Трехмерная культура васкуляризированной термогенной жировой ткани из микрососудистых фрагментов

Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий использование микрососудистых фрагментов, выделенных из жировой ткани грызунов или человека, в качестве простого подхода к созданию функциональной, васкуляризированной бежевой жировой ткани.

Инженерная термогенная жировая ткань (например, бежевые или коричневые жировые ткани) была исследована в качестве потенциальной терапии метаболических заболеваний или для разработки персонализированных микротканей для скрининга здоровья и тестирования лекарств. Современные стратегии часто довольно сложны и не могут точно полностью отразить многоклеточные и функциональные свойства термогенной жировой ткани. Микрососудистые фрагменты, небольшие интактные микрососуды, состоящие из артериол, венул и капилляров, выделенных из жировой ткани, служат единым аутологичным источником клеток, которые обеспечивают васкуляризацию и образование жировой ткани. В данной статье описываются методы оптимизации условий культивирования для получения трехмерных, васкуляризированных и функциональных термогенных жировых тканей из микрососудистых фрагментов, включая протоколы выделения микрососудистых фрагментов из жировой ткани и условий культивирования. Кроме того, обсуждаются лучшие практики, а также методы характеристики сконструированных тканей, а также приводятся результаты образцов микрососудистых фрагментов как грызунов, так и человека. Этот подход может быть использован для понимания и разработки методов лечения ожирения и метаболических заболеваний.

Целью этого протокола является описание подхода к развитию васкуляризированной бежевой жировой ткани из одного, потенциально аутологичного источника, микрососудистого фрагмента (MVF). Было продемонстрировано, что коричневые и бежевые жировые ткани проявляют полезные свойства, связанные с метаболической регуляцией; Однако небольшой объем этих депо жировой ткани у взрослых ограничивает потенциальное влияние на системный метаболизм, особенно при таких болезненных состояниях, как ожирение или диабет 2 типа 1,2,3,4,5,6,7. Существует значительный интерес к коричнево-бежевому жиру как терапевтической мишени для предотвращения вредных метаболических эффектов, связанных с ожирением и сопутствующими заболеваниями 8,9,10,11,12.

MVF представляют собой сосудистые структуры, которые могут быть непосредственно изолированы от жировой ткани, культивированы и поддерживаться в трехмерной конфигурации в течение длительных периодов времени^13,14,15. Предыдущая работа нашей группы и других ученых начала использовать многоклеточную и мультипотентную способность MVF, особенно в том, что касается образования жировой ткани^16,17,18. В качестве наращивания этой работы мы недавно продемонстрировали, что MVF, полученные из моделей грызунов здорового диабета и диабета 2 типа¹⁹ и от людей (взрослых старше 50 лет)²⁰, содержат клетки, способные индуцироваться для образования термогенной или бежевой жировой ткани.

Здесь представлен инновационный подход, в котором используется MVF из одного источника, способный не только создавать бежевую жировую ткань, но и связанный с ней и критический сосудистый компонент²¹. Использование этого метода может иметь большое значение для исследований, ищущих простой тканеинженерный подход к образованию термогенной жировой ткани. В отличие от других методов, направленных на создание бежевой жировой ткани 22,23,24,25,26,27,28, процесс, описанный в этом исследовании^, не требует использования нескольких типов клеток или сложных схем индукции. Васкуляризированные модели бежевого и белого жира могут быть созданы с помощью MVF, происходящих от грызунов и людей, демонстрируя большой потенциал перевода. Конечным продуктом этого протокола является сконструированная бежевая термогенная жировая ткань со структурой и метаболической функцией, сравнимыми с бурой жировой тканью. В целом, этот протокол представляет идею о том, что легкодоступный и, возможно, аутологичный источник MVF может быть полезным терапевтическим вмешательством и инструментом для изучения метаболических нарушений.

Это исследование было проведено в соответствии с Законом о благополучии животных и Положениями о благополучии животных в соответствии с принципами Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при Техасском университете в Сан-Антонио.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов, описанных ниже, используются самцы крыс Льюиса. Небольшие корректировки протокола должны быть сделаны для коллекции микрососудистых фрагментов (MVF) женского пола, а также мыши²⁹. Для протоколов, использующих человеческие MVF (h-MVF), единственными необходимыми шагами являются ресуспендирование h-MVF в соответствии с протоколом производителя, подготовка питательной среды (1.3), образование фибриновых гидрогелей (5) и культивирование (6). Обзор протокола приведен на рисунке 1.

