Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq

Aquí se presenta un procedimiento escalonado para la diferenciación in vitro de queratinocitos primarios humanos por inhibición del contacto seguido de caracterización a nivel molecular por el análisis de ARN-seq.

Los queratinocitos primarios humanos se utilizan a menudo como modelos in vitro para estudios sobre la diferenciación epidérmica y enfermedades relacionadas. Se han notificado métodos para la diferenciación in vitro de queratinocitos cultivados en formas sumergidas bidimensionales (2D) utilizando diversas condiciones de inducción. Aquí se describe un procedimiento para el método de diferenciación de queratinocitos in vitro 2D por inhibición del contacto y posterior caracterización molecular por ARN-seq. En resumen, los queratinocitos se cultivan en medio de queratinocitos definidos complementados con factores de crecimiento hasta que son totalmente confluentes. La diferenciación es inducida por contactos estrechos entre los queratinocitos y se estimula aún más excluyendo los factores de crecimiento en el medio. Utilizando análisis de ARN-seq, se muestra que ambos 1) queratinocitos diferenciados exhiben firmas moleculares distintas durante la diferenciación y 2) el patrón de expresión génica dinámica se asemeja en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. En cuanto a la comparación con la diferenciación normal de queratinocitos, los queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 exhiben morfología alterada y firmas moleculares, consistentes con sus defectos de diferenciación. En conclusión, este protocolo detalla los pasos para la diferenciación de queratinocitos in vitro 2D y su caracterización molecular, con énfasis en el análisis bioinformático de los datos de ARN-seq. Debido a que la extracción de ARN y los procedimientos de ARN-seq han sido bien documentados, no es el foco de este protocolo. El procedimiento experimental de diferenciación in vitro de queratinocitos y tubería de análisis bioinformático se puede utilizar para estudiar eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Los queratinocitos primarios humanos derivados de la piel humana se utilizan a menudo como modelo celular para estudiar la biología de la epidermis^1,2,3,4. La estratificación de la epidermis se puede modelar por diferenciación de queratinocitos, ya sea en una moda monocapa sumergida 2D o 3D aire-lift modelo organotípico^2,3,5,6,7. Aunque los modelos 3D se han vuelto cada vez más importantes para evaluar la estructura epidérmica y la función, los modelos de diferenciación 2D siguen siendo ampliamente utilizados, debido a su comodidad y la posibilidad de generar un gran número de células para análisis.

Se han aplicado varias condiciones para inducir la diferenciación de queratinocitos en 2D, incluyendo la adición de suero, alta concentración de calcio, menor temperatura e inhibición de los receptores del factor de crecimiento epidérmico^2,3. Cada uno de estos métodos ha sido validado por una serie de genes marcadores de diferenciación de queratinocitos y ha demostrado ser eficaz en la evaluación de la diferenciación de queratinocitos, incluso en condiciones patológicas. Sin embargo, estas condiciones de inducción también muestran diferencias en su eficiencia de diferenciación y cinética cuando se examinan paneles específicos de genes marcadores^2,3.

Uno de estos métodos implica la inhibición del contacto con queratinocitos y el agotamiento de los factores de crecimiento en el medio de cultivo⁸. Se ha demostrado que los queratinocitos pueden diferenciarse espontáneamente cuando las células alcanzan la densidad completa.  Excluir los factores de crecimiento en el medio de cultivo puede mejorar aún más la diferenciación. Se ha demostrado que el método que combina la inhibición del contacto y agota los factores de crecimiento genera que los queratinocitos diferenciados con patrones de expresión génica similares a la epidermis estratificada normal cuando se utilizan varios marcadores epidérmicos^3,lo que sugiere que este modelo es adecuado para estudiar la diferenciación normal de queratinocitos. Recientemente, se han notificado dos análisis completos de expresión génica de la diferenciación de queratinocitos utilizando este modelo^9,10. Los investigadores validaron este modelo a nivel molecular y demostraron que se puede utilizar para estudiar la diferenciación normal y enferma de queratinocitos.

Este protocolo describe el procedimiento para el método de diferenciación in vitro y el análisis molecular de células diferenciadas utilizando ARN-seq. También ilustra la caracterización del transcriptoma de las células en el día de diferenciación 0 (etapa de proliferación), el día 2, el día 4 y el día 7 (diferenciación temprana, media y tardía, respectivamente). Se muestra que los queratinocitos diferenciados muestran patrones de expresión génica que se asemejan en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. Para examinar si este método se puede utilizar para el estudio de la patología cutánea, aplicamos la misma canalización experimental y de análisis para investigar queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 que se derivan de pacientes con ectrodactyly, displasia ectodérmica y síndrome de labio/paladar hendido (CEE)^11,12. Este protocolo se centra en la diferenciación in vitro de los queratinocitos, así como en el posterior análisis bioinformático del ARN-seq. Otros pasos en el procedimiento completo como la extracción de ARN, la preparación de muestras de ARN-seq y la construcción de bibliotecas, están bien documentados y se pueden seguir fácilmente, especialmente cuando se utilizan muchos kits comerciales de uso común. Por lo tanto, estos pasos se describen brevemente en el protocolo. Los datos muestran que esta tubería es adecuada para el estudio de eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Las biopsias cutáneas se tomaron del tronco de voluntarios sanos o pacientes con mutaciones p63, para establecer el cultivo primario de queratinocitos. Todos los procedimientos relativos al establecimiento de queratinocitos primarios humanos fueron aprobados por el comité ético del Centro Médico Nijmegen de la Universidad Radboud ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Se obtuvo el consentimiento informado.

