при температуре 37 °C, чтобы поддержать процесс затвердевания кремния в течение 1 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время затвердевания зависит от количества добавленного катализатора.
4. После застывания простерилизовать пластины со вкладышами, погрузив их в ванну с 70% этиловым спиртом на срок от 30 мин до 1 ч.
5. Выбросьте спирт с помощью пипетки и дайте планшету высохнуть (крышка открыта) в течение ночи в колпаке для клеточных культур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спирт должен быть полностью испарен перед выполнением следующего шага, чтобы избежать фиксации клеток и токсичности. Готовую к использованию пластину, содержащую вкладыши, можно хранить в течение нескольких дней перед использованием в сухом и стерильном состоянии при комнатной температуре.

2. Покрытия, такие как поли-L-лизин или поли-HEMA (дополнительный этап)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте покрытие не выполняется, и приведены шаги, информирующие о возможности нанесения покрытия на пластины.

1. Приготовьте раствор для покрытия в соответствии с инструкциями производителя.
2. Рассмотрим объем 200-400 мкл для самых больших отсеков и объем 50-100 мкл для самых маленьких отсеков для покрытия вставки. Добавьте раствор для покрытия в отдельные отсеки.
3. Дайте покрытию высохнуть в соответствии с указаниями производителя в стерильных условиях.

3. Засев клеток

1. Культивирование кератиноцитов наружной оболочки корня (KORS) и дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HDMEC) в соответствии с рекомендациями производителя. Приготовьте клеточную суспензию, как только клетки достигнут слияния.
   1. Выбросьте среду из колб и добавьте 5 мл трипсина, чтобы отделить клетки (см. Таблицу материалов).
   2. Поместите колбу с KORS при температуре 37 °C с 5% CO₂ на 5 минут. Инкубируйте колбу с HDMEC в течение 5 минут при комнатной температуре.
   3. Раствор трипсина, содержащий KORS, смешать с 5 мл среды мезенхимальных стволовых клеток (МСК_М) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и факторов роста (базальная среда с набором добавок, см. таблицу материалов). Раствор трипсина, содержащий HDMEC, смешивают с 5 мл эндотелиальной клеточной среды (EC_M) с добавлением 5% FBS и факторов роста (см. таблицу материалов).
   4. Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте суспензии KORS и HDMEC при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл соответствующей среды.
   6. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя (см. таблицу материалов).
   7. Добавьте 10 мкл смеси в камеру счетного предметного стекла.
   8. Вставьте ползунок для подсчета клеток в систему подсчета клеток (см. Таблицу материалов) и определите номер ячейки и жизнеспособность.
   9. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 0,5 x 10⁵ клеток/мл в соответствующей среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если для разных типов клеток требуется разное время адгезии и/или для достижения идеального слияния, посев клеток может быть выполнен в разные моменты времени в зависимости от типа клеток.
2. Распределите пипеткой от 800 мкл до 1 мл клеточной суспензии в отдельные большие отсеки и 100-150 мкл в отдельные малые отсеки.
   1. Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSC_M с добавлением⁵% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
   2. Семенной HDMEC в EC_M с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 10³ клеток/мл в малых компартментах и 1,25 x 10⁵ клеток/мл в другом большом компартменте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ пролиферации может быть выполнен в малых компартментах, а анализ миграции и жизнеспособности может быть выполнен в больших компартментах. Концентрация засеянных клеток была оптимизирована в соответствии с рекомендациями производителя. Такая концентрация обеспечивает хорошую жизнеспособность клеток через 24-48 ч инкубации.
3. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%_CO2 или в обычных условиях, чтобы обеспечить адгезию и/или созревание клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте клетки в течение 24-48 ч без смены среды. При необходимости среда отсеков может быть изменена независимо.