Рисунок 1: Схема эксперимента. Разбивка на шесть ключевых этапов перед анализом для формирования термогенной жировой ткани с использованием MVF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Приготовление реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже реагенты соответствуют одной крысе, взвешенной и изготовленной внутри биокапюшона.

1. Приготовьте бычий сывороточный альбумин (BSA) в PBS.
   1. Приготовьте 10 мг / мл (1,0%) BSA в PBS для разбавления для этапов промывки (1 мг / мл, 0,1%) и разложения (4 мг / мл, 0,4%).
   2. Приготовьте различные концентрации BSA, как указано в шаге 1.1.1, следуя этапам 1.1.3-1.1.5.
   3. 10 мг/мл BSA в PBS (1% BSA в PBS)
      1. Добавьте 500 мг BSA и 500 мл PBS в коническую пробирку объемом 50 мл и встряхните раствор для растворения BSA.
      2. Если образуются чрезмерные пузырьки, центрифугируйте раствор при 350 х г в течение 2 мин. Фильтр стерилизует раствор с помощью нейлонового сетчатого фильтра 0,22 мкм.
   4. 1 мг/мл BSA в PBS (0,1% BSA в PBS)
      1. Разбавьте 15 мл 10 мг / мл BSA в PBS 1: 10 с PBS, добавив 15 мл 10 мг / мл BSA в PBS к 135 мл PBS в стерильной бутылке объемом 500 мл и осторожно встряхните бутылку, чтобы обеспечить однородную смесь.
   5. 4 мг/мл BSA в PBS (0,4% BSA в PBS)
      1. Разбавьте 35 мл 10 мг / мл BSA в PBS 1: 2,5 с PBS, добавив 35 мл 10 мг / мл BSA в PBS + 57,5 мл PBS в стерильной бутылке объемом 100 мл и осторожно встряхните бутылку, чтобы обеспечить однородную смесь.
2. Подготовьте коллагеназу в BSA для переваривания измельченных жировых комков.
   1. Приготовьте коллагеназу 6 мг/мл.
      1. В конической пробирке объемом 50 мл взвесьте 72 мг коллагеназы (метка «для Epi»).
      2. В трех конических пробирках по 50 мл взвесьте 144 мг коллагеназы (метка «для Ing 1», «для Ing 2» и «для SubQ») каждая.
      3. Храните взвешенную коллагеназу при температуре 4 °C до использования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте BSA/PBS до самого начала пищеварения.
      4. Добавьте 12 мл 4 мг / мл BSA в PBS в пробирку, содержащую 72 мг коллагеназы.
      5. Добавьте 24 мл 4 мг / мл BSA в PBS в пробирки, содержащие 144 мг коллагеназы.
      6. Встряхните пробирки, чтобы получить однородный раствор, и стерилизуйте раствор с помощью нейлонового сетчатого фильтра 0,22 мкм.
3. Подготовьте питательные среды с добавлением аминокапроновой кислоты (ACA) для подачи/дифференциации выделенного MVF.
   1. Питательные среды (ГМ): Дополните DMEM 20% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин (пер-стрептококк), 0,2% микоплазменного профилактического средства и 1 мг / мл ACA.
   2. Подготовьте белые адипогенные среды (WAM).
      1. Индукция WAM: Дополняйте DMEM/F12 20% FBS, 1% стрептококка ручки, 0,2% профилактического средства от микоплазмы, инсулина 10 мкг/мл, форсколина 10 мкм, дексаметазона 1 мкм и 1 мг/мл ACA.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для h-MVF, кроме того, добавьте 125 мкМ индометацина.
      2. Поддержка WAM: Дополняйте DMEM/F12 20% FBS, 1% стерептококка, 0,2% микоплазменного профилактического средства, 5 мкг/мл инсулина и 1 мг/мл ACA.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для h-MVF измените концентрацию инсулина до 10 мкг / мл.
   3. Подготовьте бежевую адипогенную среду (БАМ).
      1. Индукция БАМа: Дополните DMEM/F12 20% FBS, 1% стрептококка ручки, 0,2% профилактического средства для микоплазмы, инсулина 10 мкг/мл, форсколина 10 мкм, 1 мкм дексаметазона, 1 мкм росиглитазона, 20 нМ 3,3′,5-трийодо-L-тиронина (Т3) и 1 мг/мл ACA.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для h-MVF измените концентрацию T3 на 120 нМ.
      2. Поддержание БАМа: Дополняйте DMEM/F12 20% FBS, 1% PEN-стрептококка, 0,2% профилактического средства от микоплазмы, 5 мкг/мл инсулина, 10 мкм форсколина, 1 мкм росиглитазона, 20 нМ T3 и 1 мг/мл ACA.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для h-MVF измените концентрацию инсулина на 10 мкг / мл и концентрацию T3 на 120 нМ.
4. Подготовьте тромбин (его нужно принимать только в том случае, если исходный аликвотированный раствор недоступен), чтобы сделать свертывающий агент, который будет использоваться в фибриновых гелях.
   1. 10 ЕД/мл тромбина в ddH₂O:
      1. Ресуспендировать порошок тромбина, используя 1-5 мл ddH₂O во флаконе от производителя, и перенести ресуспендирование в стакан объемом 250 мл.
      2. Доведите раствор до 100 мл и запипейте раствор пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить однородную смесь. Аликвотируйте раствор в конические пробирки объемом 15 мл (~ 10 мл / пробирка) и храните аликвоты в морозильной камере при температуре -20 ° C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием разморозьте тромбин при комнатной температуре (RT).

