Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici

In questo articolo, un inserto stampato in 3D di nuova concezione viene presentato come modello di co-coltura e convalidato attraverso lo studio della comunicazione intercellulare paracrina tra cellule endoteliali e cheratinociti.

Le analisi classiche della comunicazione indiretta tra diversi tipi di cellule richiedono l'uso di mezzi condizionati. Inoltre, la produzione di terreni condizionati rimane dispendiosa in termini di tempo e lontana da condizioni fisiologiche e patologiche. Sebbene alcuni modelli di co-coltura siano disponibili in commercio, rimangono limitati a saggi specifici e sono per lo più per due tipi di cellule.

In questo caso, vengono utilizzati inserti stampati in 3D compatibili con numerosi saggi funzionali. L'inserto consente la separazione di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in quattro scomparti. È possibile impostare un'ampia gamma di combinazioni. Inoltre, le finestre sono progettate in ogni parete dei compartimenti in modo che la potenziale comunicazione intercellulare tra ogni compartimento sia possibile nel terreno di coltura in modo dipendente dal volume. Ad esempio, la comunicazione intercellulare paracrina può essere studiata tra quattro tipi di cellule in monostrato, in 3D (sferoidi) o combinando entrambi. Inoltre, un mix di diversi tipi di cellule può essere seminato nello stesso compartimento in formato 2D o 3D (organoidi). L'assenza di un fondo negli inserti stampati in 3D consente le consuete condizioni di coltura sulla piastra, l'eventuale rivestimento sulla piastra contenente l'inserto e la visualizzazione diretta mediante microscopia ottica. I compartimenti multipli offrono la possibilità di raccogliere diversi tipi di cellule in modo indipendente o di utilizzare, in ogni compartimento, diversi reagenti per l'estrazione di RNA o proteine. In questo studio, viene fornita una metodologia dettagliata per utilizzare il nuovo inserto stampato in 3D come sistema di co-coltura. Per dimostrare diverse capacità di questo modello flessibile e semplice, i saggi funzionali di comunicazione cellulare precedentemente pubblicati sono stati eseguiti nei nuovi inserti stampati in 3D e si sono dimostrati riproducibili. Gli inserti stampati in 3D e la coltura cellulare convenzionale utilizzando terreni condizionati hanno portato a risultati simili. In conclusione, l'inserto stampato in 3D è un dispositivo semplice che può essere adattato a numerosi modelli di co-colture con tipi di cellule aderenti.

In vivo, le cellule comunicano tra loro direttamente (contatto cellulare) o indirettamente (secrezione di molecole). Per studiare la comunicazione cellulare, possono essere sviluppati diversi modelli di co-coltura, come la co-coltura diretta (i diversi tipi di cellule sono in interazione diretta nello stesso pozzetto) e la co-coltura compartimentata (i diversi tipi di cellule sono in interazione indiretta in diversi compartimenti di un sistema di coltura)¹. Inoltre, i terreni condizionati possono essere utilizzati per i sistemi di co-coltura, in cui l'interazione indiretta è resa possibile dalle molecole secrete contenute nel terreno condizionato di un tipo di cellula effettrice che viene trasferita a una cellula responder di tipo¹.

Nel caso di studi di comunicazione cellulare paracrina, i sistemi di co-coltura indiretta forniscono modelli che riflettono fortemente le interazioni cellulari in vivo. Sono stati sviluppati e commercializzati sistemi di co-coltura indiretta, che consentono la creazione di modelli di co-coltura indiretta ^2,3. Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi di co-coltura indiretta fornisce solo due compartimenti. Altri sistemi di co-coltura indiretta forniscono compartimenti multipli, ma sono meno scalabili rispetto al sistema riportato nel presente manoscritto. Alcuni di essi non consentono una visualizzazione classica al microscopio e spesso presentano metodi di applicazione specifici. In diversi studi, la comunicazione paracrina tra diversi tipi di cellule è stata sondata dal modello di terreno condizionato 4,5,6,7. Si tratta di un metodo di indagine più semplice rispetto ai sistemi di co-coltura indiretta, in quanto non richiede l'utilizzo^di metodi o materiali specifici per l'accertamento 1. D'altra parte, la preparazione di terreni condizionati richiede molto tempo e fornisce informazioni solo sulla segnalazione cellulare unidirezionale (da effettore a responder)¹.

