Method Article
Протокол позволяет генерировать чистую популяцию адипоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Ретиноевая кислота используется для дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые используются для производства адипоцитов. Затем для получения чистых адипоцитов используется подход сортировки, основанный на окрашивании Нила в красный цвет.
Последние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволили генерировать различные типы клеток, включая адипоциты. Однако современные методы дифференцировки имеют низкую эффективность и не дают однородной популяции адипоцитов. Здесь мы обходим эту проблему, используя полностью транс-ретиноевый метод для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с высоким выходом. Регулируя пути, регулирующие пролиферацию, выживание и адгезию клеток, наша стратегия дифференцировки позволяет эффективно генерировать эмбриональные тела (БЭ), которые дифференцируются в чистую популяцию мультипотентных МСК. Большое количество МСК, генерируемых этим методом, является идеальным источником для генерации адипоцитов. Однако гетерогенность образца в результате дифференцировки адипоцитов остается проблемой. Поэтому мы использовали метод очистки липидсодержащих зрелых адипоцитов на основе нильского краса с помощью FACS. Эта стратегия сортировки позволила нам установить надежный способ моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами, с использованием пула адипоцитов с уменьшенной гетерогенностью образца и улучшенной функциональностью клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) действуют как эффективный транзиторный ресурс для производства клеток мезодермального происхождения, таких как адипоциты, остеоциты и хондроциты, которые в дальнейшем могут быть использованы для моделирования соответствующих генетических нарушений. Однако предыдущие подходы основывались на получении этих МСК из тканей взрослого человека 1, что создавало проблему получения их в больших количествах от доноров и ограничение их функциональной жизнеспособности в неоптимальных условиях культивирования in vitro 1,2. Эти препятствия породили большой спрос на протокол для генерации МСК in vitro. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) могут быть использованы в качестве ценного источника МСК, проявляя характеристикиМСК 3,4,5. МСК, полученные из ИПСК, могут использоваться в качестве терапевтического варианта при нескольких заболеваниях. Кроме того, способность МСК, полученных из ИПСК, генерировать адипоциты, делает их ценной моделью человека in vitro для изучения адипогенеза человека, ожирения и заболеваний, связанных с адипоцитами.
Современные протоколы дифференцировки адипоцитов можно разделить на две группы, одна из которых включает дифференцировку адипоцитов с использованием химических или белковых коктейлей, дающих результирующий выход 30%-60%6,7,8,9, а другая включает генетические манипуляции для надежной индукции ключевых факторов транскрипции, регулирующих развитие адипоцитов, чтобы дать выход 80%-90%10, 11. Однако генетические манипуляции не повторяют естественный процесс дифференцировки адипоцитов и часто маскируют тонкие парадигмы, возникающие во время адипогенеза, что делает его неэффективным для целей моделирования заболеваний12,13. Таким образом, мы представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов от незрелых путем флуоресцентной маркировки липидсодержащих адипоцитов с использованием нильского красного.
Здесь мы представляем протокол, включающий транзиторную инкубацию эмбриоидных тел (БЭ), полученных из ИПСК, с полностью транс-ретиноевой кислотой для получения большого количества быстро пролиферирующих МСК, которые в дальнейшем могут быть использованы для получения адипоцитов14. Мы также представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов из пула гетерогенной дифференцировки путем флуоресцентной маркировки их липидных капель с использованием липофильного красителя; Нил красный. Это позволило бы создать чистую популяцию зрелых адипоцитов с расширенной функциональностью для точного моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами.
Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) HMC (No 16260/16) и QBRI (No 2016-003). Эта работа также оптимизирована для hESCs, таких как H1 и H9. Образцы крови были получены от здоровых людей с полного информированного согласия. ИПСК генерируются из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здоровых людей.
1. Культивирование и поддержание ИПСК
2. Дифференциация ИПСК в МСК
3. Проточный цитометрический анализ МСК, полученных из ИПСК
ПРИМЕЧАНИЕ: После прохождения 2-3 пассажей следует получить доступ к клеткам для эффективности дифференцировки МСК. Дифференцировка будет считаться успешной, если клетки экспрессируют маркеры дифференцировки МСК - CD44, CD73, CD90 и CD105 с эффективностью более 90% и не экспрессируют высокие уровни гемопоэтических маркеров - CD14, CD19, CD34 и CD45. Об эффективности этих маркеров можно узнать, выполнив следующие действия.