2. Подготовка инструмента/материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все контрольно-измерительные приборы должны быть автоклавированы/стерилизованы перед использованием.

1. Выделение придатка яичка/пахового/подкожно-жировой клетчатки (операция проводится в определенной хирургической области)
   1. Обеспечьте наличие одноразовых пеленок, двух ножниц, одного гемостата (опционально), двух щипцов и четырех конических трубок объемом 50 мл с 10-15 мл 1 мг/мл BSA (0,1%) в PBS.
2. Выделение микрососудистых фрагментов
   1. Для фарша (проводимого в биовытяжке) обеспечьте наличие трех стерильных чашек Петри диаметром 100 мм без покрытия, одной пары щипцов и одной пары изогнутых ножниц.
   2. Для пищеварения и изоляции (должно быть сделано в биовытяжке) обеспечьте наличие одной пары ножниц, одной пары щипцов, восьми стерильных чашек Петри без покрытия 100 мм, трех стерильных чашек Петри без покрытия 35 мм, взвешенных коллагеназы и при 4 °C, четырех колб по 250 мл, одного пластикового держателя с отверстием в центре, четырех экранов по 500 мкМ (разрезанных на 3 закругленных квадрата), четыре экрана по 37 мкМ (разрезанные на 3 закругленных квадрата) и 11 конических трубок по 50 мл.
3. Ресуспендирование фибрина
   1. Для фибриновых гидрогелей (которые должны быть сделаны в биовытяжке) убедитесь, что доступны фибриноген, тромбин и питательные среды (полученные во время приготовления реагента).

3. Протокол выделения жира

1. Предварительные шаги
   1. Наполните стакан этанолом, чтобы вымыть и продезинфицировать хирургические инструменты перед их использованием. Затем подготовьте стол для работы с крысой и подготовьте пылесос для аспирации меха, образующегося на этапе бритья.
   2. Подготовьте ведро со льдом, куда будут помещены предварительно подготовленные конические пробирки объемом 50 мл, каждая из которых содержит 10 мл 1 мг/мл BSA. Маркируйте тюбики соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться две отдельные конические трубки для пахового жира, так как необходимо извлечь две стороны, и количество жира, собранного в этой области, как правило, самое большое по сравнению с придатком яичка и задней подкожной клетчаткой.
   3. Начните с усыпленной крысы в определенной хирургической области с необходимыми хирургическими инструментами. Как правило, CO₂ используется для эвтаназии крыс в соответствии с протоколами IACUC.
   4. Используя машинки для стрижки волос, побрейте крысу вокруг интересующей области. В частности, бритье между пахом и половиной живота для изоляции придатка яичка и пахового жира (используйте бритву меньшего размера для меха в этой области). Побрейте всю спину, чтобы получить задний подкожный жир, расположенный между лопатками (лучше всего использовать бритву большего размера, так как мех на задней стороне крысы толще).
   5. Асептически подготовьте крысу, опрыскав ее 70% этанолом. Как правило, рекомендуется очищать участок, который будет разрезаться, дважды.
2. Изоляция различных жировых депо
   1. Паховая (подкожная)
      1. В положении лежа на спине поднимите кожу ниже полового члена ножницами. Начните разрез ножницами, начиная с центра и разрезая сбоку, образуя V-образную форму и петляя к задней части крысы, чтобы получить доступ ко всему жировому депо. Не забывайте резать поверхностно, чтобы жир внизу был целым. На этапе резки обеспечьте отделение кожи от жира, разрезав взаимосвязанную ткань фасции (рис. 2А).
      2. После того, как фасция будет соответствующим образом разрезана, убедитесь, что две стороны пахового жира видны (паховый жир простирается от паховой области к спине). Затем удалите жир с двух сторон в две отдельные конические пробирки, содержащие 10 мл 1 мг / мл BSA (рис. 2B).
   2. Придаток яичка (висцеральный)
      1. Соберите жир из придатка яичка, разрезав кожу живота и осторожно продев тонкий слой, окружающий яички (рис. 2C).
      2. Щипцами аккуратно вытащите жировую ткань и вырежьте ее с помощью ножниц. Избегайте рассечения каких-либо основных видимых кровеносных сосудов (если яичко и придаток яичка будут собраны, удалите их на этапе очистки биокапюшона).
      3. Осторожно поместите удаленный жир в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл 1 мг / мл BSA в PBS.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление жира в придатке яичка должно быть выполнено после удаления пахового жира. Жир придатка яичка, как правило, меньше по объему и расположен ниже пахового жира, ниже кожи живота, окружающей яичко и придаток яичка.
   3. Задняя подкожная
      1. Переверните крысу лежа спинной стороной вверх и, используя большие ножницы, разрежьте кожу спины (кожа в этой области толстая) до самой головы, стараясь не резать слишком глубоко, чуть ниже кожи (рис. 2D).
      2. Разрежьте фасцию, соединяющую кожу с тканями; Жир располагается в межлопаточной области. Сделайте заметку, чтобы дифференцировать / отделить подкожный жир от бурого жира. Бурый жир находится ближе к позвоночнику (рис. 2E).
      3. Изолируйте и поместите жир в соответствующую коническую пробирку (пробирки) объемом 50 мл с 10 мл 1 мг/мл BSA в PBS.