4. Реализация совместной культуры ( Рисунок 1Bd)

ПРИМЕЧАНИЕ: Реализация совместной культуры соответствует времени, когда добавляется общая среда. Добавление уникальной среды для всех типов клеток в различных компартментах обеспечивает возможность паракринной связи между клетками благодаря наличию коммуникационных окон (яйцевидных отверстий в стенках 3D-печатных вставок). Чтобы внедрить совместную культуру, выполните шаги 4.1-4.3.

1. Опорожните питательные среды из различных отсеков вкладышей с помощью пипетки. В случае культуры 3D-сфероидных клеток очень осторожно утилизируйте среду.
2. Промойте ячейки 1 мл теплого PBS с температурой 37 °C в больших отсеках и 200 мкл теплого PBS с температурой 37 °C в маленьких отсеках. Обеспечьте бережную стирку, чтобы не отсоединить клетки.
3. Добавьте 3 мл общей среды, подобранной так, чтобы она была совместима со всеми типами клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется базальный EC_M (без FBS и факторов роста). Убедитесь, что среда покрывает все отсеки (уровень над коммуникационными окнами [яйцевидные отверстия в стенах], как показано на рисунке 1А).
4. Поместите планшет с кокультурами при температуре 37 °C с 5% CO₂ на 24-48 ч.

5. Наблюдение за клетками, подсчет и выскабливание

1. Наблюдайте за морфологией и подсчитывайте количество клеток различных компартментов во время эксперимента под оптическим микроскопом через 24-48 ч инкубации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое количество ячеек зависит от используемых типов клеток (размер, морфология и т.д.) и от размера отсека. В этом эксперименте в больших отсеках подсчитывают от 0,5 x 10 6-1 x¹⁰ 6 KORS/мл и от 0,25 x 10 6-0,75 x 10 ⁶ HDMECs/мл.
2. Отделите клетки с помощью трипсина для подсчета клеточной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения для отделения клеток рассмотрите объем 100-500 мкл для самых больших компартментов и объем 10-50 мкл для самых маленьких компартментов.
3. Проверьте жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим (см. шаги 3.1.6-3.1.8).

6. Очистка вставок для вторичной переработки

1. Снимите вкладыши с 6-луночной пластины в конце эксперимента, слегка покрутив (Рисунок 1Be).
2. Снимите силикон со вставок, потянув за него. При необходимости с помощью шпателя удалите остатки силикона, прилипшие к стенкам вставок (рисунок 1Bf).
3. Промойте вкладыши обычными моющими средствами для клеточных культур и чистящими средствами (пример приведен в таблице материалов).
4. Стерилизуйте вкладыши для дальнейшего использования в автоклаве (твердый цикл, 121 °C в течение 20 минут) или погрузив их в ванну с 70% этанолом на 1 час.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описываются два примера возможных анализов (анализы пролиферации и миграции) с использованием напечатанных на 3D-принтере вставок (рис. 1Bd).

7. Анализ пролиферации клеток - WST-1

1. Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC. Ячейки KORS используются для сравнения данных, опубликованных ранее⁸.
   1. Высевают KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в среду мезенхимальных стволовых клеток (МСК_М) с добавлением⁵% FBS и факторов роста в больших компартментах.
   2. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%_CO2 на 24 часа.
   3. Высевают HDMEC в эндотелиальную клеточную среду (EC_M) с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 10³ клеток/мл в небольших компартментах.
   4. Поместите планшет с клеточной культурой при температуре 37 °C с 5% CO₂ на 24-48 ч.
   5. Выбросьте среду из всех отсеков и внедрите систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базального EC_M (общая среда для клеточных культур для всех отсеков вкладышей, напечатанных на 3D-принтере).
2. Разводят WST-1 в общей клеточной культуре EC_M (окончательное разведение 1:10) для приготовления раствора WST-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для объема раствора WST-1 приготовьте не менее 500 мкл дополнительного раствора для заготовки.
3. Выбросьте питательную среду из вкладыша с помощью пипетирования.
4. Добавьте раствор WST-1 в выбранные отсеки (150 мкл для маленьких отсеков и 600 мкл для больших). Поставьте пластину при температуре 37 °C с 5% CO₂.
5. По истечении оптимального 30-минутного времени инкубации клеток перенесите 100 мкл инкубационной среды из каждого состояния на 96-луночный планшет.
6. Оцените колориметрическую реакцию с помощью микропланшетного ридера в диапазоне от 420 нм до 480 нм.
   1. Наденьте пластину на микропланшет считывателя и нажмите на кнопку редактирования нового протокола.
   2. Выберите конкретный тип используемой 96-луночной пластины (см. Таблицу материалов) и длину волны 450 нм.
   3. Нажмите на кнопку начать измерение.