1. Diferenciación de queratinocitos primarios humanos por inhibición del contacto

1. Preparar el medio de crecimiento de queratinocitos (KGM) a partir del keratinocito Basal Medium (Tabla de materiales) cuando sea necesario.
2. Haga un medio de proliferación de 500 ml utilizando existencias pre-preparadas (KGM-pro; véase el Cuadro 1).
3. Haga un medio de diferenciación de 500 ml (KGM-dif; véase el Cuadro 2).
   NOTA: KGM con suplementos se puede mantener a 4 oC durante dos semanas. Para un almacenamiento más largo, se puede alícuotar y almacenar a -20 oC.
4. Sembrartinocitos primarios en la densidad de 5.0–20 x 10³ células/cm^2,dependiendo de la capacidad proliferativa celular. Agregue suficiente medio KGM-pro para cubrir las células.
   NOTA: 1) Los detalles del cultivo celular regular dentro del medio KGM se pueden encontrar en el sitio web de Lonza¹³. 2) La densidad de siembra debe probarse para cada línea celular. Por ejemplo, una línea de queratinocitos primarios normal se puede sembrar a una densidad de 5,0 x 10³ células/cm^2,mientras que una línea portadora mutaciones en el factor de transcripción p63 que sea menos proliferativa debe ser sembrada a una densidad de 20 x 10³ células/cm². 3) Dependiendo de la configuración experimental, varios platos o pozos de células deben ser sembrados para permitir la recolección de muestras en diferentes días de diferenciación en réplicas.
5. Refrescar las células con el medio KGM-pro durante dos días después de la siembra (siembra el día 0, refrescante para el^1o tiempo en el día 3). Después, refresque con el medio KGM-pro cada dos días. Revise las células regularmente, al menos cada dos días.
6. Inducir la diferenciación celular cuando las células son más del 90% confluentes cambiando el medio a KGM-dif. El día de cambio del medio a KGM-dif se define como el día de diferenciación 0. Recoger las células para otros análisis de ARN lavando primero 2x con DPBS, luego añadiendo el tampón de lisis (de un kit de extracción de ARN).
   NOTA: Con la densidad de siembra antes mencionada, las células deben alcanzar la confluencia dentro de 7-10 días. Las células se pueden sembrar con una densidad inicial más alta para alcanzar la confluencia antes. Si las células no son proliferativas, es posible que la espera más larga no dé lugar a células totalmente confluentes. Es posible que se requiera una mayor densidad de siembra.
7. Refresque las células con el medio KGM-dif todos los días y recoja las células en el día de diferenciación 2, 4. y 7 para la extracción posterior del ARN.

2. Extracción de ARN

1. Aísle el ARN total. Esto se puede realizar utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial (como Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA), o utilizando fenol¹⁴. Sin embargo, se recomienda un kit de aislamiento que contenga un tratamiento con DNAse para muestras de ARN-seq para prevenir la contaminación del ADN y el fenol. Un ejemplo de un kit comercial de aislamiento de ARN se muestra en la Tabla de materiales.
2. Mida la concentración de ARN con un espectrómetro. Tanto el ADN como el ARN tienen un pico de absorción a 260 nm.
   NOTA: 1) La relación entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza del ARN. Una proporción de alrededor de 2,0 se acepta generalmente como ARN 'puro'. Si la proporción es sustancialmente inferior a 2,0, la muestra podría estar contaminada con contaminantes que se absorben a 280 nm, como proteínas, fenoles u otras sustancias. 2) La relación entre las absorbancias a 260 nm y 230 nm mide la pureza del ácido nucleico. Se espera una relación entre 2,0 y 2,2. Si la relación es sustancialmente menor, la muestra podría estar contaminada con contaminantes que absorben a 230 nm, como EDTA, etanol u otras sustancias.

3. Comprobación de la calidad del ARN

1. Ejecute el ARN en un chip de ARN Pico bioanalyzer para validar cuantitativamente el número de integridad del ARN (RIN) o en un gel para una medida cualitativa. En general, un RIN de al menos ocho es muy recomendable. Sin embargo, al extraer ARN de los tejidos, el RIN puede ser menor.
   NOTA: Opcionalmente, qPCR puede realizar un control de calidad en el material de ARN.

