Характеристика в пробирке Дифференциация первичных кератиноцитов человека с помощью анализа РНК-Сек

Представлена здесь пошаговая процедура для дифференциации в пробирке первичных кератиноцитов человека путем ингибирования контакта с последующим характеристикой на молекулярном уровне анализом РНК-сек.

Первичные кератиноциты человека часто используются в качестве моделей in vitro для исследований по эпидермальной дифференциации и сопутствующим заболеваниям. Сообщалось о методах дифференциации кератиноцитов в пробирке, обучаемых двумерными (2D) подводными способами с использованием различных условий индукции. Описана здесь процедура 2D в пробирке метод дифференциации кератиноцитов путем ингибирования контакта и последующей молекулярной характеристики РНК-сек. Короче говоря, кератиноциты выращиваются в определенных кератиноцитов среды дополняется факторами роста, пока они полностью стечены. Дифференциация вызвана тесными контактами между кератиноцитами и в дальнейшем стимулируется за счет исключения факторов роста в среде. Используя анализы РНК-сек, показано, что оба дифференцированных кератиноцита обладают различными молекулярными сигнатурами во время дифференциации и 2) динамический шаблон экспрессии генов в значительной степени напоминает клетки во время эпидермального расслоения. Что касается сравнения с нормальной дифференциацией кератиноцитов, то кератиноциты, несущие мутации транскрипционные факторы p63, обладают измененной морфологией и молекулярными сигнатурами, в соответствии с их дефектами дифференциации. В заключение, этот протокол подробно шаги для 2D в пробирке кератиноцитов дифференциации и его молекулярной характеристики, с акцентом на биоинформатический анализ данных РНК-сек. Поскольку процедуры извлечения РНК и РНК-сек хорошо документированы, это не является фокусом этого протокола. Экспериментальная процедура дифференциации кератиноцитов в пробирке и биоинформатического анализа трубопровода может быть использована для изучения молекулярных событий во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

Первичные кератиноциты человека, полученные из кожи человека, часто используются в качестве клеточной модели для изучения^{биологии эпидермиса 1,2,3,4.} Стратификация эпидермиса может быть смоделирована с помощью дифференциации кератиноцитов, либо в 2D погруженном монослойном моде, либо в 3D органотипической^{модели 2,3,5,6,7.} Хотя 3D-модели становятся все более важными для оценки эпидермальной структуры и функции, 2D модели дифференциации по-прежнему широко используются, в связи с их удобством и возможностью генерировать большое количество клеток для анализа.

Различные условия были применены для индуцирования дифференциации кератиноцитов в 2D, в том числе добавление сыворотки, высокая концентрация кальция, более низкая температура и ингибирование рецепторов^{эпидермального фактора роста 2,3}. Каждый из этих методов был проверен рядом генов маркера дифференциации кератиноцитов и показал свою эффективность в оценке дифференциации кератиноцитов, в том числе в патологических условиях. Тем не менее, эти условия индукции также показывают различия в эффективности их дифференциации и кинетики, когда конкретные панели^{маркерных генов рассматриваются 2,3.}

Один из этих методов включает в себя ингибирование контакта кератиноцитов и истощение факторов роста в среде^{культуры 8.} Было показано, что кератиноциты могут дифференцироваться спонтанно, когда клетки достигают полной плотности.  Исключение факторов роста в среде культуры может еще больше усилить дифференциацию. Метод объединения ингибирования контакта и истощения факторов роста было показано для создания дифференцированных кератиноцитов с генными экспрессионными моделями, похожими на нормальный стратифицированный эпидермис при использовании нескольких эпидермальных^{маркеров 3}, предполагая, что эта модель подходит для изучения нормальной дифференциации кератиноцитов. Недавно, два всеобъемлющих анализа экспрессии генов дифференциации кератиноцитов с помощью этой модели были^{зарегистрированы 9,10}. Исследователи проверили эту модель на молекулярном уровне и показали, что она может быть использована для изучения нормальной и больной дифференциации кератиноцитов.

Этот протокол описывает процедуру метода дифференциации in vitro и молекулярного анализа дифференцированных клеток с использованием РНК-сек. Он также иллюстрирует характеристику транскриптома клеток на день дифференциации 0 (стадия распространения), день 2, день 4 и день 7 (ранняя, средняя и поздняя дифференциация, соответственно). Показано, что дифференцированные кератиноциты отображают модели экспрессии генов, которые во многом напоминают клетки во время эпидермального расслоения. Чтобы изучить, может ли этот метод быть использован для изучения патологии кожи, мы применили тот же экспериментальный и анализ трубопровода для исследования кератиноцитов проведения мутаций транскрипционного фактора p63, которые являются производными от пациентов с эктродактически, эктодермальной дисплазии и расщелины губы / неба (EEC)^{синдром 11,12}. Этот протокол фокусируется на дифференциации кератиноцитов в пробирке, а также последующем биоинформатическое анализ РНК-сек. Другие шаги в полной процедуре, такие как экстракция РНК, подготовка образца РНК-сек и строительство библиотеки, хорошо документированы и могут быть легко соблюдены, особенно при использовании многих широко используемых коммерческих комплектов. Таким образом, эти шаги лишь кратко описаны в протоколе. Данные показывают, что этот трубопровод подходит для изучения молекулярных явлений во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

Биопсия кожи была взята из ствола здоровых добровольцев или пациентов с мутациями p63, чтобы создать первичную культуру кератиноцитов. Все процедуры, касающиеся создания первичных кератиноцитов человека, были одобрены комитетом по этике Медицинского центра Университета Радбуда в Неймегене ("Комиссар Менсгебонден Ондерзек Арнем-Неймеген"). Получено информированное согласие.