8. Анализ миграции клеток - устройство с двумя миграционными камерами

1. Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC.
   1. Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSC_M с добавлением⁵% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
   2. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%_CO2 на 24 часа.
   3. Поместите устройство с двумя миграционными камерами в другой большой отсек вкладышей.
   4. Засейте HDMEC в EC_M , добавив 5% FBS и факторы роста в 7 x 10⁵ клеток/лунку устройства с двумя миграционными камерами.
   5. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%_CO2 на 24 часа.
   6. Утилизируйте носитель и устройство с двумя миграционными камерами через 24 часа или в оптимальное время в зависимости от типа мигрируемой ячейки. Реализуйте систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базального_{EC M}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Действуйте осторожно, чтобы не отсоединить ячейки. Если клетки действительно чувствительны к отслоению, вызванному добавлением общей среды, снимите устройство с двумя миграционными камерами после добавления общей среды.
2. Понаблюдайте и сделайте снимок поверхности, покрытой клетками в разные моменты времени, под фазово-контрастным микроскопом при 10-кратном увеличении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снимки сделаны с помощью фазово-контрастного микроскопа (см. Таблицу материалов). Снимки сохраняются на USB-накопителе, а затем анализируются с помощью плагина инструмента для заживления ран программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
3. Измерьте непокрытую поверхность с помощью классического программного обеспечения для количественного анализа.
   1. Откройте изображение в программе и активируйте инструмент для заживления ран, доступный в списке макросов.
   2. Нажмите на кнопку m , чтобы измерить непокрытую поверхность изображения миграции.
   3. Непокрытая поверхность рассчитывается по следующей формуле:
      Процент покрытия = ([средняя площадь без ячеек в момент T0 − средняя площадь без ячеек в момент времени T]/средняя площадь без ячеек в момент T0) × 100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напечатанные на 3D-принтере вкладыши полностью адаптированы к большинству методов клеточной биологии (таких как анализ образования псевдотрубок, 3D-культуры) и для биохимических экспериментов (таких как экстракция ДНК, РНК, белка).

В настоящей работе была описана оптимизированная система кокультур для получения устойчивых, надежных и значимых данных, сопоставимых с классическими методами, за счет использования условных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки имитируют условия микроокружения in vivo различных типов клеток при взаимодействии, преодолевая трудности и трудоемкое производство кондиционированных сред перед экспериментами. Ранее опубликованное исследование было проведено повторно для анализа косвенных взаимодействий между двумя типами клеток, присутствующих в волосяных фолликулах: микрососудистыми эндотелиальными клетками человека (HDMEC) и человеческими кератиноцитами наружной оболочки корня (KORS)⁸. Продемонстрирована воспроизводимость результатов, полученных при использовании 3D-печатных вставок, по сравнению с классическим методом исследования косвенных взаимодействий между HDMEC и KORS с использованием кондиционированных сред. Условия культивирования клеток, ранее описанные в исследовании⁸, были такими же, как и в настоящей работе. Они были адаптированы с учетом размеров напечатанных на 3D-принтере вставок (см. протокол). Прежде всего, фенотип и жизнеспособность клеток были сопоставимы между двумя условиями (кондиционированные среды против .3D-печатных вкладышей) для всех типов клеток (рис. 2). Действительно, 90% жизнеспособности наблюдалось в лунках 6-луночных планшетов (рис. 2А и табл. 1), а в напечатанных на 3D-принтере вставках (рис. 2Б и табл. 1) для KORS. Жизнеспособность HDMEC составила 85% в лунках 6-луночной пластины (рис. 2C и табл. 2) по сравнению с 86% в напечатанных на 3D-принтере пластинах (рис. 2D и табл. 2). Данные о жизнеспособности клеток рассчитывались автоматическим счетчиком клеток (Таблица материалов) следующим образом: количество жизнеспособных клеток, деленное на общее количество клеток (мертвые + жизнеспособные клетки). Средние данные были получены путем расчета процента жизнеспособности, полученного в шести независимых экспериментах, в которых было выполнено два повторения (см. табл. 1 и табл. 2).