In questo articolo, viene proposto un nuovo e semplice modo di studiare la comunicazione cellulare. Consentendo la combinazione di diversi tipi di cellule in interazione diretta o indiretta e in formato 2D o 3D, gli inserti stampati presentano numerosi vantaggi per la facile creazione di modelli di co-coltura. Adattato per essere posizionato nei pozzetti delle piastre a 6 pozzetti, l'inserto stampato in 3D è circolare e consente la separazione del pozzetto in quattro scomparti (due grandi scomparti e due piccoli scomparti; Figura 1A). Gli inserti stampati in 3D sono caratterizzati dall'assenza di fondo. In questo modo, le celle sono a diretto contatto con la piastra su cui è posizionato l'inserto. Inoltre, ogni scomparto può essere rivestito indipendentemente dagli altri. Inoltre, il comportamento cellulare può essere facilmente seguito al microscopio ottico. La presenza di finestre di comunicazione in ogni parete dell'inserto permette l'aggiunta, al momento ottimale, di un medium comune per eseguire diversi esperimenti di co-coltura. Numerose combinazioni di co-coltura possono essere eseguite per studiare la comunicazione diretta e/o indiretta tra diversi tipi di cellule. Ad esempio, è possibile progettare un modello di co-coltura indiretta tra quattro diversi tipi cellulari in monostrato e/o in 3D (sferoidi). Una combinazione di modelli di co-coltura diretta e indiretta può anche essere eseguita mescolando diversi tipi di cellule nello stesso compartimento. L'effetto di strutture complesse (organoidi, espianto di tessuti, ecc.) su diversi tipi di cellule potrebbe essere un altro esempio di modelli che possono essere realizzati. Inoltre, gli inserti stampati in 3D sono compatibili con i saggi funzionali di biologia cellulare (proliferazione, migrazione, formazione di pseudotubi, differenziamento, ecc.) e con i test biochimici (estrazione di DNA, RNA, proteine, lipidi, ecc.). Infine, gli inserti stampati in 3D forniscono un'ampia gamma di schemi sperimentali di modelli di co-coltura con la possibilità di combinare contemporaneamente diversi saggi nello stesso esperimento nei diversi compartimenti.

Vengono presentate alcune capacità degli inserti stampati in 3D per convalidarli come modello di co-coltura rapido e facile da usare. Rispetto a uno studio precedentemente pubblicato condotto sulla comunicazione delle cellule paracrine, viene dimostrata la capacità degli inserti stampati in 3D di essere un prezioso modello di co-coltura. Per valutare questo punto, la regolazione della proliferazione e della migrazione delle cellule endoteliali da parte dei cheratinociti è stata confrontata tra il sistema di inserti stampato in 3D e il sistema classico utilizzando terreni condizionati. Gli inserti stampati in 3D consentono di ottenere rapidamente risultati simili rispetto al sistema convenzionale che utilizza supporti condizionati. Infatti, gli inserti stampati in 3D forniscono un modello robusto per studiare le interazioni cellulari in entrambe le direzioni senza la necessità di produrre terreni condizionati e con la possibilità di eseguire in parallelo i saggi di proliferazione e migrazione nello stesso esperimento.

Per concludere, in questo articolo, viene proposto un nuovo modello pronto all'uso per studiare la comunicazione cellulare. Compatibili con tutti i tipi di cellule aderenti, gli inserti stampati in 3D consentono di eseguire numerose combinazioni di co-coltura che mirano ad essere più vicine alle condizioni in vivo .

NOTA: Gli inserti 3D (Figura 1A) sono acquistati in commercio e sono stampati utilizzando una resina fotopolimerica biocompatibile con la coltura cellulare e la sterilizzazione in autoclave (vedere la tabella dei materiali). In questa sezione viene descritto un protocollo dettagliato per stabilire il modello di co-coltura mediante inserti (vedere la Figura 1B). Vengono inoltre forniti alcuni esempi di applicazioni.