Рисунок 2: Выделение различных депо жировой ткани. (А) Начальные разрезы, необходимые для иссечения паховой жировой ткани. (B) Местонахождение пахового жирового депо. (C) Расположение жирового депо придатка яичка с указанием разреза наружной кожи, необходимого для доступа. (D) Дополнительные разрезы, необходимые после того, как мыши помещены в положение склонных к доступу к дополнительному жиру. (E) Расположение заднего подкожно-жирового депо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Протокол выделения микрососудистых фрагментов

1. Поместите коническую пробирку (пробирки) объемом 50 мл, содержащую удаленный жир от крысы, в биокапюшон.
2. Используя щипцы, поместите жир в стандартную чашку Петри диаметром 100 мм (с ~ 0,5 мл 1 мг / мл BSA в PBS, чтобы сохранить ткань увлажненной).
3. Очистите и удалите все видимые кровеносные сосуды и мышечные / посторонние ткани из жира.
4. Измельчите жир ножницами в течение ~ 10 минут (пропустите через мясорубку достаточно, чтобы его можно было перенести пипеткой объемом 10 мл).
5. Проверьте наличие комков, добавив ~ 0,5 мл 1 мг / мл BSA в PBS; При необходимости продолжайте фарш.
6. Переложите измельченный жир в стерильную колбу объемом 250 мл с помощью пипетки объемом 10 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на громкость с помощью пипетки.
7. Добавьте достаточное количество BSA (1 мг / мл), чтобы конечный объем составил 20 мл.
8. Добавьте 4 мг/мл BSA в PBS к коллагеназе (конечная концентрация коллагеназы: 6 мг/мл) (т. е. 12 мл для 72 мг коллагеназы или 24 мл для 144 мг коллагеназы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте, пока фарш не будет завершен, так как он чувствителен ко времени.
9. Осторожно встряхните коническую трубку, чтобы обеспечить однородный раствор, и фильтруйте раствор с помощью нейлонового сетчатого фильтра 0,22 мкм.
10. Жир придатка яичка переваривать ~8-10 мин; для пахового и заднего подкожного жира варить в течение ~15-20 мин на водяной бане при температуре 37 °C, встряхивая колбу круговыми движениями (остановитесь в тот момент, когда жир доберется до места, где осталось всего несколько комков).
11. Переложите переваренный жир в коническую пробирку объемом 50 мл (должно быть ~ 30 мл / пробирка) и пометьте пробирку как «переваренный жир».
12. Отжим тюбика при 400 х г в течение 4 мин; после отжима гранула должна быть красного цвета (рис. 3А).
13. Во время отжима поместите стерильный экран 37 мкМ и 500 мкМ в стерильную чашку Петри с 5 мл 1 мг / мл BSA в PBS для предварительного замачивания перед использованием.
14. После отжима сцедите надосадочную жидкость в коническую трубку объемом 50 мл с пометкой «отходы». Аккуратно выполните декантацию, чтобы удалить поверхностный жир и не нарушить гранулы, изготовленные из MVF.
15. Добавьте 10 мл 1 мг/мл BSA в PBS в пробирку, содержащую гранулы («переваренный жир»). Тритурат (пипетка вверх и вниз) гранулы 2x.