Эти результаты показали, что напечатанная на 3D-принтере вставка не изменила поведение или жизнеспособность клетки по сравнению с обычной культурой на 6-луночных планшетах. Таким образом, напечатанные на 3D-принтере вставки были признаны новой моделью совместной культуры.

Проанализированы ранее продемонстрированные^{параметры 8} непрямой клеточной коммуникации. Для всех экспериментов внедрение сокультуры вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, осуществлялось по протоколам в соответствии с классическими условиями культивирования (см. предыдущую работу⁸).

Во-первых, были оценены непрямые клеточные коммуникации между KORS и HDMEC во вставках, напечатанных на 3D-принтере, путем анализа пролиферации клеток и сравнения с классическим методом с использованием кондиционированных сред (рис. 3). В присутствии KORS во вставках (+ KORS) пролиферация HDMEC достоверно увеличивалась в 1,5 раза через 24 ч и в 3,1 раза через 48 ч по сравнению с контрольным состоянием без KORS (Control) (рис. 3А). Эти результаты согласовывались с результатами, полученными в экспериментах с условными средами (рис. 3Б). Действительно, было показано, что KORS_CM значительно увеличивает пролиферацию HDMEC в 1,5 раза через 24 ч и в 2,1 раза через 48 ч.

Напечатанная на 3D-принтере модель совместной культуры вкладышей была протестирована для определения влияния KORS на миграцию HDMEC. Ранее этот эффект был продемонстрирован в классической системе кокультуры с использованием условных сред⁸ (рис. 4). В контрольном состоянии без KORS (Control) HDMEC мигрировали и покрывали примерно 44% площади раны через 24 ч (рис. 4A). В присутствии KORS (+ KORS) наблюдался сильный и значительный рост миграции HDMEC. Действительно, кинетика заживления раны показала, что 43%, 67% и 99% площади раны были покрыты HDMEC через 3 ч, 12 ч и 24 ч соответственно. Эти результаты согласуются с результатами, полученными ранее⁸, где было показано, что KORS_CM аналогичным образом увеличивает миграцию HDMEC (рис. 4B).