1. Первичная дифференциация кератиноцитов человека путем ингибирования контакта

1. При необходимости приготовьте среду роста кератиноцитов (KGM) изкератиноцита Базальная среда (таблицаматериалов).
2. Сделать 500 мл распространения среды с использованием заранее подготовленных запасов (KGM-pro; см. таблицу 1).
3. Сделайте 500 мл дифференциации среды (KGM-dif; см. Таблицу 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: KGM с добавками можно держать на 4 C в течение двух недель. Для более длительного хранения, он может быть aliquoted и храниться при -20 градусов по Цельсию.
4. Семена первичных кератиноцитов в плотности 5,0-20 х 10^{3 клетки/см 2, в зависимости}от пролиферативной способности клетки. Добавьте достаточное количество среды KGM-pro для покрытия ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Подробная информация о регулярной культуры клеток в среде KGM можно найти на веб-сайте Lonza¹³. 2) Плотность посева должна быть проверена для каждой клеточной линии. Например, нормальная первичная линия кератиноцитов может быть посеяна при плотности 5,0 х 10³ клетки/см², в то время как линия, несущая мутации в транскрипционные факторы p63, то есть менее пролиферативные должны быть посеяны при плотности 20 х 10³ клеток /^{см 2}. 3) В зависимости от экспериментальной настройки, несколько блюд или колодцев клеток должны быть посеяны, чтобы позволить собирать образцы в разные дни дифференциации в репликах.
5. Освежите клетки с помощью среды KGM-pro в течение двух дней после посева (посев на 0-й день,^{освежающий} в течение 1-го времени на 3-й день). После этого, обновить с KGM-pro среды через день. Регулярно проверяйте клетки, по крайней мере, через день.
6. Индуцировать дифференциацию клеток, когда клетки более чем на 90% стечены путем изменения среды на KGM-dif. День смены среды на KGM-dif определяется как день дифференциации 0. Соберите клетки для дальнейшего анализа РНК, сначала стирая 2x с DPBS, затем добавляя в буфер лиза (из комплекта извлечения РНК).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При вышеупомянутой плотности посева клетки должны достичь слияния в течение 7-10 дней. Клетки могут быть посеяны с более высокой начальной плотностью, чтобы достичь слияния раньше. Если клетки не пролиферативные, более длительное ожидание может не привести к полному слиянию клеток. Может потребоваться более высокая плотность посева.
7. Освежают клетки с помощью среды KGM-dif каждый день и собирают клетки на день дифференциации 2, 4. и 7 для дальнейшей добычи РНК.

2. Добыча РНК

1. Изолировать полную РНК. Это может быть выполнено с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК (например, ymo Быстрый РНК MicroPrep РНК), или с помощью фенола¹⁴. Тем не менее, изоляционный комплект, содержащий лечение DNAse настоятельно рекомендуется для РНК-сек образцов для предотвращения загрязнения ДНК и фенола. Пример коммерческого комплекта для изоляции РНК приведен в таблице материалов.
2. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрометра. И ДНК, и РНК имеют пик поглощения на уровне 260 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Соотношение между абсорбансами на 260 нм и 280 нм используется для оценки чистоты РНК. Соотношение около 2,0, как правило, принято как "чистый" РНК. Если соотношение значительно ниже 2,0, образец может быть загрязнен загрязняющими веществами, которые поглощают на 280 нм, таких как белки, фенолы или другие вещества. 2) Соотношение между абсорбансами на уровне 260 нм и 230 нм измеряет чистоту нуклеиновой кислоты. Ожидается соотношение между 2,0 и 2,2. Если соотношение значительно ниже, образец может быть загрязнен загрязняющими веществами, которые поглощают 230 нм, такими как ЭДТА, этанол или другие вещества.

3. Проверка качества РНК

1. Вы запустите РНК либо на чипе биоанализера РНК Пико для количественной проверки рнк Integrity Number (RIN), либо на геле для качественного измерения. В целом, RIN, по крайней мере восемь настоятельно рекомендуется. Однако при извлечении РНК из тканей РИН может быть ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, контроль качества может быть выполнен qPCR на материале РНК.

4. Подготовка библиотеки РНК-сек

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка библиотеки РНК-сек часто осуществляется с коммерческим комплектом или в коммерческих условиях. Описанный протокол адаптирован из коммерческого комплекта, KAPA РНК HyperPrep Kit с RiboErase (Illumina), с кратким описанием всех необходимых шагов: rRNA истощения с олиго гибридизации человека рибосомных РНК, фрагментация РНК, синтез первой нити, синтез второй нити и A-хвост, и после^{очистки каждого шага 15}. Для этой цели можно также использовать другие комплекты для подготовки библиотеки. Рекомендуется выполнять этот шаг с использованием коммерчески доступного комплекта, так как качество сгенерированной библиотеки cDNA часто более последовательно. 2) Описаны следующие шаги для подготовки библиотеки 1x. При подготовке нескольких образцов, сделать мастер смеси с 10% дополнительного объема.