16. Избегайте слишком грубой обработки гранул, чтобы не повредить фрагменты.
17. Поместите экран 500 мкМ в новую чашку Петри над пластиковым держателем экрана (рис. 3B).
18. Пипетка 10 мл из пробирки «расщепленные гранулы» через сито 500 мкМ с использованием концентрических кругов (рис. 3C).
19. Промойте фильтр дополнительными 5 мл 1 мг/мл BSA в PBS. Нужные клетки будут просачиваться в чашку Петри; поэтому откажитесь от экрана 500 мкМ, но сохраните отфильтрованную жидкость внутри чашки Петри.
20. Поместите экран 37 мкМ в новую чашку Петри над пластиковым держателем экрана.
21. Замените пипетку, чтобы удалить комки, прежде чем использовать сито 37 мкМ.
22. Пипетируйте жидкость, полученную в результате первой фильтрации, через сито 37 мкМ с помощью концентрических окружностей.
23. Промойте фильтр дополнительными 5 мл 1 мг/мл BSA в PBS. Нужные ячейки останутся в фильтре, поэтому отфильтруйте отфильтрованную жидкость, но сохраните экран 37 мкМ.
24. Вставьте экран 37 мкМ в новую чашку Петри, содержащую 5 мл 1 мг/мл BSA в PBS.
25. Встряхните блюдо, постучав им по коническому держателю, чтобы выбить осколки. Не встряхивайте слишком сильно, так как жидкость / клетки могут вылиться из чашки Петри.
26. Промойте фильтр дополнительными 5 мл 1 мг/мл BSA в PBS. Нужные клетки останутся в жидком растворе в чашке Петри. Сохраните экран 37 мкМ и смещенный фрагмент, содержащий жидкость внутри чашки Петри, для следующих шагов.
27. Переведите фрагмент BSA+, содержащий жидкость, в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
28. Повторите промывку экрана 37 мкМ еще несколько раз (каждый раз с ~ 5 мл 1 мг / мл BSA в PBS) и добавьте в коническую трубку. Повторяйте до тех пор, пока общий объем не составит ~ 15-20 мл. В конечном итоге нужные клетки будут собраны из жидкого раствора в чашке Петри и помещены в коническую трубку; на этом этапе выбросьте сито 37 мкМ после окончательного промывания, но сохраните смещенные фрагменты, содержащие жидкость внутри конической пробирки объемом 50 мл.
29. Отрежьте конец наконечника пипетки объемом 200 мкл с помощью ножниц. Осторожно встряхните пробирку объемом 50 мл, извлеките два образца по 20 мкл и поместите их в чистую чашку Петри диаметром 35 мм.
30. Подсчитайте количество фрагментов в каждом образце в чашке Петри, чтобы получить общее количество выделенных MVF.
    Всего фрагментов =
31. Оставшийся смещенный фрагмент, содержащий жидкость, отжимают в конической пробирке объемом 50 мл при 400 x g в течение 4 мин для сбора MVF.

Рисунок 3: Выделение MVF. (A) После переваривания жировой ткани, изображение разделения MVF, содержащих гранулы и надосадочную жидкость, после отжима. В) Схема снабжения для фильтрации и улавливания МВФ. С) Иллюстрация метода концентрического круга для этапов фильтрации/промывки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Образование фибриновых гидрогелей