1. Posizionamento dell'inserto sterilizzato nelle piastre a 6 pozzetti

1. Miscelare i due componenti forniti nel kit (vedi Tabella dei Materiali), silicio alimentare (reagente A) e catalizzatore (reagente B), in un rapporto di 10:1 (v/v) secondo le istruzioni del produttore. (Figura 1Ba). Utilizzare una spatola sterilizzata con etanolo al 70% per mescolare i due componenti.
   NOTA: Il volume della miscela di silicio da preparare dipende dal numero di inserti da fissare. Un eccesso di catalizzatore può far sì che la miscela di silicio si solidifichi troppo velocemente.
2. Applicare gli inserti sulla miscela di silicone con una pinzetta in modo che la miscela sia distribuita in modo omogeneo sul bordo inferiore degli inserti (Figura 1Bb). Posizionare gli inserti nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e applicare una leggera pressione sugli inserti per assicurarsi che gli inserti siano a stretto contatto con la piastra per evitare perdite del terreno di coltura cellulare (Figura 1Bc).
3. Mettere la piastra a 37 °C per supportare il processo di solidificazione del silicio per 1 h.
   NOTA: Il tempo di solidificazione dipende dalla quantità di catalizzatore che è stata aggiunta.
4. Dopo la solidificazione, sterilizzare le piastre con gli inserti immergendole in un bagno di etanolo al 70% per 30 minuti a 1 ora.
5. Scartare l'alcol mediante pipettaggio e lasciare asciugare la piastra (coperchio aperto) per una notte in una cappa per colture cellulari.
   NOTA: L'alcol deve essere completamente evaporato prima di eseguire il passaggio successivo per evitare la fissazione cellulare e la tossicità. La piastra pronta all'uso contenente gli inserti può essere conservata per diversi giorni prima dell'uso in condizioni asciutte e sterili a temperatura ambiente.

2. Rivestimenti come poli-L-lisina o poli-HEMA (passaggio opzionale)

NOTA: In questo esperimento non viene eseguito il rivestimento e vengono forniti i passaggi per informare sulla possibilità di rivestire gli inserti.

1. Preparare la soluzione di rivestimento secondo le istruzioni del produttore.
2. Si consideri un volume di 200-400 μL per gli scomparti più grandi e un volume di 50-100 μL per gli scomparti più piccoli per il rivestimento dell'inserto. Aggiungere la soluzione di rivestimento ai singoli scomparti.
3. Lasciare asciugare il rivestimento come indicato dal produttore in condizioni sterili.

3. Semina delle cellule

1. Coltivare i cheratinociti della guaina esterna della radice (KORS) e le cellule endoteliali microvascolari dermiche umane (HDMEC) come raccomandato dal produttore. Preparare la sospensione cellulare una volta che le cellule raggiungono la confluenza.
   1. Scartare il terreno dai palloni e aggiungere 5 mL di tripsina per staccare le cellule (vedere Tabella dei materiali).
   2. Porre il pallone contenente il KORS a 37 °C con il 5% di CO₂ per 5 min. Incubare il matraccio contenente gli HDMEC per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Miscelare la soluzione di tripsina contenente il KORS con 5 mL di terreno di coltura mesenchimale a base di cellule staminali (MSC_M) integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS) e fattori di crescita (terreno basale con kit di integratori, vedere Tabella dei materiali). Miscelare la soluzione di tripsina contenente gli HDMEC con 5 mL di terreno endoteliale (EC_M) integrato con FBS al 5% e fattori di crescita (vedere Tabella dei materiali).
   4. Trasferire le cellule in una provetta conica sterile da 15 mL. Centrifugare le sospensioni KORS e HDMEC a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL del rispettivo terreno.
   6. Miscelare 10 μL della sospensione cellulare con 10 μL di colorante blu di tripano (vedere Tabella dei materiali).
   7. Aggiungere 10 μL di miscela nella camera del vetrino di conteggio.
   8. Inserire il vetrino di conteggio nel sistema di conteggio delle cellule (vedere la tabella dei materiali) e rilevare il numero di celle e la vitalità.
   9. Preparare la sospensione cellulare a una concentrazione di 0,5 x 10⁵ cellule/mL nel rispettivo terreno.
      NOTA: Se i diversi tipi cellulari richiedono tempi di aderenza diversi e/o per raggiungere la confluenza ideale, la semina cellulare può essere effettuata in momenti diversi a seconda dei tipi di cellule.
2. Distribuire da 800 μL a 1 mL della sospensione cellulare nei singoli scomparti grandi e 100-150 μL nei singoli compartimenti piccoli con una pipetta.
   1. Seminare il KORS a 1 x 10⁵ cellule/mL in MSC_M integrato con il 5% di FBS e fattori di crescita in uno dei grandi compartimenti.
   2. Seme HDMEC in EC_M integrato con il 5% di FBS e fattori di crescita a 2,5 x 10³ cellule/mL nei compartimenti piccoli e a 1,25 x 10⁵ cellule/mL negli altri grandi compartimenti.
      NOTA: Il test di proliferazione può essere eseguito nei piccoli compartimenti e i saggi di migrazione e vitalità possono essere eseguiti nei grandi compartimenti. La concentrazione delle cellule seminate è stata ottimizzata secondo le raccomandazioni del produttore. Questa concentrazione consente una buona vitalità delle cellule dopo 24-48 ore di incubazione.
3. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C con il 5% di CO₂ o nelle condizioni abituali per consentire l'adesione e/o la maturazione cellulare.
   NOTA: Incubare le cellule per 24-48 ore senza cambiare il terreno. Se necessario, il supporto degli scomparti può essere cambiato in modo indipendente.