4. Дифференцировка МСК в адипоциты
5. Оценка эффективности дифференцировки адипоцитов
6. Сортировка адипоцитов с помощью нильского красного
Схема и морфология клеток во время мезенхимальной дифференцировки: Дифференцировка ИПСК в МСК включает в себя различные стадии развития, охватывающие образование БЭ, дифференцировку МСК и экспансию МСК (рис. 1). На этих стадиях развития клетки приобретают различную морфологию из-за различных стимулирующих химических веществ, которым они подвергаются. После начала дифференцировки клетки покрываются суспензией и, как ожидается, будут круглыми, с определенными границами клеток, но при этом будут иметь малый или средний размер в диаметре (рис. 2). Выбор культивирующих клеток в суспензии во время начальной фазы дифференцировки позволяет ей очень напоминать процесс естественного эмбрионального развития, что делает эту фазу очень важной для успешной дифференцировки. Фаза формирования ЭБ и обработки РА сопровождается нанесением ЭБ на пластины с матричным покрытием базальной мембраны. Жизнеспособность ЭБ после нанесения покрытия может быть достигнута путем наблюдения за их поведением быстрой пролиферации, приводящим к появлению большего количества МСК (рис. 2). Это быстрое пролиферативное поведение, демонстрируемое МСК, сохраняется даже после того, как они переносятся на свежие пластины с матричным покрытием вместе с сохранением своеобразной, удлиненной морфологии (рис. 2).
Количественная оценка поверхностных маркеров МСК: Эффективность дифференциации МСК достигается путем количественного определения поверхностных маркеров, специфичных для дифференциации МСК. Хорошая дифференцировка, дающая надежные МСК, должна показывать более чем 90% эффективность мезенхимальных поверхностных маркеров CD73, CD44 и CD90 (рис. 3A). Кроме того, клетки также оцениваются на отсутствие поверхностных маркеров, изображающих гемопоэтический фенотип, CD14, CD34 и CD19, и, следовательно, ожидается, что эффективность экспрессии для них составит менее 1% (рис. 3B).
Дифференцировка МСК в адипоциты: Дифференцировка МСК в адипоциты может быть достигнута путем окрашивания на FABP4 и адипонектин. FABP4 представляет собой цитоплазматический белок и рассматривается как маркер терминально дифференцированных адипоцитов. Его высокая экспрессия среди адипоцитов с цитоплазматическим распределением является ключевым признаком их зрелости развития (рис. 4А). В дополнение к FABP4 адипонектин рассматривается как один из важных маркеров зрелости адипоцитов. Его высокая экспрессия указывает на то, что адипоциты достаточно функциональны для накопления липидов и адипогенеза в ответ на передачу сигналов глюкозы. Будучи секреторным белком, адипонектин проявляет глобулярную морфологию, причем каждая белковая глобула легко различима в цитоплазме (рис. 4B).
Окрашивание и сортировка зрелых адипоцитов с использованием нильского красного: При дифференцировке зрелые адипоциты можно отличить от их незрелых аналогов путем окрашивания в нильский красный. Нильский красный связывается с липидосодержащими адипоцитами, что характерно исключительно для зрелых адипоцитов (рис. 5А). Это, наряду с флуоресцентным подшипником, характерным для нильского красного, делает его эффективным инструментом для сортировки зрелых адипоцитов с использованием флуоресцентной активированной проточной цитометрии (рис. 5B). Эффективная сортировка должна приводить к увеличению маркеров созревания — PPARG, C/EBPA и FABP4 — как минимум в два раза, что определяется с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) (рис.5C).