1. Примеры расчетов:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены расчеты для MVF, высеваемых при ~ 15 000-20 000 MVF / мл, и соотношении фибриногена: тромбинового геля при 2: 5, при этом фибриноген используется в концентрации 20 мг / мл.
   1. Для изготовления пяти гелей по 250 мкл требуется общий объем 1,250 мкл. Всегда учитывайте ошибки пипетирования, поэтому сделайте достаточно 1,5 мл гелей.
      1. Рассчитайте необходимый объем фибриногена следующим образом:
         , X₁ = 428,57 мкл фибриногена
      2. Рассчитайте необходимый объем тромбина следующим образом:
         , X₂ = 1 071,43 мкл тромбина
      3. Для необходимого объема 428,57 мкл сделайте 500 мкл фибриногена следующим образом:
         20 мг/мл * 0,5 мл = 10 мг фибриногена. Ресуспендировать это в 500 мкл DMEM
      4. Для получения каждого геля рассчитайте объем фибриногена и тромбина следующим образом:
         1. Фибриноген:
            , X₁ = 71,43 мкл фибриногена (в ДМЭМ) + MVF
         2. Тромбин:
            , X₂ = 178,57 мкл тромбина
2. Литье фибринового геля MVF
   1. Сцеживают большую часть жидкости в раскрученном фрагменте в коническую пробирку объемом 50 мл. Используйте пипетку, чтобы удалить небольшой объем жидкости, который зацепился за край конической трубки.
   2. Добавьте тромбин в лунки, где будут образовываться гели (рис. 4А).
   3. Обрежьте конец наконечника пипетки объемом 200 мкл и осторожно ресуспендируйте MVF с помощью фибриногена, чтобы получить окончательную плотность ~ 15 000-20 000 MVF / мл один раз в геле.
   4. Аккуратно закрепите конец наконечника пипетки объемом 200 мкл и пипетки MVF+фибриноген в раствор тромбина. Быстро пипетируйте вверх и вниз, чтобы получить однородную смесь. Повторяйте до тех пор, пока не будут сделаны все гели (рис. 4B).
   5. Поместите лунку (пластины) в инкубатор (37 °C, 5% CO₂) на ~ 15 минут, чтобы обеспечить сшивание геля (рис. 4C).
   6. Добавьте 100-150 мкл питательной среды в каждую лунку.

Рисунок 4: Формирование фибриновых гелей MVF . (A) Смесь тромбина, состоящая из 5/7 частей, вводится пипеткой в соответствующую лунку. (B) Затем с помощью обрезанного наконечника пипетки (чтобы не нарушать MVF) смесь фибриногена + MVF, состоящая из 2/7 частей, пипетка вводится в лунку и осторожно перемешивается. (C) Наконец, все готовые гели помещают в инкубатор при 37 °C, что позволяет гидрогелю полностью затвердеть до того, как среда будет помещена сверху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Условия культивирования МВФ

1. Для культивирования неваскуляризированной белой и бежевой жировой ткани (+ GM Control) используйте временные шкалы¹⁹ , показанные на рисунке 5.
2. Для культивирования васкуляризированной белой и бежевой жировой ткани (+ GM Control) используйте временные шкалы¹⁹ , показанные на рисунке 6.
3. Гидрогели следует выдерживать в инкубаторе (37 °C, 5% CO₂) в течение всего времени посева для исследования, при этом среду меняют через день. Сведения о фиксации и обработке образцов для анализа см. в ранее опубликованных работах^16,19,20.

Рисунок 5: Сроки образования неваскуляризированной жировой ткани. Эта цифра была изменена по сравнению с Acosta et ^al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Сроки образования васкуляризированной жировой ткани. Эта цифра была изменена по сравнению с Acosta et ^al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Существует несколько ключевых фенотипических морфологических характеристик бежевой/бурой жировой ткани: она многолопастная/содержит мелкие липидные капли, обладает большим количеством митохондрий (причина ее характерного «коричневатого» вида in vivo), соответственно имеет высокую скорость потребления кислорода / митохондриальную биоэнергетику, сильно васкуляризирована, имеет повышенное липолиз/инсулин-стимулированное поглощение глюкозы и, что наиболее печально известно, экспрессирует высокие уровни разобщающего белка 1 (UCP1), митохондриального белка, участвующего в термогенном дыхании^19,30.

Соответственно, при характеристике способности МВФ дифференцироваться в бежевую жировую ткань был проведен анализ, который позволил бы визуализировать (рис. 7, рис. 8), генетически подтвердить (рис. 9, рис. 10) и функционально измерить (рис. 11) трансформацию МВФ.

На рисунках 7 и 8 с помощью BODIPY, липидного окрашивания, и визуализации гидрогелей с помощью конфокальной микроскопии визуализация размера и расположения липидов в дифференцированных адипоцитах была замечена^16,17,19. Примечательно, что в этом анализе, особенно по сравнению между состояниями, группы BAM должны демонстрировать меньшие размеры липидов (что свидетельствует о образовании бежевой жировой ткани), поддающиеся количественной оценке с помощью NIH ImageJ^19,20.

При использовании ОТ-кПЦР 16,19,20 на рисунке 9 и рисунке ¹⁰ наиболее характерно то, что экспрессия UCP1 по всем направлениям значительно увеличивается при воздействии МВФ на БАМ.

Наконец, глядя на митохондриальную биоэнергетику (рис. 11), очевидно, что группы BAM имеют характерно более высокие уровни потребления кислорода (OCR), измеренные с помощью стресс-теста Seahorse mito^19,20.

Рисунок 7: Гистологическая оценка r-MVF. Постные или диабетические производные r-MVF 2 типа подвергались воздействию либо прямых (верхняя панель, ADIPO), либо непрямых (нижняя панель, ANGIO + ADIPO) адипогенных сред WAM или BAM для получения неваскуляризированной или васкуляризированной белой или бежевой жировой ткани соответственно (масштабные стержни = 200 мкм). Эта цифра была изменена по сравнению с Acosta et ^al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Гистологическая оценка h-MVF. h-MVF подвергали воздействию прямого (ADIPO) WAM или BAM для получения неваскуляризированной белой или бежевой жировой ткани соответственно (шкалы = 200 мкм). Эта цифра была изменена по сравнению с Gonzalez Porras et ^al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Оценка r-MVF с помощью ОТ-кПЦР. Худой (L) или диабетический (Db) тип 2 производный r-MVF, подвергшийся воздействию (A-C) прямого или (E-G) косвенного WAM или BAM, оценивали на (A, E) адипогенез (адипонектин), (B, F) термогенез (UCP1) и (C, G) ангиогенез (ANGPT1). Результаты представлены как среднее ± стандартной ошибки двух экспериментальных повторений (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 и **** = p < 0,0001. D0 = День 0. Тесты двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с множественным сравнительным анализом Холма-Сидака для определения различий между группами. Статистическая значимость определялась как p < 0,05. Эта цифра была изменена по сравнению с Acosta et ^al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Оценка h-MVF с помощью ОТ-кПЦР. h-MVF, подвергшиеся воздействию прямого WAM или BAM, оценивали на (A) адипогенез (адипонектин) и (B) термогенез (UCP1). Результаты представлены как среднее ± стандартной ошибки двух экспериментальных повторений (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 и **** = p < 0,0001. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с множественным сравнительным анализом Холма-Сидака для определения различий между группами. Статистическая значимость определялась как p < 0,05. Эта цифра была изменена по сравнению с Gonzalez Porras et ^al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Функциональная оценка r-MVF и h-MVF. Постные (L) или диабетические (Db) производные r-MVF, подвергшиеся воздействию (A) прямого или (B) косвенного WAM или BAM или (C) h-MVF, подвергшихся прямому WAM или BAM, оценивались функционально путем измерения скорости потребления кислорода (OCR). Результаты представлены как среднее ± стандартной ошибки двух экспериментальных повторений (n = 4). Эта цифра была изменена по сравнению с Acosta et ^al.19. и Гонсалес Поррас и ^др.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Область коричнево-бежевой жировой тканевой инженерии в значительной степени незрелая 22,23,24,25,26,27,28, при этом основная часть жировых моделей разрабатывается для белой жировой ткани ^8,22,31. Сконструированные коричнево-бежевые микроткани обычно состоят из нескольких клеточных источников или генетических изменений для получения подмножества фенотипических характеристик нативной коричневой жировой ткани ^8,11,32. Подход, описанный в настоящем описании, представляет собой один источник, потенциально аутологичный^18,33 способ создания функционального, структурно значимого и васкуляризированного бежевого жира с использованием микрососудистых фрагментов (MVF). MVF наиболее известны как источник образования белой жировой ткани 14,16,17,1 ^8,34, хотя недавно мы продемонстрировали их способность к образованию бежевого жира из источников грызунов, человека и больных, как показано здесь ^19,20. Учитывая значительный интерес к использованию бежевого / бурого жира для его терапевтического или модельного потенциала, этот метод имеет далеко идущие приложения в области обмена веществ, ожирения и связанных с ним расстройств.