4. Implementazione della co-coltura ( Figura 1Bd)

NOTA: L'implementazione della co-coltura corrisponde al momento in cui viene aggiunto il terreno comune. L'aggiunta di un mezzo unico per tutti i tipi di cellule nei diversi compartimenti offre la possibilità di comunicazione paracrina tra le cellule grazie alla presenza di finestre di comunicazione (fori ovoidali nelle pareti degli inserti stampati in 3D). Per implementare la co-cultura, seguire i passaggi da 4.1 a 4.3.

1. Svuotare i terreni di coltura dai diversi scomparti degli inserti utilizzando una pipetta. Nel caso di una coltura cellulare sferoidale 3D, scartare il terreno molto delicatamente.
2. Sciacquare le cellule con 1 mL di PBS caldo a 37 °C negli scomparti grandi e 200 μL di PBS caldo a 37 °C negli scomparti piccoli. Garantire un lavaggio delicato per non staccare le celle.
3. Aggiungere 3 mL di un terreno comune selezionato per essere compatibile con tutti i tipi di cellule.
   NOTA: In questo studio viene utilizzata la EC_M basale (senza FBS e fattori di crescita). Assicurarsi che il fluido copra tutti gli scomparti (livello sopra le finestre di comunicazione [fori ovoidali nelle pareti], come mostrato nella Figura 1A).
4. Porre la piastra contenente le cocolture a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24-48 ore.

5. Osservazione, conteggio e raschiamento delle cellule

1. Osservare la morfologia e contare il numero di cellule dei diversi compartimenti durante l'esperimento al microscopio ottico dopo 24-48 ore di incubazione.
   NOTA: Il numero previsto di celle dipende dai tipi di celle utilizzate (dimensioni, morfologia, ecc.) e dalle dimensioni del compartimento. In questo esperimento, nei grandi scomparti vengono contati tra 0,5 x 10 6-1 x 10⁶ KORS/mL e tra 0,25 x 10 6-0,75 x 10 ⁶ HDMEC/mL.
2. Staccare le cellule usando la tripsina per il conteggio delle sospensioni cellulari.
   NOTA: Per la soluzione di distacco cellulare, considerare un volume di 100-500 μL per i compartimenti più grandi e un volume di 10-50 μL per i compartimenti più piccoli.
3. Verificare la vitalità utilizzando la colorazione con blu tripano (vedere i passaggi 3.1.6-3.1.8).

6. Inserire la pulizia per il riciclaggio

1. Rimuovere gli inserti dalla piastra a 6 pozzetti alla fine dell'esperimento ruotando leggermente (Figura 1Be).
2. Rimuovere il silicone dagli inserti tirandolo via. Se necessario, utilizzare una spatola per rimuovere il silicone rimanente attaccato alle pareti degli inserti (Figura 1Bf).
3. Lavare gli inserti con detergenti convenzionali per colture cellulari e materiali per la pulizia (esempio fornito nella tabella dei materiali).
4. Sterilizzare gli inserti per un uso futuro in autoclave (ciclo solido, 121 °C per 20 min) o immergendoli in un bagno di etanolo al 70% per 1 h.
   NOTA: Da questa fase, vengono descritti due esempi di possibili saggi (saggi di proliferazione e migrazione) utilizzando gli inserti stampati in 3D (Figura 1Bd).