Рисунок 1: Принципиальная схема, показывающая дифференцировку ИПСК на МСК и адипоциты. ИПСК дифференцируются в МСК с использованием метода эмбриоидного тела (БЭ). ЭБ подвергаются кратковременному воздействию 10 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА). Сгенерированные МСК дифференцируются в 40%-77% адипоцитов на основе линии iPSC. Нильские красные положительные клетки сортируются с помощью FACS для получения очищенной популяции зрелых адипоцитов, которые могут быть использованы для изучения расстройств, связанных с адипоцитами (моделирование заболеваний), идентификации новых лекарств и, в конечном итоге, для персонализированной терапии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дифференциация ИПСК в МСК. Репрезентативные морфологические изображения, показывающие различные стадии дифференцировки МСК на 2-й (D2), 11-й (D11), 15-й (D15) и 24-й (D24) день. Эмбриоидные тельца (БЭ), полученные в присутствии 10 мкМ РА в течение 24 ч, покрывали на 8-й день дифференцировки с последующей диссоциацией и пассажем через 12-17 дней дифференцировки. МСК проходили несколько раз. Сокращения: П2 = отрывок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия маркеров МСК и гемопоэтических маркеров в МСК, полученных из ИПСК. Репрезентативные гистограммы проточной цитометрии, показывающие экспрессию маркеров МСК, CD73, CD44 и CD90, (A) и гемопоэтических маркеров, CD34, CD19 и CD14 (B) в МСК, полученных из ЭБ, полученных из iPSC, обработанных 10 мкМ РА. Ось X на графике представляет интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Дифференцировка МСК, полученных из iPSC, в адипоциты. Изображения иммуноокрашивания, показывающие экспрессию FABP4 (A) и адипонектина (ADIPO) (B) в зрелых адипоцитах, полученных из ИПСК. Ядра были окрашены Хёхстом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сортировка адипоцитов, полученных из iPSC, с использованием нильского красного. (A) Изображения, показывающие светлое поле (BF) и окрашенные в нильский красный цвет зрелые адипоциты. (B) Количественное определение нильского красного (PE-положительных клеток) в зрелых адипоцитах с использованием FACS. (C) ПЦР-анализ в реальном времени, показывающий экспрессию C/EBPA, FABP4 и PPARG в отсортированных и несортированных зрелых адипоцитах. Данные представлены в виде средних ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол имеет первостепенное значение из-за его способности обеспечивать высокую производительность и эффективность МСК. Это массовое производство МСК стало возможным благодаря переходной инкубации ЭБ, полученных из ИПСК, с 10 мкМ RA14,15. Транзиторная обработка 10 мкМ РА увеличила выход МСК в 11,2-1542 раза в14,15, причем этот протокол применим как к ИПСК, так и к ЧПСК. При такой дозе и продолжительности лечения РА улучшает пролиферативную способность и выживаемость БЭ-образующих клеток за счет прямой или косвенной регуляции экспрессии нескольких генов, участвующих в пролиферации клеток, апоптозе и клеточных адгезиях клетка-клетка и ECM-клетка, которые имеют решающее значение для выживания и пролиферации ИПСК14,16. Гены включают, помимо прочего, факторы транскрипции (такие как EGFR4, SOX4), факторы роста и рецепторы факторов роста (такие как IGF2, FGFR4) и молекулы адгезии (такие как FN1 и CAM). Однако, в отличие от низких доз (0,1-10 мкМ), при высоких дозах (≥20 мкМ) РА отрицательно регулирует пролиферацию и выживание БЭ-образующих клеток, что приводит к уменьшению количества и размера БЭ, полученных из ПСХ, и, следовательно, к снижению выхода МСК14. РА рассматривается как ингибитор пролиферации в нескольких нормальных дифференцированных и раковых клетках17,18,19. При БЭ передача сигналов ретиноидов зависит от контекста (времени, концентрации, вида и клеточной линии); дифференциально влияет на самообновление, выживание и дифференцировку БЭ-образующих клеток, регулируя различные гены и сигнальные пути20,21. Таким образом, использование РА в оптимальное время и в оптимальной концентрации РА-10 мкМ на 3-й день индукции БЭ с последующим снижением дозы до 0,1 мкМ на 5-й день в течение 2 дней, как описано в настоящем протоколе, имеет решающее значение для индуцирования выживания и пролиферации БЭ-образующих клеток.
В дополнение к регулированию роста и выживаемости, РА подвергает обработанные БЭ задержке дифференцировки по сравнению с клетками, не обработанными RA14. Фактически, БЭ, обработанные РА, сохраняют свою компактную форму после нанесения покрытия и не дифференцируются в МСК-подобные клетки, в отличие от БЭ, не обработанных РА. Это согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что кратковременное воздействие лечения РА ингибирует дифференцировку клеток за счет подавления передачи сигналов WNT21. Кроме того, эти обработанные РА клетки с задержкой дифференцировки также показали повышенную экспрессию кадгерина и белков внеклеточного матрикса14, которые, как известно, играют важную роль в поддержании плюрипотентного состояния ИПСК16. Чтобы освободить блок дифференцировки, опосредованный РА, БЭ должны быть диссоциированы, что приводит к нарушению клеточных спаек и обеспечивает долгосрочную дифференцировку МСК после нанесения покрытия. Интересно, что лечение ревматоидного артрита действительно удерживало блок дифференцировки над клетками, но оно не поддерживало клетки в плюрипотентном состоянии. Фактически, EB-образующие клетки, подвергающиеся кратковременному воздействию 10 мкМ RA, демонстрируют значительно сниженную экспрессию ключевых маркеров плюрипотентности - OCT4, SOX2 и NANOG14.