1. Олиго гибридизации и rRNA истощения
   1. Подготовка олиго гибридизации мастер-микс (всего 11 йл, с 4,4 йл буфера гибридизации, 4,4 МКЛ гибридизации oligos, и 2,2 йл RNase-свободной воды) и истощения мастер смеси (всего 5,5 йл, с 3,3 йл истощения буфера и 2,2 l RNase H).
   2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин; до 45 градусов по Цельсию при -0,1 градуса по Цельсию; Пауза в 45 градусов по Цельсию; 45 градусов по Цельсию в течение 30 мин; 4 КК навсегда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим, начиная с двойного количества РНК, чем это необходимо для усиления. В первой попытке используйте половину суммы, чтобы продолжить следующие шаги. Это необходимо для того, чтобы убедиться, что еще есть материал для повторения этих шагов с разным количеством циклов (см. шаг 4.7.2), если циклы усиления оказываются недостаточными или чрезмерно усиленными.
   3. Используйте от 25 нг до 1 мкг общей РНК в 10 МКЛ без РНКС воды, добавьте 10 МКЛ олиго гибридизации мастер смеси. Поместите образцы в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
   4. Когда программа достигнет шага паузы при 45 градусов по Цельсию, добавьте 5 МКЛ мастер-микса к реакции гибридизации 20 йЛ, не удаляя ее из термоциклера. Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз несколько раз.
   5. Возобновление программы термоциклера для продолжения шага истощения (45 градусов по Цельсию в течение 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Положите шарики для истощения rRNA (например, КАПА чистые бусы) при комнатной температуре (RT) во время истощения шаг для следующей части протокола. 2) Рассмотрим подготовку DNase пищеварения мастер смеси (для раздела 4.2), так как реагенты необходимы непосредственно после очистки истощения rRNA.
   6. Выполните 2,2-х шарик на основе KAPA Чистые бусы очистки: объединить смесь РНК (25 йл) и KAPA Чистые бусы (55 йл), тщательно повторного бусы в СМЕСИ РНК путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз.
   7. Инкубировать на RT в течение 5 минут, чтобы РНК связывания с бисером, и поместите трубку (ы) на магнит стойку, чтобы захватить бисер, пока жидкость не будет ясно, и тщательно удалить и отбросить 60 йл супернатанта.
   8. Ведение трубки (ы) на магните, мыть 2x с 200 йл 80% этанола путем инкубации бисера с этанолом в течение ≥30 с и отказаться от этанола. Попробуйте удалить все остаточные этанола, не нарушая бисер после второй стирки.
   9. Высушите бисер на RT в течение 3-5 минут или до тех пор, пока весь этанол не испарится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное высыхание бисера может привести к снижению урожайности.
2. Пищеварение DNase
   1. Подготовка DNase пищеварения мастер смеси (всего 22 йл, с 2,2 йл буфера DNase, 2 йл DNase, и 17,8 йл RNase свободной воды) .
   2. Resuspend шарики в DNAse пищеварения мастер смеси (20 йл) путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз. Инкубировать трубку (ы) на RT в течение 3 минут, чтобы elute РНК от бисера.
   3. Поместите трубку (ы) на магнитную стойку, чтобы захватить бисер, пока жидкость не будет ясной, и тщательно перенесите 20 мкл супернатанта в чистую трубку.
   4. Инкубировать трубку (ы) с супернатантом при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность подготовки РНК-элюциона, фрагментации и грунтовки мастер-миксов (для раздела 4.3), так как реагенты непосредственно необходимы после очистки пищеварения DNase.
   5. Выполните очистку на основе бисера на 2,2x, следуя 4.1.6-4.1.9.
3. РНК-элюция, фрагментация и грунтовка
   1. Подготовье мастер-микс Fragment, Prime и Elute Buffer (1x) с 11 МЛ Фрагмента, Прайма и Элуте Буфера (2x) и 11 йл воды без RNase.
   2. Тщательно resuspend шарики с очищенными, DNase-обработанные РНК в 22 йл фрагментации, премьер и Elute Buffer (1x) путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз.
   3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут, чтобы elute РНК отшарика с, а затем поместить трубку (ы) на магнит, чтобы захватить бусы, пока жидкость не станет ясной.
   4. Тщательно перенесите 20 МКЛ супернатанта в трубку (ы). Откажитесь от трубки (ы) с бисером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, так как образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение ≤24 ч.
   5. Поместите трубку (ы) в термоциклер и провести фрагментации и грунтовки при 94 градусов по Цельсию в течение 6 минут. В результате около 200-300 bp длинные фрагменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать в течение 8 мин при 94 градусов по Цельсию для 100-200 bp фрагментов. При использовании частично деградированной РНК, фрагмент между 1-6 мин при 85 градусов по Цельсию в зависимости от тяжести деградации.
   6. Поместите трубку (ы) на лед и немедленно перейти к первой нити синтеза.
4. Синтез первой нити
   1. Подготовь первую смесь синтеза нитей (всего 12 йл, с 11 йл буфера синтеза первой нити и 1 йл скрипта KAPA).
   2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 25 градусов по Цельсию в течение 10 мин; 42 КК в течение 15 мин; 70 градусов по Цельсию в течение 15 мин; 4 КК навсегда.
   3. На льду смешайте 20 МКЛ фрагментированной загрунтовых РНК с 10 йл первой смеси синтеза нитей. Держите трубку (ы) на льду, тщательно перемешать, аккуратно трубчатой реакции вверх и вниз несколько раз.