7. Saggio di proliferazione cellulare - Saggio WST-1

1. Seguire i passaggi da 1 a 3.1 per coltivare le cellule.
   NOTA: Seguire il passaggio descritto in questa sezione per implementare il sistema di co-coltura al fine di studiare l'effetto del secretoma KORS sulla proliferazione HDMEC. Le celle KORS vengono utilizzate per confrontare i dati pubblicati in precedenza⁸.
   1. Seminare il KORS a 1 x 10⁵ cellule/mL in terreno di coltura di cellule staminali mesenchimali (MSC_M) integrato con FBS al 5% e fattori di crescita nei grandi compartimenti.
   2. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
   3. Seminare gli HDMEC in mezzo cellulare endoteliale (EC_M) integrato con FBS al 5% e fattori di crescita a 2,5 x 10³ cellule/mL nei piccoli compartimenti.
   4. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24-48 ore.
   5. Scartare i terreni da tutti i compartimenti e implementare il sistema di co-coltura con l'aggiunta di 3 mL di EC basale_M non integrato (terreno di coltura cellulare comune per tutti i compartimenti degli inserti stampati in 3D).
2. Diluire WST-1 nel terreno di coltura cellulare comune EC_M (diluizione finale 1:10) per preparare la soluzione WST-1.
   NOTA: Per il volume della soluzione WST-1, preparare almeno 500 μL di soluzione aggiuntiva per il bianco.
3. Scartare il terreno di coltura cellulare dall'inserto mediante pipettaggio.
4. Aggiungere la soluzione WST-1 ai compartimenti selezionati (150 μL per i compartimenti piccoli e 600 μL per i compartimenti grandi). Mettere la piastra a 37 °C con il 5% di CO₂.
5. Dopo il tempo ottimale di incubazione delle cellule di 30 minuti, trasferire 100 μL del mezzo di incubazione da ciascuna condizione su una piastra a 96 pozzetti.
6. Valutare la reazione colorimetrica utilizzando un lettore di micropiastre tra 420 nm e 480 nm.
   1. Posizionare la piastra sul lettore di micropiastre e fare clic sul pulsante modifica un nuovo protocollo.
   2. Selezionare il tipo specifico di piastra a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali) utilizzata e la lunghezza d'onda di 450 nm.
   3. Fare clic sul pulsante per avviare la misurazione.

8. Saggio di migrazione cellulare - dispositivo a due camere di migrazione

1. Seguire i passaggi da 1 a 3.1 per coltivare le cellule.
   NOTA: Seguire i passaggi descritti in questa sezione per implementare il sistema di co-coltura al fine di studiare l'effetto del secretoma KORS sulla proliferazione HDMEC.
   1. Seminare il KORS a 1 x 10⁵ cellule/mL in MSC_M integrato con il 5% di FBS e fattori di crescita in uno dei grandi compartimenti.
   2. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
   3. Inserire il dispositivo delle due camere di migrazione nell'altro grande scomparto di inserti.
   4. Seminare gli HDMEC in EC_M integrato con FBS al 5% e fattori di crescita a 7 x 10⁵ cellule/pozzetto del dispositivo a due camere di migrazione.
   5. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
   6. Scartare il terreno e il dispositivo delle due camere di migrazione dopo 24 ore o in un momento ottimale in base al tipo di cella che sta migrando. Implementare il sistema di co-coltura con l'aggiunta di 3 mL di EC_{basale M} non integrato.
      NOTA: Procedere con cautela per non staccare le celle. Se le cellule sono realmente sensibili al distacco indotto dall'aggiunta del terreno comune, staccare il dispositivo delle due camere di migrazione dopo l'aggiunta del terreno comune.
2. Osserva e scatta una foto della superficie coperta dalle cellule in diversi punti temporali con un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 10x.
   NOTA: Le immagini sono state scattate con un microscopio a contrasto di fase (vedere la tabella dei materiali). Le immagini vengono salvate in una chiavetta USB e poi analizzate dal plug-in dello strumento di guarigione delle ferite del software (vedi Tabella dei materiali).
3. Misura la superficie scoperta utilizzando il classico software di analisi quantitativa.
   1. Aprire l'immagine sul software e attivare lo strumento di guarigione delle ferite disponibile nell'elenco delle macro.
   2. Fare clic sul pulsante m per misurare la superficie scoperta dell'immagine di migrazione.
   3. La superficie scoperta viene calcolata secondo la seguente formula:
      Percentuale di copertura = ([area media senza celle a T0 − area senza celle al tempo T]/area media senza celle a T0) × 100.
      NOTA: Gli inserti stampati in 3D sono totalmente adattati alla maggior parte delle tecniche di biologia cellulare (come il saggio di formazione di pseudotubi, colture 3D) e per esperimenti di biochimica (come l'estrazione di DNA, RNA, proteine).