Было показано, что МСК, полученные при краткосрочном лечении РА БЭ, сохраняют свою типичную фибробластоподобную морфологию с обильной экспрессией поверхностных маркеров МСК и их мультипотентностью после криоконсервации, что делает эти массовые МСК пригодными для хранения для долгосрочных исследованийэкспансии 14. Подвергая их адипогенным, хондрогенным и остеогенным условиям дифференцировки, эти МСК могут легко дифференцироваться в три типа мезодермальных клеток, что делает их легко достижимым источником для моделирования заболеваний, связанных с тканями14. Таким образом, стабильное и разностороннее поведение in vitro МСК, генерируемых протоколом дифференцировки, опосредованным РА, придает им первостепенное значение в исследовательских и прикладных условиях.
В то время как хондрогенный и остеогенный дифференцировочные потенциалы МСК, полученных из БЭ, обработанных РА, по-видимому, аналогичны таковым у МСК, полученных из необработанных БЭ, было обнаружено, что первый проявляет повышенный потенциал дифференцировки в адипогенную линию при воздействии условий адипогенной дифференцировки14. Об этом свидетельствует 2-3-кратное увеличение внутриклеточного накопления липидов (окрашивание Oil Red O) и FABP4-положительных клеток адипоцитарного маркера в пуле дифференцировки клеток, полученных после культивирования МСК, полученных из БЭ, обработанных РА, с адипогенными дифференцировочными средами, по сравнению с МСК, полученными из БЭ, не обработанных РА. Это может быть следствием регуляции РА нескольких сигнальных путей, управляющих развитием адипоцитов, таких как пути взаимодействия Hippo, WNT и ECM-клеток, как показали данные секвенирования РНК из обработанных и необработанных РА EB 14,22,23,24,25. Эта повышенная способность МСК, полученных из РА, подвергаться адипогенной дифференцировке ценна, поскольку доступные в настоящее время протоколы либо приводят к низкому выходу адипоцитов, либо используют генетические манипуляции, что делает сгенерированные адипоциты бесценными для получения адипоцитов, рекапитулированных естественным процессом. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и бежевые. Белые адипоциты классифицируются по наличию одной липидной капли и играют роль в накоплении энергии. Принимая во внимание, что коричневые адипоциты участвуют в расходе энергии за счет окисления субстрата из-за очень высокой численности митохондрий, характеризующихся экспрессией UCP1. Принимая во внимание, что коричневые адипоциты, которые локализованы в белой жировой ткани, известны как бежевые или коричневые адипоциты. Эти МСК могут дать обильный выход белых адипоцитов с учетом предварительного воздействия ЭБ на РА. В предыдущих публикациях говорилось о селективной индукции ИПСК в клетки, экспрессирующие низкий уровень UCP1, т.е. белые адипоциты, а не о воздействии RA26 на клетки с высоким уровнем UCP1. В предыдущих публикациях сообщалось, что ревматоидный артрит, продуцируемый из клеток нервного гребня эмбрионов мышей и рыбок данио, играет важную роль в образовании белых адипоцитов27,28.