   4. Поместите трубку (ы) в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
5. Синтез второй нити и A-хвост
   1. Подготовьте синтез второй нити и мастер-микс A-tailing на льду (всего 33 йл, с 31 ЗЛ буфера синтеза второй нити и 2 йл второй нити синтеза и A-хвостовой ферментной смеси).
   2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 16 градусов по Цельсию в течение 30 мин; 62 КК в течение 10 мин; 4 КК навсегда.
   3. Комбинат 30 йл первого продукта синтеза нити с 30 йл второй нити синтеза и-хвост мастер смеси, и тщательно перемешать путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз на льду.
   4. Поместите трубку (ы) в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
6. Адаптация перевязки и после перевязки очистки
   1. Разбавленные фондовые адаптеры (штрих-коды ДНК NEXTflex, 25 МКМ) 3,57x в RNase-свободной воде до 7 МКМ.
   2. Подготовка адаптера лигации мастер-микс (всего 50 йл, с 40 йл буфера перевязки и 10 йл лигозы ДНК).
   3. Объедините 60 мкл второго продукта синтеза нити, 45 МКЛ смеси мастера перевязки адаптера и 5 йл разбавленных адаптеров. Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз несколько раз на льду.
   4. Инкубировать трубки при 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут и продолжить немедленно с первой очистки перевязки после перевязки.
   5. Выполните 0,63x бисера на основе очистки путем объединения адаптер-лигатированные ДНК (110 йл) и KAPA чистые бусы (70 йл), а затем тщательно повторно бусинки в смеси ДНК, трубя вверх и вниз несколько раз.
   6. Повторите шаги 4.1.7-4.1.9.
   7. Снимите трубки с магнита. Тщательно resuspend шарики в 50 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5) и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
   8. Поместите тарелку на магнит и подождите, пока жидкость не прояснится. Перенесите 50 МКЛ ясного супернатанта в новую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки менее 24 ч при 4 градусах Цельсия.
   9. Выполните очистку на основе бисера на 0,7x, объединив 50 МКЛ бисера с очищенной ДНК с 35 йл решения PEG/NaCL. Тщательно смешайте вихрем.
   10. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 20 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
   11. Поместите тарелку на магнит; ждать, пока жидкость будет ясно. Перенесите 20 МКЛ ясного супернатанта в новую трубку и перенесите в раздел 4.7.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка менее чем за 1 неделю при 4 градусов по Цельсию или менее чем за 1 месяц при -20 градусов по Цельсию.
7. Усиление и очистка библиотеки
   1. Подготовка библиотеки усиления мастер-микс (всего 33 йл, с 27,5 МЛ 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix и 5,5 йл 10x библиотеки усиления грунтовки смеси).
   2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере с использованием следующих параметров. 98 градусов по Цельсию на 45 с; N циклов (см. примечание ниже) от: 98 градусов по Цельсию для 15 с; 60 градусов по Цельсию на 30 с; 72 градуса по Цельсию на 30 с; 72 КК в течение 1 мин; и 4 КК навсегда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы усиления библиотеки зависят от входного материала. Его можно приблизительно оценить как таковое: начиная с РНК и 25-100 нг, N и 11-15 циклов; 100-250 нг, N и 9-12 циклов; 250-500 нг, N и 7-10 циклов.
   3. Выполните очистку на основе бисера на основе 0,8x, объединив усиленную библиотечную ДНК (50 МКЛ) и чистые бусинки KAPA (40 йл), а затем тщательно повторно поместить бисер в смеси ДНК, несколько раз засовывав вверх и вниз.
   4. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 50 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
   5. Перенесите 50 МКЛ ясного супернатанта на новую трубку и приступайте ко второй очистке усиления библиотеки.
   6. Выполните очистку на основе бисера на основе 1x путем объединения усиленной библиотечной ДНК (50 йл) и чистых бусин KAPA (50 йл), затем тщательно повторно посовестите шарики в смеси ДНК, несколько раз промокая вверх и вниз.
   7. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 22 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
   8. Передача 20 ЗЛ ясного супернатанта в новую трубку переходит к измерениям Збит и биоанализа.
8. Размер концентрации и фрагментации
   1. Измерьте концентрацию образцов в ДНК. Использование высокочувствительных флуоресцентных красителей на основе комплекта (например, Denovix Збит, см. Таблица материалов ),или если концентрация, как представляется, ниже 0,5 нг / ЗЛ, requantify с использованием более чувствительного подхода qPCR (например, Каппа количественно, см. Таблицу материалов).
   2. Определите размер фрагмента библиотеки с помощью высокочувствительных электрофорезов (например, биоанализа).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально контроль качества с помощью qPCR может быть выполнен до секвенирования (приложения) с использованием разбавленной подготовленной библиотеки вместо cDNA.
9. Последовательности
   1. Отправить библиотеку для секвенирования. Для анализа экспрессии дифференциальных генов РНК-сек глубина секвенирования считывается от 10 до 25 миллионов на выборку, как правило, достаточна.