Nel presente lavoro, è stato descritto un sistema di co-coltura ottimizzato per ottenere dati robusti, affidabili e significativi paragonabili ai metodi classici attraverso l'uso di terreni condizionati. Gli inserti stampati in 3D imitano le condizioni del microambiente in vivo di diversi tipi di cellule in interazione, superando le difficoltà e la produzione di terreni condizionati a monte degli esperimenti. Uno studio pubblicato in precedenza è stato ricondotto per analizzare le interazioni indirette tra due tipi di cellule presenti nei follicoli piliferi: le cellule endoteliali microvascolari umane (HDMEC) e i cheratinociti umani della guaina esterna della radice (KORS)⁸. Qui, è stata dimostrata la riproducibilità dei risultati ottenuti utilizzando gli inserti stampati in 3D rispetto al metodo classico che utilizza mezzi condizionati per studiare le interazioni indirette tra HDMEC e KORS. Le condizioni di coltura cellulare precedentemente descritte nello studio⁸ erano le stesse di questo lavoro. Sono stati adattati tenendo conto delle dimensioni degli inserti stampati in 3D (vedi protocollo). Prima di tutto, il fenotipo e la vitalità cellulare erano comparabili tra le due condizioni (terreni condizionati vs inserti stampati in .3D) per tutti i tipi di cellule (Figura 2). In effetti, è stata osservata una vitalità del 90% nei pozzetti delle piastre a 6 pozzetti (Figura 2A e Tabella 1) e del 91% negli inserti stampati in 3D (Figura 2B e Tabella 1) per KORS. La vitalità degli HDMEC è stata dell'85% nei pozzetti della piastra a 6 pozzetti (Figura 2C e Tabella 2) rispetto all'86% negli inserti stampati in 3D (Figura 2D e Tabella 2). I dati relativi alla vitalità cellulare sono stati calcolati dal contatore automatico di cellule (Tabella dei materiali) come segue: il numero di cellule vitali diviso per il numero di cellule totali (cellule morte + cellule vitali). I dati medi sono stati ottenuti calcolando la percentuale di vitalità ottenuta in sei esperimenti indipendenti in cui sono state eseguite due repliche (vedi Tabella 1 e Tabella 2).

Questi risultati hanno indicato che l'inserto stampato in 3D non ha alterato il comportamento o la vitalità cellulare rispetto alla coltura abituale su piastre a 6 pozzetti. Pertanto, gli inserti stampati in 3D sono stati convalidati come un nuovo modello di co-coltura.

Sono stati analizzati i parametri⁸ della comunicazione cellulare indiretta dimostrati in precedenza. Per tutti gli esperimenti, l'implementazione della co-coltura dell'inserto stampato in 3D è stata realizzata seguendo i protocolli in accordo con le condizioni di coltura classiche (vedi lavoro precedente⁸).

In primo luogo, le comunicazioni cellulari indirette tra KORS e HDMEC negli inserti stampati in 3D sono state valutate analizzando la proliferazione cellulare e confrontate con il metodo classico utilizzando mezzi condizionati (Figura 3). In presenza di KORS negli inserti (+ KORS), la proliferazione HDMEC è aumentata significativamente di 1,5 volte dopo 24 ore e di 3,1 volte dopo 48 ore rispetto alla condizione di controllo senza KORS (controllo) (Figura 3A). Questi risultati erano in accordo con quelli ottenuti da esperimenti con mezzi condizionati (Figura 3B). Infatti, è stato dimostrato che il KORS_CM aumenta significativamente la proliferazione HDMEC di 1,5 volte dopo 24 ore e di 2,1 volte dopo 48 ore.

Il modello di co-coltura dell'inserto stampato in 3D è stato testato per determinare l'effetto di KORS sulla migrazione HDMEC. Questo effetto è stato precedentemente dimostrato nel sistema di co-coltura classico utilizzando terreni condizionati⁸ (Figura 4). Nella condizione di controllo senza KORS (controllo), gli HDMEC sono migrati e hanno coperto circa il 44% dell'area della ferita dopo 24 ore (Figura 4A). In presenza di KORS (+ KORS), è stato osservato un forte e significativo aumento della migrazione HDMEC. Infatti, la cinetica della guarigione della ferita ha mostrato che il 43%, il 67% e il 99% dell'area della ferita era coperta da HDMEC dopo 3 ore, 12 ore e 24 ore, rispettivamente. Questi risultati erano in accordo con quelli ottenuti in precedenza⁸, dove il_{KORS CM} ha dimostrato di aumentare la migrazione HDMEC in modo simile (Figura 4B).