Рисунок 1: Рабочий процесс, показывающий реализацию культуры 3D-печатной вставки от очистки до переработки вставки . (A) Репрезентативное изображение вкладыша, напечатанного на 3D-принтере. (В) Проиллюстрирован репрезентативный пример анализов, представленных в данной рукописи. Обратите внимание, что анализ на пролиферацию может быть выполнен в одном отсеке вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, параллельно с анализом миграции, выполняемым в другом отсеке с использованием устройства с двумя миграционными камерами, размещенного в других отсеках вкладышей, напечатанных на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Жизнеспособность KORS и HDMEC. (A,B) Морфология KORS (10x) в (A) лунке 6-луночной пластины и (B) во вставке, напечатанной на 3D-принтере. (С,Д) Морфология HDMEC (10x) в (C) лунке с 6-луночной пластиной и (D) во вставке, напечатанной на 3D-принтере. Масштабная линейка: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Влияние KORS на пролиферацию HDMEC. (A) Пролиферацию HDMEC измеряли с помощью колориметрического анализа с использованием красителя WST-1 во вставке, напечатанной на 3D-принтере, в отсутствие KORS (control = CTRL) или в присутствии KORS (+ KORS) в течение 24 ч или 48 ч. (B) Пролиферацию HDMEC измеряли колориметрическим анализом с использованием красителя WST-1 в присутствии среды для культуры базальных клеток EC_M или KORS_CM в течение 24 ч или 48 ч. Результаты выражены в виде среднего ± SEM, n = 8 повторений, и было проведено два независимых эксперимента. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 и *****p < 0,00001. KORS инкубировали в EC_M без FBS и факторов роста. Через 48 ч эту кондиционированную среду собирали и хранили при температуре −80 °C для экспериментов. Эта цифра изменена с ⁸ и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Влияние KORS на миграцию HDMEC. (A) Миграция HDMEC во вставке, напечатанной на 3D-принтере, в отсутствие KORS (control = CTRL) или в присутствии KORS (+ KORS) показана и количественно выражена в процентах восстановления. (B) Миграция HDMEC в EC_M или KORS_CM показана и количественно выражена в процентах восстановления. Полученные результаты выражены в виде среднего ± SEM, n=3 репликации, при этом на одну репликацию было проанализировано три поля, проведено два независимых эксперимента. **p<0.01, *****p<0.00001. Масштабная линейка: 200 мкм. KORS инкубировали в EC_M без FBS и факторов роста. Через 48 ч эту кондиционированную среду собирали и хранили при -80 °C для экспериментов. Эта цифра изменена с ⁸ и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Измерение жизнеспособности KORS. Жизнеспособность KORS измеряли в лунке 6-луночного планшета и во вставке, напечатанной на 3D-принтере, с использованием окрашивания трипановым синим и автоматического подсчета.

Таблица 2: Измерение жизнеспособности HDMEC. Жизнеспособность HDMEC измеряли в лунке 6-луночного планшета и во вставке, напечатанной на 3D-принтере, с использованием окрашивания трипановым синим и автоматического подсчета.

Непрямая клеточная коммуникация обычно исследуется с использованием кондиционированных сред или устройств для совместной культивации. Подготовка условной среды занимает много времени на начальном этапе экспериментов, и этот метод ограничен односторонним анализом эффектов. Предыдущее исследование Colin-Pierre et al.⁸ С использованием кондиционированных сред была проведена непрямая клеточная коммуникация между двумя типами клеток (HDMEC и KORS). Данные предыдущего исследования продемонстрировали влияние кондиционированных сред KORS на пролиферацию HDMEC и влияние кондиционированных сред KORS на миграцию HDMEC, образование псевдотрубок и экспрессию GPC1⁸. В настоящем исследовании описан более простой и быстрый способ изучения непрямой клеточной коммуникации. Фактически, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают гибкость в дизайне экспериментов и различных комбинациях клеточных культур. Чтобы валидировать эти напечатанные на 3D-принтере вставки в качестве модели для кокультур, пролиферация и миграция клеток были проанализированы и сравнены с предыдущим исследованием с использованием кондиционированных сред⁸. В обоих исследованиях анализ заживления ран проводили с помощью устройства с двумя миграционными камерами (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 мм), помещенных в лунку, содержащую или не содержащую вкладыш. Этот прибор для испытания миграции^9,10 отличается от тестов с нуля^11,12 тем, что след, оставленный стенкой (имитирующей рану), разделяющей две камеры^, постоянен. Поэтому он обладает высокой воспроизводимостью. Результаты настоящего исследования привели к аналогичному выводу по сравнению с экспериментами на условных носителях. Напечатанные на 3D-принтере вставки не изменяют поведение клетки и адаптированы для создания независимых покрытий компартментов, способствующих адгезии клеток. Тем не менее, вставки, напечатанные на 3D-принтере, также позволяют создавать покрытие из поли-HEMA, например, для обеспечения низкого прикрепления культуры сфероида/органоида. Непрямая связь между HDMEC и KORS была исследована в качестве примера многочисленных применений, обеспечиваемых напечатанными на 3D-принтере вставками.