5. Предварительная обработка данных

1. Проверка качества файлов Fastq
   1. Скачать и установить Trimgalore^16, чтобы удалить низкое качество базовых пар и пустые чтения в файлах Fastq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Большинство программного обеспечения, упомянутого здесь работает только в Linux. Если он ограничен компьютером Windows, можно проработать анализ на сервере Linux с помощью программного обеспечения MobaXterm или Putty. Имейте в виду, что для индексации генома требуется много случайной памяти доступа (RAM) (около 64 ГБ). 2) Установка всего необходимого программного обеспечения в конда-среде настоятельно рекомендуется. Это позволит легко установки программного обеспечения и управления пакетами. Для получения более подробной информации о конде, посетите сайт lt;https://docs.conda.io'gt;.
   2. Создайте каталог (папку) для данных, например папки "RNA_seq_KC_diff". Установите это в качестве рабочего каталога, введя: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обзора структуры папок с folder_structure.txt м.
   3. Создайте несколько папок в рабочем каталоге с конкретными названиями: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' и 'Mapping'.
   4. Перемести файлы fasta секвенирований данных в папку fastq. Кроме того, создайте мягкие ссылки с помощью команды: "ln-s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" к файлам Fastq для экономии дискового пространства.
   5. Вы запустите Trim в изобилии на файлах Fastq, см. .txt TrimGalore для кода, чтобы скопировать пасту в Баш. При необходимости измените имена папок и настройки в команде.
2. Сопоставление
   1. Скачать геном, чтобы сопоставить читает, например, hg38 ensembl релиз 97 (разоблаченная версия): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; и соответствующий файл аннотации гена: hg 38 аннотация гена ensembl релиз 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Передача обоих файлов в CRCh38_fasta папку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте другую версию генома, например, версию HG38 UCSC, если предпочтительнее отображение для транскрипции СВУ, а не геномных СВУ.
   2. Установите STAR 2.7.1¹⁷.
   3. Создайте в доме эталонный геном с помощью STAR 2.7.1 по сценарию генерации генома (см. Дополнительные файлы кодирования). Измените количество потоков на то, что имеет процессер (-runThreadN X). При необходимости измените имена и настройки папок в этом скрипте. Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
   4. Установите samtools 1.9^{18 для} индексации файлов бам и gzip для сжатия файлов покачиваться.
   5. Выровнять Trim Galore проверенные секвенирования читает на сборку генома человека hg38 (ensembl релиз 97) с помощью STAR 2.7.1 следуют индексации с использованием samtools и gzip. Это должно быть выполнено с помощью скрипта map_fastq.txt (см. Дополнительные файлы кодирования). При необходимости измените имена и настройки папок в этом скрипте. Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
      ПРИМЕЧАНИЕ: STAR отображение генерирует несколько выходных файлов, в том числе файл бам, файл покачиваться, и читать рассчитывает таблица под названием _ReadsPerGene.out.tab, которые могут быть непосредственно использованы concatenated R для использования в качестве ввода для Deseq2.
3. Визуализация браузера генома
   1. Установите wigToBigWig от инструментов браузера генома UCSC для того чтобы произвести архивы bigwig с сценарием¹⁹big2bw.
   2. Перенесите файлы "convertBigWigChroms.py" и "CRCH38_ensembl2UCSC.txt" из дополнительных файлов кодирования в папку "скрипты" в рабочем каталоге.
   3. Сделайте convertBigWigChroms.py (с помощью команды: 'chmod x скрипты/конвертыBigWigChroms.py' на linux-машине).
   4. Создайте файлы bigWig из файлов Wiggle, используя скрипт wig2bw.txt (см. Дополнительные файлы кодирования). Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
   5. Вввесть файлы BigWig в браузер генома UCSC или интегративного зрителя геномики (IGV) для визуализации.