Figura 1: Flusso di lavoro che mostra l'implementazione della co-coltura dell'inserto stampato in 3D, dalla pulizia al riciclaggio dell'inserto. (A) Un'immagine rappresentativa dell'inserto stampato in 3D. (B) Viene illustrato un esempio rappresentativo dei saggi presentati in questo manoscritto. Si noti che un test di proliferazione può essere effettuato in un compartimento dell'inserto stampato in 3D in parallelo a un test di migrazione eseguito nell'altro compartimento utilizzando un dispositivo a due camere di migrazione posizionato negli altri scomparti degli inserti stampati in 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fattibilità di KORS e HDMEC. (A,B) Morfologia di KORS (10x) in (A) un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e (B) in un inserto stampato in 3D. (C,D) Morfologia HDMEC (10x) in (C) un pozzetto di piastra a 6 pozzetti e (D) in un inserto stampato in 3D. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto di KORS sulla proliferazione di HDMEC. (A) La proliferazione di HDMEC è stata misurata mediante test colorimetrico utilizzando il colorante WST-1 nell'inserto stampato in 3D in assenza di KORS (controllo = CTRL) o in presenza di KORS (+ KORS) per 24 ore o 48 ore. (B) La proliferazione HDMEC è stata misurata mediante test colorimetrico utilizzando il colorante WST-1 in presenza di terreno di coltura di cellule basali EC_M o KORS_CM per 24 ore o 48 ore. I risultati sono espressi come media ± SEM, n = 8 repliche, e sono stati eseguiti due esperimenti indipendenti. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 e *****p < 0,00001. I KORS sono stati incubati in EC_M senza FBS e fattori di crescita. Dopo 48 ore, questo mezzo condizionato è stato raccolto e conservato a -80 °C per gli esperimenti. Questa cifra è stata modificata da ⁸ e riprodotta con il suo permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto di KORS sulla migrazione HDMEC. (A) La migrazione di HDMEC nell'inserto stampato in 3D in assenza di KORS (controllo = CTRL) o in presenza di KORS (+ KORS) è mostrata e quantificata come percentuale di recupero. (B) La migrazione degli HDMEC nella CE_M o KORS_CM è indicata e quantificata come percentuale di recupero. I risultati sono espressi come media ± SEM, n=3 repliche, e sono stati analizzati tre campi per replica, sono stati eseguiti due esperimenti indipendenti. **P<0.01, *****P<0.00001. Barra della scala: 200 μm. I KORS sono stati incubati in EC_M senza FBS e fattori di crescita. Dopo 48 ore, questo mezzo condizionato è stato raccolto e conservato a -80 °C per gli esperimenti. Questa cifra è stata modificata da ⁸ e riprodotta con il suo permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Misurazione della vitalità KORS. La vitalità di KORS è stata misurata in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e in un inserto stampato in 3D utilizzando la colorazione blu tripano e il conteggio automatico.

Tabella 2: Misurazione della vitalità HDMEC. La vitalità HDMEC è stata misurata in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e in un inserto stampato in 3D utilizzando la colorazione blu tripano e il conteggio automatico.

La comunicazione cellulare indiretta viene comunemente studiata utilizzando terreni condizionati o dispositivi di sistemi di co-coltura. La preparazione dei terreni condizionati richiede molto tempo a monte degli esperimenti e questo metodo è limitato alle analisi degli effetti unilaterali. Il precedente studio di Colin-Pierre et al.⁸ utilizzando terreni condizionati sono stati condotti sulla comunicazione cellulare indiretta tra due tipi di cellule (HDMEC e KORS). I dati di questo studio precedente hanno dimostrato l'effetto dei terreni condizionati KORS sulla proliferazione di HDMEC e l'effetto dei terreni condizionati KORS sulla migrazione di HDMEC, sulla formazione di pseudotubi e sull'espressione di GPC1⁸. Nel presente studio, viene descritto un modo più semplice e veloce per studiare la comunicazione cellulare indiretta. Infatti, gli inserti stampati in 3D consentono flessibilità nella progettazione sperimentale e molteplici combinazioni di colture cellulari. Per convalidare questi inserti stampati in 3D come modello per le co-colture, la proliferazione cellulare e la migrazione cellulare sono state analizzate e confrontate con lo studio precedente utilizzando terreni condizionati⁸. In entrambi gli studi, il test di guarigione della ferita è stato eseguito utilizzando un dispositivo a due camere di migrazione (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) posizionato nel pozzetto contenente o non contenente l'inserto. Questo dispositivo per test di migrazione 9,10 si differenzia dai saggi scratch^11,12 per il fatto che l'impronta lasciata dalla parete (che simula la ferita) che delimita le due camere è costante. Pertanto, è altamente riproducibile. I risultati del presente studio hanno portato a una conclusione simile rispetto agli esperimenti sui media condizionati. Gli inserti stampati in 3D non alterano il comportamento cellulare e sono adattati per realizzare rivestimenti di compartimenti indipendenti che promuovono l'aderenza cellulare. Tuttavia, gli inserti stampati in 3D consentono anche di realizzare un rivestimento con poli-HEMA, ad esempio, per indurre un basso attacco per la coltura dello sferoide/organoide. La comunicazione indiretta tra HDMEC e KORS è stata qui studiata come esempio delle molteplici applicazioni fornite dagli inserti stampati in 3D.