Несмотря на то, что протокол на основе РА позволил генерировать МСК, которые обеспечивают повышенный выход адипоцитов, достигая 48,5%-77,4% (против 22,5%-57,6% без лечения РА), недостижение >90% по-прежнему проблематично при моделировании многовариантных генетических нарушений на основе адипоцитов in vitro. На самом деле, недостижение чистой популяции адипоцитов может привести к амбивалентным результатам, полученным из многовариантных моделей заболевания, поскольку будет трудно различить, связаны ли наблюдаемые различия в развитии с различными генетическими составами или из-за непоследовательной эффективности дифференцировки. Чтобы обойти эту проблему, было важно отсортировать дифференцированные клетки, чтобы получить пул чистых зрелых адипоцитов, чтобы любые различия в фенотипах можно было отнести только к врожденным генетическим различиям. Несколько исследований выявили поверхностные маркеры на адипоцитах, которые потенциально могут быть использованы для сортировки. Например, работа, проведенная Рональдом Каном, позволила идентифицировать переносчик аминокислот ASC-1 в качестве нового поверхностного маркера на белых адипоцитах29. Кроме того, исследования по извлечению зрелых адипоцитов из сальниковой и подкожной областей показали, что зрелые адипоциты экспрессируют CD34, CD36 и CD59 на своих поверхностях30, где, как сообщается, CD36 функционирует как переносчик жирных кислот на поверхности зрелых адипоцитов31. Однако в этих исследованиях использовались гетерогенные популяции клеток, полученных из жировой ткани, без указания экспрессии этих маркеров только для зрелых популяций адипоцитов. Кроме того, эти маркеры могут также экспрессироваться другими типами клеток и не являются специфическими для адипоцитов. Например, ASC-1 присутствует как на астроцитах, так и на нейронах32, CD34 является маркером гемопоэтических стволовых клеток33CD36 присутствует на тромбоцитах, мононуклеарных фагоцитах, гепатоцитах, миоцитах и некоторых эпителиях33, а CD59 экспрессируется на эндотелиальных и лимфоидных клетках34,35. Поэтому в качестве альтернативного решения в качестве возможного кандидата для сортировки адипоцитов использовался нильский красный, селективное флуоресцентное окрашивание внутриклеточных липидов. Адипоциты хранят значительную часть липидов, которые могут быть высвобождены и использованы для производства энергии, построения мембран или в качестве сигнальных молекул, регулирующих метаболизм36. Краситель нильский красный ранее использовался в проточной цитометрии и микроскопии для окрашивания адипоцитов, полученных из мышиных и человеческих МСК37. В предыдущих исследованиях сообщалось об использовании нильского красного для адипоцитов, полученных из ESC, и усилении маркеров адипоцитов после сортировки38. Адипоциты, полученные из МСК, полученные по настоящему протоколу на основе РА, оценивали на предмет их способности окрашиваться нильским красным цветом, что указывает на их зрелость, и сортировали для их очистки. Эти отсортированные по красному цвету клетки Нила показали двух-трехкратное увеличение экспрессии маркеров созревания адипоцитов, в том числе PPARG, C/EBPAи FABP4 по сравнению с несортированными клетками, что еще больше увеличивает выход адипоцитов, полученных из ИПСК. Хотя эти маркеры экспрессируются до накопления липидов, их экспрессия помечает клетку для терминальной дифференцировки в липидосодержащие адипоциты. Проверка эффективности сортировки по этим маркерам позволяет выявить пул, в котором экспрессируются все ячейки FABP4, CEBPaи PPARg, указывающий на пул, который был предопределен для образования зрелых адипоцитов. Клетки сортируются на основе их способности окрашивать в нильский красный. Эффективность очистки увеличилась в два-три раза за счет большого количества адипоцитов в несортированной фракции. Размер липидсодержащих адипоцитов в значительной степени изменяется во время дифференцировки, когда сортируется пул клеток с одинаковым распределением по размерам. Несортированная фракция включает липидосодержащие адипоциты, но они не являются полностью зрелыми и регулируются различными размерными пропорциями.
Ранее сообщалось о гетерогенности МСК, выделенных из организма человека39. Эта гетерогенность зависит от нескольких факторов, таких как происхождение МСК, доноры и условия39. Это может привести к различиям в их эффективности при лечении различных заболеваний. Это исследование предполагает, что короткая обработка РА ВПСК, полученная в условиях культивирования, совместимых с надлежащей производственной практикой (GMP), даст однородную популяцию МСК. Это указывает на то, что текущий протокол является перспективным подходом для создания большого количества МСК клинического уровня, которые могут быть использованы для терапии на основе МСК.
Комбинация протокола дифференцировки МСК на основе РА, приводящего к дифференцировке адипоцитов, и протокола сортировки нильских красных позволила получить адипоциты, полученные из ИПСК, с усиленной экспрессией функциональных маркеров и повышенным выходом и чистотой. Таким образом, этот комбинированный протокол позволит генерировать в достаточном количестве и чистоте зрелые адипоциты от генетически различных индивидуумов и потенциально раскрывать новые генетические варианты, лежащие в основе метаболических нарушений, связанных с адипоцитами.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Эта работа была профинансирована за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No NPRP10-1221-160041). Марьям Агади получила стипендию GSRA от Катарского национального исследовательского фонда (QNRF).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | MSC differentiation marker |
anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены