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* 这些作者具有相同的贡献
这里介绍的是一个逐步的过程,通过接触抑制来分离人类原性角蛋白细胞的体外分化,然后通过RNA-seq分析在分子水平上进行表征。
人类原发性角蛋白细胞经常用作体外模型,用于表皮分化和相关疾病的研究。报告了利用各种诱导条件以二维(2D)水下方式培养的角蛋白细胞体外分化的方法。这里描述的是2D体外角细胞分化方法通过接触抑制和随后的分子表征RNA-seq的过程。简言之,角蛋白细胞生长在定义的角蛋白细胞介质中,辅以生长因子,直到它们完全汇合。分化是由角蛋白细胞之间的密切接触引起的,并因排除介质中的生长因子而进一步刺激。利用RNA-seq分析,发现1)分化的角蛋白细胞在分化过程中表现出不同的分子特征,2)动态基因表达模式在表皮分层期间与细胞大体相似。至于与正常角蛋白细胞分化的比较,携带转录因子p63突变的角蛋白细胞表现出改变的形态和分子特征,符合其分化缺陷。最后,本协议详细介绍了2D体外角细胞分化的步骤及其分子特征,重点是RNA-seq数据的生物信息学分析。由于RNA提取和RNA-seq程序有据可查,因此它不是本协议的重点。体外角蛋白细胞分化的实验程序及生物信息分析管道可用于研究健康与患病角蛋白细胞表皮分化期间的分子事件。
人类原发性角蛋白细胞来源于人类皮肤,常被用作细胞模型,研究表皮1、2、3、4的生物学。表皮的分层可以通过角蛋白细胞分化进行建模,无论是2D水下单层方式,还是3D空气提升器官模型2、3、5、6、7。虽然 3D 模型在评估表皮结构和功能方面变得越来越重要,但由于 2D 分化模型的便利性和生成大量用于分析的细胞的可能性,因此仍然广泛使用。
各种条件已应用于诱导角蛋白细胞分化的2D,包括血清的添加,高浓度的钙,较低的温度和抑制表皮生长因子受体2,3。这些方法中的每一个方法都经过了许多角蛋白细胞分化标记基因的验证,并证明在评估角蛋白细胞分化(包括在病理条件下)是有效的。然而,当对标记基因的特定面板进行2、3的检查时,这些诱导条件也显示了其分化效率和动力学的差异。
其中一种方法涉及角蛋白细胞接触抑制和消耗生长因子在培养媒介8。研究表明,当细胞达到全密度时,角蛋白细胞可以自发分化。 将文化媒介中的增长因素排除在外,可以进一步增强差异化。将接触抑制和减损生长因子相结合的方法已被证明在使用多个表皮标记3时,产生具有与正常分层表皮相似的基因表达模式的分化角蛋白细胞,表明该模型适合研究正常的角蛋白细胞分化。最近,利用该模型对角蛋白细胞分化进行了两次综合基因表达分析,结果报告了9、10。研究人员在分子水平上验证了该模型,并表明它可用于研究正常和患病的角蛋白细胞分化。
本协议描述了使用RNA-seq进行体外分化方法和分化细胞分子分析的过程。它还说明了分化日(增殖阶段)、第2天、第4天和第7天(分别早期、中间和晚期分化)细胞转录组的特点。表明,分化的角蛋白细胞显示基因表达模式,在表皮分层期间,它们与细胞大体相似。为了研究这种方法是否可用于研究皮肤病理学,我们应用了相同的实验和分析管道,以研究携带转录因子p63突变的角蛋白细胞,这些突变来自结膜、异体发育不良和唇裂(EEC)综合征11,12的患者。该协议侧重于角蛋白细胞的体外分化以及随后对RNA-seq的生物信息学分析。完整程序的其他步骤,如RNA提取、RNA-seq样品制备和库结构,都记录得很好,很容易遵循,尤其是在使用许多常用商业试剂盒时。因此,这些步骤仅在协议中简要说明。数据表明,该管道适用于研究健康与患病角细胞表皮分化期间的分子事件。
皮肤活检取自健康志愿者或p63突变患者的躯干,以建立原发性角蛋白细胞培养。关于建立人类原生角蛋白细胞的所有程序都得到拉德布德大学尼梅根医疗中心伦理委员会的批准("门斯格邦登·翁德佐克·阿纳姆-尼梅根")。已获得知情同意。
1. 通过接触抑制,人类原发性角蛋白细胞分化
2. RNA提取
3. RNA质量检查
4. RNA-seq 库制备
注:RNA-seq 库制备通常使用商业套件或商业设置进行。所述协议改编自商业套件KAPA RNA HyperPrep套件与RigoErase(Illumina),并简要描述了所有必需的步骤:rRNA耗竭与寡核杂交到人类核糖体RNA,RNA碎片,第一链合成,第二链合成和A-尾,并在每一步15后清理。其他库准备套件也可用于此目的。建议使用市售套件执行此步骤,因为生成的 cDNA 库的质量通常更一致。2) 以下步骤用于 1x 库准备。如果准备多个样本,请用 10% 的额外体积进行主混合。
5. 数据预处理
6. RNA-seq数据分析
正常角蛋白细胞分化和RNA-seq分析
在这个实验中,从五个个体中提取的角蛋白细胞线用于分化和RNA-seq分析。图1总结了分化的实验过程和RNA-seq分析结果。图1A中显示了正常角蛋白细胞的体外分化过程和分化过程中细胞形态变化的概述。原理成分分析(PCA)显示,接受分化的角蛋白细胞具有连接但独特的整体基因表达特征(图1B)。高度可变的基因由千族聚聚,以可视化分化过程中的基因表达动力学和模式(图1C)。
每个基因组都代表角蛋白细胞分化标志基因(例如,KRT5用于增殖,KRT1和KRT10用于早期和中期分化,IVL/LOR/FLG用于后期分化)。基因本体(GO)对高可变基因簇的注解分析(图1C)显示这些基因簇的基因功能有明显差异(例如,分化中期的角蛋白化;表皮细胞分化、角蛋白分化和肽交叉链接的后期; 图 1D.通过西印(图1E)测量了几种分化标记的蛋白质表达。
P63 突变角蛋白细胞分化和RNA-seq分析:
在第二个实验中,比较了来自健康对症的角蛋白细胞和携带p63突变的患者(突变体R204W、R279H和R304W)的三条线之间的细胞形态和基因表达差异。 图 2A 显示了分化过程和细胞形态变化的概述。突变的角蛋白细胞在菜表面保持平坦,并没有成为第7天控制角蛋白细胞的拥挤或重叠生长。
在PCA分析中,与图1B相比,控制单元系 明显遵循分化模式。然而,突变细胞在分化过程中的基因表达模式与增殖/未分化细胞的形态基本相似。在三条突变线中,区分R279样本在一定程度上沿PC1和PC2移动,表明与R204W和R304W相比,其分化受损较小。
在聚类分析(图2C)中,控制细胞(聚类1)中低调控的基因在R204W和R279W中部分下降,但在R304W中,它们的基因表达没有发生剧烈变化。这些基因可能在细胞增殖中发挥作用,如 GO 注释(图2D)所示。在组2(图2C)中,基因首先被诱导,随后在控制细胞中降低调节。这些基因很可能参与角蛋白细胞分化,因为表皮分化和角蛋白化功能对于这种聚类基因具有高度丰富性(图2D)。这些基因不是在R204W和R304W诱导,而在R279H细胞中,这些基因是诱导的,但不像对照细胞那样被诱导,
集群3中的基因仅在控制细胞分化结束时诱导(图2D)。与这一点一致,这些基因可能在表皮的最外层发挥作用,因为它们已被证明对外部刺激和炎症有反应(图2D)。这些基因的表达模式在所有三个突变细胞系中变化并不大。控制细胞和突变细胞之间基因表达模式的可见差异表明,在这些体外分化模型中,突变细胞不能正确分化。
图1:角蛋白细胞分化与分析。(A) 角蛋白细胞分化协议和细胞形态概述。比例杆 = 100 μm.(B) 区分控制角蛋白细胞的原理分量分析。 (C) 角蛋白细胞分化期间前500个高度可变基因的热图。使用 kmean 聚类将基因聚类为三个聚类。每个基因簇的代表性分化标记基因在侧面指示。 (D) 与所有表达基因的背景(>10计数)相比,GO术语富集分析对高度可变基因簇中基因的代表性高能函数进行扩充分析。戈里拉用于浓缩试验。 (E) 分化过程中角蛋白细胞分化标记的西印。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:控制和p63突变角蛋白细胞的比较。(A) 角蛋白细胞分化方案概述和控制细胞形态和p63突变角蛋白细胞。比例 = 100 μm. (B) 区分控制和患者 (R204W、R279H 和 R304W) 角蛋白细胞的原理分量分析。 (C) 控制基因和突变角蛋白细胞之间差异基因的热图。使用 kmean 聚类将基因聚类为三个聚类。指出了每个基因簇的代表性分化标记基因。 (D) 与所有表达基因的背景(>10计数)相比,GO术语富集分析对高度可变基因簇中基因的代表性高能函数进行扩充分析。戈里拉用于浓缩试验。 请单击此处查看此图的较大版本。
KGM 组件 | 股票 | 中等 | 体积 |
KBM | 500 mL | ||
笔/笔 | 100,000 单位/千升 | 100 单位/千升 | 5 mL |
Bpe | ±13毫克/千升 | 0.4% | 2 mL |
乙醇 胺 | 0.1 米 | 0.1 mM | 500 μL |
o 磷氨酰胺 | 0.1 米 | 0.1 mM | 500 μL |
氢皮质松 | 0.5毫克/千升 | 0.5 μg/mL | 500 μL |
胰岛素 | 5毫克/千升 | 5 μg/mL | 500 μL |
Egf | 10 μg/mL | 10纳克/千升 | 500 μL |
表1.KGM 亲中等补充剂。
KGM 组件 | 股票 | 中等 | 体积 |
KBM | 500 mL | ||
笔/笔 | 100,000 单位/千升 | 100 单位/千升 | 5 mL |
乙醇 胺 | 0.1 米 | 0.1 mM | 500 μL |
o 磷氨酰胺 | 0.1 米 | 0.1 mM | 500 μL |
表2.KGM-diff 介质补充剂。
补充编码文件: Folder_structure.txt;Generate_genome.txt;Map_fastq.txt;RNA_seq_kc_differentiation_patient.html;RNA_seq_kc_differentiation_wt.html;Sample_data_example.csv;特里默.txt;和 Wig2bw.txt。 请点击这里下载此文件。
本工作描述了一种利用RNA-seq分析诱导人类角蛋白细胞分化和后续表征的方法。在目前的文献中,许多关于人类角蛋白细胞分化的研究使用另外两种方法,高钙浓度或以血清作为诱导分化的方法2,3,23。前一份报告仔细比较了这三种不同的方法3,表明这些方法可以代表角蛋白细胞分化的不同生物学。在同一份报告中,作者指出,血清诱导的分化细胞具有高增殖潜力和表达基因,如KRT16和SKALP/PI3,这些基因在银屑病皮肤中表达,但不是在正常表皮中表达,因此血清诱导的分化模型可用于研究牛皮病。相比之下,接触抑制加生长因子排除的方法可以诱导KRT1和KRT10,它们通常用表皮表示,类似于正常的角蛋白细胞分化。高钙诱导产生一种基因表达特征,即血清诱导和接触抑制之间的基因表达,作为最不具体的方法。在分化过程中使用RNA-seq分析进行的分析证实,接触抑制和生长因子排除的方法导致分化性角蛋白细胞与表皮分化预期相似(例如,增殖细胞中的KRT5,早期分化诱导中的KRT1和KRT10,以及后期分化中的LOR和FLG;图1C.
这些发现表明,这种分化技术是一种易于使用和可靠的方法,用于研究角蛋白细胞分化。此外,本研究从p63突变角蛋白细胞中提取的角蛋白细胞的研究还表明,该方法可用于研究患病条件下受影响的角蛋白细胞分化。在这种体外分化方法中,使用从 Lonza 购买的 KGM,因为这种介质会产生一致的结果。原则上,其他具有类似成分的表皮介质,如来自赛莫费舍尔科学公司(KSFM)的角蛋白细胞无血清介质(KSFM),也很可能合适,尽管这需要测试。
应当指出,这种方法有一些局限性。由于它基于接触抑制,因此需要细胞密度的汇合。在我们的p63突变角蛋白细胞实验中,为确保细胞达到汇合,需要更高的初始播种密度。此外,当细胞生长速度不同时,有时必须在不同的日子里诱导分化。在进行实验时,应考虑这些注意事项。在需要同时诱导细胞的实验环境中,应考虑其他分化方法,包括添加血清、高浓度钙和抑制表皮生长因子受体2、3。然而,所有体外分化方法都有利弊,因为它们可能代表体内皮肤发育过程中存在的局部分化诱导信号2。
比较这些不同方法的综合分子分析将具有高度的信息性,并可以指导最适合不同生物过程研究的方法的选择。此外,通过西方印迹或蛋白质学分析等,非常建议验证在转录水平测量的变化。此外,应谨慎使用体外数据,这些模型的结论应在体内验证,最好是在人体皮肤发育中。
RNA提取和RNA-seq库制备的原理在此前的24、25、26、27、28中已经很好地描述了。在此协议中,RNA提取和RNA-seq库制备程序基于商用试剂盒的工作流程。原则上,如果RNA质量良好,则RNA提取的不同方法不应对RNA-seq分析产生重大影响。在RNA质量差的情况下(即,当RNA被提取形式固定石蜡嵌入组织时),RNA-seq仍然可以执行;然而,应调整RNA碎片步骤。RNA-seq库制备涵盖从核糖体RNA(rRNA)去除到cDNA库结构进行测序。主要程序可以通过使用各种试剂盒,或使用单独的酶和自制缓冲液29,30,31,32。应当指出,如果RNA-seq分析使用不同的基本原则(例如,核糖体RNA耗竭或聚A mRNA富集通过杂交到聚T寡聚),RNA-seq分析的结果可能会有所不同。此外,该协议利用核糖体RNA去除通过杂交DNA寡糖到人类,小鼠和大鼠rRNA。当与不同的物种合作时,应采用替代的寡头集。
生成的库的排序可以在片段的两端(配对端)或片段的一端(单端)执行。通常,配对端排序大大提高了可映射性,并提供了有关脚本变体的详细信息。然而,对于这里描述的相对简单的差分基因分析,单端测序也可以提供足够的信息。
对于数据分析的重要步骤,描述了一种相对简单的快速q文件质量控制方法,然后是对基因组的映射读取。尽管提供的 bash 代码没有理想的可伸缩性,但它具有透明度的优点。软件的选择,它执行的步骤,以及数据预处理期间使用的基因组版本,都是非重要的步骤,应该有据可查,这对可重复性至关重要。
对于更高级的用户,可以使用自动化管道执行快速Q文件质量检查、适配器修剪和映射的步骤,例如,ARMOR蛇制造工作流程33或范 海林根实验室34的"RNA-seq"蛇制造工作流程。但是,这些完全自动化的管道透明度较低,更难更改。使用这些工具时,了解这些自动化管道中的函数至关重要。最后,该协议包括RNA-seq数据分析,重点是可变基因表达随着时间的推移。在查看具有多个时间点(如差异)的过程时,变量基因表达比对差分测试更可取。最后,该分析管道介绍了RNAseq数据生物信息学分析的相关工具。它包含的工具,可以彻底评估角蛋白细胞分化,在正常和疾病条件下。
作者没有什么可透露的。
这项研究得到了荷兰科学研究组织的支持(NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010,H.Z.)(NWO/ALW/公开竞争/ALWOP 376,H.Z.,J.G.A.S.);拉德布德大学奖学金(H.Z.);和中国奖学金委员会助学金201406330059(J.Q.)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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