Applicabile a tipi di cellule aderenti che richiedono o meno un rivestimento specifico, questo nuovo dispositivo consente un notevole risparmio di tempo per la creazione del modello di co-coltura. Infatti, i quattro compartimenti degli inserti stampati in 3D consentono la coltura di più tipi di cellule in monostrato o in 3D (aggregati o sferoidi) nello stesso pozzetto con diverse combinazioni. Ad esempio, è possibile analizzare la comunicazione indiretta di quattro tipi di cellule in monostrato, in 3D (sferoidi) o una combinazione di entrambi. Durante gli esperimenti, gli sferoidi sono stati coltivati negli inserti stampati in 3D utilizzando un rivestimento in poli-HEMA (dati non mostrati). Gli sferoidi consistevano in cellule seminate in 3D a causa della piastra di legame a basso attacco e trasferite dopo 48 ore all'inserto stampato in 3D per le analisi. Dopo diversi giorni di coltura, è stata osservata la crescita degli sferoidi. Questi risultati dimostrano che l'inserto stampato in 3D può essere utilizzato per seguire la crescita cellulare 3D dopo il trasferimento degli sferoidi allo stesso modo di una piastra di coltura^13,14. Inoltre, un mix di diversi tipi di cellule può essere messo insieme nello stesso compartimento in 2D o 3D (organoidi) per studiare la comunicazione cellulare sia diretta che indiretta. Infatti, l'ampia gamma di modularità offerta dagli inserti stampati in 3D caratterizza questo innovativo sistema di co-coltura cellulare. Inoltre, la presenza delle finestre di comunicazione consente l'utilizzo in un mezzo comune per tutti i tipi di cellule in un momento selezionato senza l'assistenza di mezzi condizionati. Pertanto, questa tecnica non è applicabile alle cellule coltivate in sospensione. Le pareti che separano i quattro compartimenti consentono la semina, la raccolta e l'analisi di ciascun tipo di cellula indipendentemente dagli altri. Diverse applicazioni potrebbero essere fatte, come i saggi di formazione di pseudotubi e la proliferazione, la migrazione, il DNA, l'RNA, le proteine e altre analisi. Gli inserti stampati in 3D offrono anche la possibilità di analizzare, ad esempio, l'effetto di molecole o vescicole extracellulari. Inoltre, il fatto che questi inserti siano stati realizzati con la stampa 3D offre numerose possibilità per la disposizione dei compartimenti e numerosi saggi funzionali.

Tuttavia, la fase critica della sigillatura dell'inserto stampato in 3D nella piastra deve essere considerata attentamente. Infatti, una ripartizione omogenea del silicio è fondamentale per garantire la tenuta e per prevenire la fuoriuscita del terreno di coltura cellulare o delle cellule da un compartimento all'altro. Per evitare problemi, è necessario assicurarsi che il silicone copra la parte degli inserti stampati in 3D che sarà a contatto con la piastra. Prima di seminare le cellule, è necessario verificare la corretta sigillatura aggiungendo il terreno di coltura cellulare in un compartimento e osservando l'assenza di perdite di terreno negli altri compartimenti. Anche il tempo di essiccazione del silicio dopo l'incubazione nel bagno di etanolo al 70% è un passaggio critico. In effetti, le tracce rimanenti di alcol potrebbero portare alla fissazione cellulare e alla tossicità. Per evitare problemi, è necessario rispettare il tempo di asciugatura.

Per concludere, gli inserti stampati in 3D sono compatibili con la maggior parte dei tipi di cellule aderenti per la coltura in 2D o 3D e consentono numerosi metodi di sperimentazione. Possono essere adattati per numerosi studi di co-coltura e possono fornire un nuovo strumento per studiare la comunicazione cellulare indiretta. Gli inserti stampati in 3D sono modulabili, flessibili, scalabili e possono essere utilizzati per progettare modelli sperimentali per studi di fisiopatologie come la cancerologia, l'immunologia o l'angiogenesi.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo studio è stato realizzato in collaborazione con BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre è un borsista di dottorato finanziato da BASF / CNRS.

Ringraziamo il Sig. Mehdi Sellami per l'ideazione degli inserti stampati in 3D.