6. Анализ данных РНК-сек

1. Ввод выборочных данных в Deseq2
   1. Скачать и установить Rstudio (версия 1.1.456) и R (версия 3.6).
   2. Установите все необходимые пакеты R (см. Дополнительные файлы кодирования).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного файла R-markdown, показывающего весь код программирования и выход, см. прилагаемые файлы: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" и "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Общее описание всех шагов приведено ниже.
   3. Создайте таблицу подсчета из файлов ReadsPerGene.out.tab.
   4. Напишите файл выборочных данных, содержащий все имена файлов, день дифференциации и другие соответствующие выборочных данных. В примере пример файла см. "sample_data_example.csv" в дополнительных файлах кодирования.
   5. Используйте таблицу подсчета и выборочных данных для создания объекта Deseq2^20, содержащего как подсчитываемые, так и выборочных данных.
2. Нормализация экспрессии генов, расстояние выборки и PCA
   1. Нормализация таблицы подсчета в объекте Deseq2 с использованием либо Deseq2 rld, либо нормализации vst. Rld нормализации является предпочтительным, но со многими образцами, VST нормализации гораздо быстрее.
   2. Расстояние выборки участка на основе нормализованной интенсивности считывания с использованием функции«dist»в R и последующего выполнения кластеризацииhclustна основе выборочных расстояний. Участок тепловой карты себя с помощью пакета pheatmap.
   3. Создайте сюжет PCA нормализованного отсчета считывай интенсивности, используя функцию plotPCA Deseq2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PCA служит инструментом в исследовательском анализе данных и может быть использован для визуализации расстояния и родственности между различными образцами.
3. Дифференциальный/высоко переменный анализ экспрессии генов
   1. Рассчитайте либо дифференциальные гены с помощью функции результата Deseq2. Однако при оценке изменений в течение нескольких точек времени, в которых парные сравнения не применимы, используйте высоко переменные гены. В этом случае извлекайте 500 наиболее переменных генов через заказ на дисперсию между образцами из разных точек времени с функцией rowVars.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем анализе для контрольных образцов для дальнейшего анализа были использованы 500 наиболее переменных генов (гены с самым высоким стандартным отклонением их нормализованной интенсивности в дни дифференциации). Тем не менее, для больного против контроля анализа дифференцированно выраженных генов между болезнью и здоровым контролем с течением времени были рассчитаны Deseq2 с помощью нескольких испытаний исправлено р-значение 1 х 10^-4 в качестве отсечения. Другим возможным шагом фильтрации является исключение дифференциальных генов, изменяющихся меньше, чем определенное изменение складок.
   2. Выполняйте кмеаны, группируются на дифференциальных или сильно переменных генах, чтобы сгруппить их различными моделями выражения.
   3. Визуализуйте дифференциальные или сильно переменные гены в тепловой карты с помощью пакета pheatmap. Интенсивность, построенная в тепловой карты, является нормализованной интенсивностью Deseq2 со средним значением вычитается.
4. Анализ аннотации генной онтологии (GO)
   1. Создайте список выраженных фоновых генов, взяв все гены с более чем 10 графами в одном образце.
   2. Выполните анализ GO с помощью онлайн-инструментов, таких как GOrilla²¹. В качестве фона для сравнения используйте списки дифференциальных/высоко переменных генов в кластерах и фоновые гены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более продвинутые R-пользователи могут использовать пакетный кластерProfiler²² для автоматизации анализа go-term enrichment.

Нормальная дифференциация кератиноцитов и анализ РНК-сек
В этом эксперименте для дифференциации и анализа РНК-сек использовались линии кератиноцитов, полученные от пяти особей. На рисунке 1 обобщается экспериментальная процедура дифференциации и результаты анализа РНК-сек. Обзор процедур дифференциации в пробирке нормальных кератиноцитов и изменений морфологии клеток во время дифференциации иллюстрируется на рисунке 1A. Основной анализ компонентов (PCA) показал, что кератиноциты, проходящие дифференциацию, связаны, но отличаются общими профилями экспрессии генов(рисунок 1B). Высоко переменные гены были сгруппированы кмеанами для визуализации динамики экспрессии генов и моделей во время дифференциации(рисунок 1C).

Каждое скопление генов было представлено генами дифференциации кератиноцитов (например, KRT5 для пролиферации, KRT1 и KRT10 для ранней и средней дифференциации, и IVL/LOR/FLG для поздней дифференциации). Генно-онтология (GO) аннотация анализа высоко переменнойгенных кластеров (рисунок 1C) показала явную разницу в генных функциях этих генных кластеров (например, кератинизация на средних стадиях дифференциации; и эпидермальная дифференциация клеток, дифференциация кератиноцитов и пептидная перекрестная связь на поздних стадиях; Рисунок 1D). Выражение протеина нескольких маркеров дифференциации было измерено западным blotting(рисунок 1E).

Дифференциация мутантных кератиноцитов P63 и анализ РНК-сек:
Во втором эксперименте различия в морфологии клеток и экспрессии генов сравнивались между кератиноцитами из здорового контроля и тремя линиями, полученными от пациентов, несущих мутации p63 (мутанты R204W, R279H и R304W). На рисунке 2A показан обзор процедур дифференциации и изменений морфологии клеток. Мутантные кератиноциты оставались плоскими на поверхности блюда и не становились переполненными или перекрывались ростом в качестве контрольных кератиноцитов на 7-й день.

В анализе PCA линии контрольных ячеек четко следовали модели дифференциации по сравнению с рисунком 1B. Тем не менее, модель экспрессии генов мутантных клеток во время дифференциации остается в значительной степени похожа на модель размножающихся/недифференцированных клеток. Среди трех линий мутантов, дифференциация образцов R279 переехал вдоль PC1 и PC2 в некоторой степени, что свидетельствует о том, что его дифференциация была менее нарушена, по сравнению с R204W и R304W.