В протоколе описано несколько ключевых моментов. Во-первых, существуют различия между использованием крысиных и человеческих MVF. Использование грызунов (мышей 29 или крыс) до сих пор в значительной степени доминировало в исследованиях с MVF, при этом работа рассматривала их во множестве состояний, таких как ожирение³⁵, диабет 1 типа 36,37^, диабет 2 типа¹⁹ и старение 38, и даже различия между жировыми депо ³⁹ или полом ⁴⁰. Хотя MVF, учитывая их происхождение, могут быть изолированы аутологически из подкожных жировых депо взрослых с использованием стандартных минимально инвазивных процедур⁴¹, васкуляризация на основе MVF не проводилась в клинической практике. Однако доклинические исследования, в которых человеческие MVF были собраны из липоаспирата, продемонстрировали его возможность^18,33. В частности, для нашей группы, как показано в репрезентативных данных, образование васкуляризированной бежевой жировой ткани в настоящее время ограничено MVF, полученными от грызунов. Как ранее было продемонстрировано нашей группой и другими¹⁸, получение баланса роста сосудов и дифференцировки адипоцитов является высокочувствительным, доказано, что оно зависит от введенных^{факторов 42}, и дифференцировка временных точек провоцируется¹⁶. Ограничением описанного протокола является то, что необходима дальнейшая разработка для оптимизации условий, способствующих образованию васкуляризированной бежевой жировой ткани h-MVF. Кроме того, необходима дальнейшая работа, изучающая реакцию этих скаффолдов in vivo и вытекающих из других болезненных состояний, а также соответствующие шаги по оптимизации.

Кроме того, здесь описан протокол выделения r-MVF из трех различных депо жировой ткани у самцов крыс. В предыдущей работе Später et ^al.39 обсуждались различия между васкуляризирующей способностью висцеральных и подкожных депо-производных MVF, отмечая, что подкожные депо-MVF имели пониженную способность к васкуляризации, особенность, которую они приписывали избыточному загрязнению соединительной ткани. Следует отметить, что для наших исследований, представленных здесь в «репрезентативных данных», использовались только паховые подкожные и задние подкожные депо. Выбор в пользу использования исключительно подкожных MVF был сделан для более точной имитации трансляционных исследований, в которых липоаспират или аналогичные процедуры собирают исключительно подкожную жировую ткань. Кроме того, тот факт, что исследования in vivo с точным определением бежевой жировой ткани развиваются в подкожной жировой ткани, которая содержит отчетливое подмножество преадипоцитов или белых адипоцитов, которые трансдифференцируются, обеспечил дальнейшее обоснование нашего решения⁴³. Предыдущая работа нашей группы не показала заметных различий между MVF, происходящими из висцеральных или подкожных депо здоровых грызунов, которые подвергаются как ангиогенезу, так и образованию белой жировой ткани¹⁶. Все эти переменные следует учитывать при разработке будущих исследований.

Наконец, при попытке изменить или устранить неполадки описанного метода следует обсудить несколько важных моментов. Во-первых, чрезвычайно важен этап ферментативного переваривания жировой ткани; Следует проявлять особую осторожность и обеспечивать оптимизацию для последовательного воспроизведения MVF аналогичного размера и качества. Учитывая большие различия между типами жиров и объемами жира (в значительной степени зависящие от возраста, размера, здоровья и осторожности животных, применяемых во время выделения жира [избегание загрязняющих веществ и эффективность экстракции]), время переваривания может варьироваться, поэтому предоставляются диапазоны, которые лучше всего подходят для нашего оборудования / животных. Тем не менее, для достижения оптимальных результатов следует рассмотреть возможность настройки. Кроме того, при обращении с MVF во время постферментативного пищеварения следует соблюдать особую осторожность, чтобы избежать ненужной шероховатости и дальнейшего разрушения фрагментов. Наконец, следует знать, что составы сред, гидрогель по выбору⁴⁴ и условия культивирования легко настраиваются в зависимости от предполагаемых результатов. Как показано здесь, MVF, полученные из разных источников (например, постные и диабетические MVF), имеют разную степень дифференциации, поэтому при разработке экспериментов следует включать надлежащий контроль и экспериментальные группы.

В заключение, по мере роста области инженерии термогенной жировой ткани крайне важно создавать биологически значимые системы, которые структурно, генетически и функционально имитируют нативную бежевую / коричневую жировую ткань. MVF представляют собой захватывающий и уникальный подход к этой проблеме, поскольку они, как описано здесь, обеспечивают простой метод единственного источника для создания биологических имитаций бежевого жира. Таким образом, они обладают значительным потенциалом для использования понимания или разработки методов лечения ожирения и метаболических заболеваний.

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Доктор Акоста поддерживается грантами Национального института здравоохранения CA148724 и TL1TR002647. Доктор Гонсалес Поррас поддерживается Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек Национального института здравоохранения под номером F32-0DK122754. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (5SC1DK122578) и Техасским университетом в Сан-Антонио. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Фигуры были частично созданы с помощью Biorender.com.