Это новое устройство, применимое к адгезивным типам клеток, которые требуют или не требуют специального покрытия, обеспечивает значительную экономию времени на создание модели совместной культуры. Действительно, четыре отсека напечатанных на 3D-принтере вкладышей позволяют культивировать несколько типов клеток в монослое или в 3D (агрегаты или сфероиды) в одной лунке с различными комбинациями. Например, можно проанализировать косвенную связь четырех типов клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или их комбинацию. В ходе экспериментов сфероиды культивировались во вставках, напечатанных на 3D-принтере, с использованием покрытия poly-HEMA (данные не показаны). Сфероиды состояли из клеток, засеянных в 3D из-за низкой соединительной пластины и перенесенных через 48 ч на 3D-печатную вставку для анализа. Через несколько дней культивирования наблюдался рост сфероидов. Эти результаты показывают, что напечатанная на 3D-принтере вставка может быть использована для отслеживания роста 3D-клеток после переноса сфероидов так же, как и в культуральном планшете^13,14. Более того, смесь различных типов клеток может быть собрана вместе в одном и том же отсеке в 2D или 3D (органоиды) для изучения как прямой, так и непрямой клеточной коммуникации. Действительно, широкий диапазон модульности, предлагаемый 3D-печатными вкладышами, характеризует эту инновационную систему кокультивирования клеток. Кроме того, наличие коммуникационных окон позволяет использовать в общей среде для всех типов клеток в выбранное время без помощи кондиционированных сред. Таким образом, этот метод не применим к клеткам, культивируемым в суспензии. Стенки, разделяющие четыре отсека, позволяют производить посев, сбор урожая и анализ каждого типа клеток независимо от других. Может быть сделано несколько применений, таких как анализ образования псевдотрубок и пролиферации, миграции, анализа ДНК, РНК, белка и других анализов. Напечатанные на 3D-принтере вставки также дают возможность, например, анализировать влияние молекул или внеклеточных везикул. Более того, тот факт, что эти вставки были изготовлены с помощью 3D-печати, предоставляет многочисленные возможности для компоновки отсеков и многочисленных функциональных анализов.

Тем не менее, необходимо тщательно продумать критический этап герметизации пластины, напечатанной на 3D-принтере. Действительно, гомогенный передел кремния имеет решающее значение для обеспечения герметизации и предотвращения утечки среды клеточной культуры или клеток из одного отсека в другой. Чтобы избежать каких-либо проблем, следует убедиться, что силикон покрывает ту часть напечатанных на 3D-принтере вставок, которая будет соприкасаться с пластиной. Перед посевом клеток следует проверить правильность герметизации, добавив питательную среду в один отсек и наблюдая за отсутствием утечки среды в других отсеках. Время высыхания кремния после инкубации в ванне с 70% этанолом также является критическим этапом. Действительно, оставшиеся следы алкоголя могут привести к фиксации клеток и токсичности. Чтобы избежать каких-либо проблем, необходимо соблюдать время высыхания.

В заключение, напечатанные на 3D-принтере, вставки совместимы с большинством адгезивных типов клеток для культуры в 2D или 3D и позволяют проводить многочисленные эксперименты. Они могут быть адаптированы для многочисленных исследований с использованием кокультур и могут стать новым инструментом для изучения непрямой клеточной коммуникации. Напечатанные на 3D-принтере вставки являются модульными, гибкими, масштабируемыми и могут использоваться для создания экспериментальных моделей для изучения физиологических патологий, таких как ракология, иммунология или ангиогенез.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Это исследование было проведено в сотрудничестве с BASF Beauty Care Solutions. Г-жа Чарли Колин-Пьер (Charlie Colin-Pierre) является докторантом BASF/CNRS.

Мы хотели бы поблагодарить г-на Мехди Селлами за концепцию вставок, напечатанных на 3D-принтере.