В кластерном анализе(рисунок 2C),гены вниз регулируется в контрольных клетках (кластер 1) были частично вниз регулируется в R204W и R279W, но их экспрессия генов не была резко изменена в R304W. Эти гены, вероятно, играют роль в пролиферации клеток, как показано на аннотации GO(рисунок 2D). В кластере 2(рисунок 2C),гены были сначала индуцированы, а затем вниз регулируется в контрольных клетках. Эти гены, вероятно, участвуют в дифференциации кератиноцитов, так как эпидермальная дифференциация и функции кератинизации были сильно обогащены для этого кластера генов(рисунок 2D). Эти гены не были индуцированы в R204W и R304W, в то время как в клетках R279H, эти гены были индуцированы, но не вниз регулируется столько, сколько контрольные клетки.

Гены в кластере 3 были индуцированы только в конце дифференциации в контрольных клетках(рисунок 2D). В соответствии с этим, эти гены могут играть определенную роль во внешнем большинстве слоя эпидермиса, так как они, как было показано, реагируют на внешние раздражители и воспаление (Рисунок 2D). Выражение этих генов не сильно изменилось во всех трех мутантных клеточных линиях. Видимые различия в моделях экспрессии генов между контрольными и мутантными клетками показывают, что мутантные клетки не могут правильно различаться в этих моделях дифференциации in vitro.

Рисунок 1: Дифференциация и анализ кератиноцитов. (A) Обзор протокола дифференциации кератиноцитов и морфологии клеток. Шкала бар 100 мкм. (B) Принцип анализа компонентов дифференциации контроля кератиноцитов. (C) Тепловая карта 500 наиболее переменных генов во время дифференциации кератиноцитов. Гены группируются в три кластера с использованием кластеризации кмеан. На стороне указаны репрезентативные гены маркера дифференциации для каждого генного кластера. (D) GO термин обогащения анализ перепредставленных функций генов в высоко переменной кластеров генов, по сравнению с фоном всех выраженных генов (кол-во йgt;10). GOrilla был использован для теста на обогащение. (E) Западная помарка маркеров дифференциации кератиноцитов во время дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Сравнение контроля и p63 мутантных кератиноцитов. (A) Обзор протокола дифференциации кератиноцитов и клеточной морфологии контроля и p63 мутантных кератиноцитов. Шкала 100 мкм. (B) Принцип анализа компонентов дифференциации контроля и пациента (R204W, R279H и R304W) кератиноцитов. (C) Тепловая карта дифференциальных генов между контрольными и мутантными кератиноцитами. Гены группируются в три кластера с использованием кластеризации кмеан. Указаны репрезентативные гены маркеров дифференциации для каждого генного кластера. (D) GO термин обогащения анализ перепредставленных функций генов в высоко переменной кластеров генов, по сравнению с фоном всех выраженных генов (кол-во йgt;10). GOrilla был использован для теста на обогащение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1. KGM-pro средние добавки.

Таблица 2. KGM-дифф средних добавок.

Дополнительные файлы кодирования: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; и Wig2bw.txt. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

В этой работе описывается метод индуцирования дифференциации кератиноцитов человека и последующая характеристика с использованием анализа РНК-сек. В текущей литературе, многие исследования по дифференциации кератиноцитов человека использовать два других метода, с высокой концентрацией кальция или с сывороткой в качестве^{методов, чтобы вызвать дифференциацию 2,3,23}. Предыдущий доклад тщательно сравнил эти три различных метода^{3 и показал, что} эти методы могут представлять различные биологии дифференциации кератиноцитов. В этом же докладе авторы показали, что дифференцированные клетки, индуцированные сывороткой, имеют высокий пролиферативный потенциал и выражают такие гены, как KRT16 и SKALP/PI3, которые выражаются в коже псориаза, но не в нормальном эпидермисе, и что поэтому модель дифференциации, индуцированная сывороткой, может быть использована для изучения псориаза. В отличие от этого, метод ингибирования контакта плюс исключение фактора роста может вызвать KRT1 и KRT10, которые обычно выражаются в эпидермисах и напоминают нормальную дифференциацию кератиноцитов. Высокая индукция кальция приводит к экспрессии генов, который находится между индукцией сыворотки и ингибированием контакта, как наименее специфический метод. Анализы с использованием анализов РНК-сек в ходе дифференциации подтвердили, что метод ингибирования контакта плюс исключение фактора роста приводит к дифференцированным кератиноцитам с аналогичными профилями экспрессии генов, как и ожидалось для эпидермальной дифференциации (например, KRT5 в размножающихся клетках, KRT1 и KRT10 в ранней индукции дифференциации, и LOR и FLG в конце; дифференциация; Рисунок 1С).

Эти выводы показывают, что этот метод дифференциации является простым в использовании и надежным методом для изучения дифференциации кератиноцитов. Кроме того, эта работа на кератиноциты, полученные из p63 мутант кератиноцитов также показывают, что метод может быть использован для изучения пострадавших кератиноцитов дифференциации в больных условиях. В этом подходе дифференциации in vitro используется KGM, приобретенный у Lonza, так как эта среда дает последовательные результаты. В принципе, другие эпидермальные среды с аналогичным составом, такие как кератиноцитов сыворотки свободной среды (KSFM) от Thermo Fisher Scientific также, вероятно, подходит, хотя это должно быть проверено.

Следует отметить, что этот метод имеет некоторые ограничения. Поскольку он основан на ингибировании контакта, требуется слияние плотности клеток. В наших экспериментах с p63 мутантных кератиноцитов, более высокая начальная плотность посева была необходима для обеспечения клеток для достижения слияния. Кроме того, когда клетки не растут с одинаковой скоростью, дифференциация иногда должна быть индуцирована в разные дни. Эти соображения следует учитывать при создании экспериментов. В экспериментальных условиях, где клетки должны быть индуцированы в то же время, другие методы дифференциации должны быть рассмотрены, в том числе добавление сыворотки, высокие концентрации кальция, и ингибирование рецепторов^{эпидермального фактора роста 2,3}. Тем не менее, все методы дифференциации in vitro имеют плюсы и минусы, так как они, вероятно, представляют собой частичные сигналы индукции дифференциации, которые присутствуют во время развития кожи in vivo^2.

Всеобъемлющий молекулярный анализ, который сравнивает эти различные методы, будет весьма информативным и может поручить выбор метода, наиболее подходящего для различных исследований биологических процессов. Кроме того, проверка изменений, измеренных на транскрипционом уровне, настоятельно рекомендуется, например, с помощью западного blotting или протеомного анализа. Кроме того, данные in vitro следует использовать с осторожностью, и выводы из этих моделей должны быть проверены in vivo, предпочтительно в развитии кожи человека.

Основные принципы извлечения РНК и подготовки библиотеки РНК-сек были^{хорошо описаны ранее 24,25,26,27,28}. В этом протоколе процедуры извлечения РНК и подготовки библиотеки РНК-сек основаны на рабочих процессах коммерчески доступных комплектов. В принципе, различные методы экстракции РНК не должны оказывать большого влияния на анализ РНК-сек, если качество РНК хорошее. В тех случаях, когда качество РНК низкое (т.е. когда РНК извлекается формалин-фиксированные парафин-встроенные ткани), РНК-сек все еще может быть выполнена; однако следует скорректировать этап фрагментации РНК. Подготовка библиотеки РНК-сек охватывает от удаления рибосомной РНК (рРНК) до строительства библиотеки cDNA для секвенирования. Основные процедуры могут быть выполнены с помощью различных комплектов, или с использованием отдельных ферментов и самодельных буферов^29,30,31,32. Следует отметить, что, если анализ РНК-сек проводится с использованием различных основных принципов (например, либо рибосомного истощения РНК, либо обогащения полиА мРНК путем гибридизации в политолигос), результаты анализа РНК-сек могут отличаться. Кроме того, протокол использует удаление рибосомной РНК путем гибридизации ДНК олиго к человеку, мыши и крысы рРНК. При работе с различными видами, альтернативный набор олиго должны быть использованы.

Секвенирование сгенерированной библиотеки может быть выполнено либо на обоих концах фрагментов (парный конец), либо на одном конце фрагмента (один конец). В целом, парное секвенирование конца значительно улучшает mappability и предоставляет больше информации о вариантах стенограммы. Однако для относительно простого дифференциального анализа генов, описанного здесь, одновеньшее секвенирование может также предоставить достаточную информацию.

Для важного шага анализа данных описывается относительно простой метод контроля качества файлов fastq, за которым следует отображение считывок генома. Несмотря на то, что предоставленный код bash не имеет идеальной масштабируемости, он имеет преимущество прозрачности. Выбор программного обеспечения, какие шаги он выполняет, и версия генома, используемого во время предварительной обработки данных, являются нетривиальными шагами, которые должны быть хорошо документированы, что имеет важное значение для повторяемости.

Для более продвинутых пользователей автоматизированный конвейер может быть использован для выполнения шагов проверки качества файла, обрезки адаптера и отображения, например, рабочего процесса ARMOR snakemake³³ или рабочего процесса Snakemake 'RNA-seq' из лаборатории³⁴van Heeringen. Однако эти полностью автоматизированные трубопроводы менее прозрачны и их труднее изменить. При использовании этих инструментов очень важно понимать функции этих автоматизированных трубопроводов. Наконец, протокол включает анализ данных РНК-сек с акцентом на переменную экспрессию генов с течением времени. Переменная экспрессия генов предпочтительнее, чем парное дифференциальное тестирование при взгляде на процессы с несколькими точками времени, такими как дифференциация. В заключение, этот анализ трубопровода вводит соответствующие инструменты для биоинформатического анализа данных RNAseq. Он содержит инструменты, которые могут тщательно оценить дифференциацию кератиноцитов, как в нормальных, так и больных условиях.

Авторов нечего раскрывать.

Это исследование было поддержано Нидерландской организацией научных исследований (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.З.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.З., J.G.A.S.); стипендии Университета Радбуда (Х.З.); и грант Китайского стипендиального совета 201406330059 (J.З.).