4. Preparación de la biblioteca RNA-seq

NOTA: La preparación de la biblioteca RNA-seq se realiza a menudo con un kit comercial o bajo entornos comerciales. El protocolo descrito está adaptado de un kit comercial, KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase (Illumina), con una breve descripción de todos los pasos requeridos: agotamiento del ARN con hibridación de oligo a los ARN ribosomales humanos, fragmentación de ARN, síntesis de primera hebra, síntesis de la segunda hebra y cola A, y limpieza después de cada paso¹⁵. Otros kits de preparación de bibliotecas también se pueden utilizar para este propósito. Se recomienda realizar este paso utilizando un kit disponible comercialmente, ya que la calidad de la biblioteca cDNA generada es a menudo más consistente. 2) Los siguientes pasos se describen para la preparación de la biblioteca 1x. Si prepara varias muestras, haga mezclas maestras con un 10% de volumen adicional.

1. Hibridación de oligo y agotamiento del RRNA
   1. Preparar la mezcla maestra de hibridación de oligo (total de 11 l, con 4,4 ml de tampón de hibridación, 4,4 l de oligos de hibridación y 2,2 l de agua libre de RNase) y la mezcla maestra de agotamiento (total de 5,5 l, con 3,3 l de búfer de agotamiento y 2,2 l de RNase HNase).
   2. Configure el programa de reacción de PCR en un termociclador: 95 oC durante 2 min; rampa de hasta 45 oC a -0,1 oC/s; Pausa de 45 oC; 45 oC durante 30 min; 4 oC para siempre.
      NOTA: Considere comenzar con el doble de LA cantidad de ARN que la necesaria para la amplificación. En el primer intento, utilice la mitad de la cantidad para continuar con los pasos siguientes. Esto es para asegurarse de que todavía hay material para repetir estos pasos con un número diferente de ciclos (ver paso 4.7.2), si los ciclos de amplificación resultan ser insuficientes o sobreamplificados.
   3. Utilice entre 25 ng y 1 g de ARN total en 10 ml de agua libre de RNAse, añada 10 l de mezcla maestra de hibridación de oligo. Coloque las muestras en el termociclador preprogramado e inicie el programa.
   4. Cuando el programa alcance el paso de pausa a 45 oC, añada 5 ml de mezcla maestra de agotamiento a la reacción de hibridación de 20 l sin retirarla del termociclo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   5. Reanudar el programa de termociclo para continuar con el paso de agotamiento (45 oC durante 30 min).
      NOTA: 1) Coloque las perlas para el agotamiento del ARN (por ejemplo, perlas puras KAPA) a temperatura ambiente (RT) durante el paso de agotamiento para la siguiente parte del protocolo. 2) Considere la preparación de la mezcla maestra de digestión DNase (para la sección 4.2), ya que los reactivos son necesarios directamente después de la limpieza del agotamiento del ARN.
   6. Realice una limpieza de KAPA Pure Beads basada en cuentas de 2,2x: combine la mezcla de ARN (25 l) y las cuentas puras KAPA (55 l), resuspiendo a fondo las perlas en la mezcla de ARN en pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   7. Incubar en RT durante 5 minutos para permitir la unión de ARN a las perlas, y colocar el(los) tubo(s) en un bastidor de imán para capturar las perlas hasta que el líquido esté limpio, y retirar y desechar cuidadosamente 60 l de sobrenadante.
   8. Manteniendo el(los) tubo(s) en el imán, lavar 2x con 200 l de 80% etanol incubando las perlas con el etanol para ≥30 s y desechar el etanol. Trate de eliminar todo el etanol residual sin alterar las perlas después del segundo lavado.
   9. Seque las perlas en RT durante 3-5 minutos o hasta que todo el etanol se haya evaporado.
      NOTA: El secado excesivo de las perlas puede resultar en un rendimiento reducido.
2. Digestión DNase
   1. Preparar la mezcla maestra de digestión de DNase (total de 22 l, con 2,2 ml de tampón DNase, 2 l de DNase y 17,8 l de agua libre de RNase).
   2. Resuspender las perlas en la mezcla maestra de digestión DNAse (20 l) pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar el(los) tubo(s) en RT durante 3 minutos para eluir el ARN de las cuentas.
   3. Coloque el(los) tubo(s) en un bastidor de imán para capturar las perlas, hasta que el líquido esté limpio, y transfiera cuidadosamente 20 l de sobrenadante en un tubo limpio.
   4. Incubar el(los) tubo(s) con sobrenadante a 37oC durante 30 min.
      NOTA: Considere la posibilidad de preparar las mezclas maestras de elución, fragmentación y cebado de ARN (para la sección 4.3), ya que los reactivos son necesarios directamente después de la limpieza de la digestión de DNase.
   5. Realice una limpieza basada en cuentas de 2,2x siguiendo 4.1.6–4.1.9.
3. Elución de ARN, fragmentación y cebado
   1. Prepare la mezcla maestra Fragment, Prime y Elute Buffer (1x) con 11 l de Fragment, Prime y Elute Buffer (2x) y 11 l de agua sin RNase.
   2. Resuspender a fondo las perlas con ARN purificado, tratado con DNase en 22 l de fragmentación, Prime y Elute Buffer (1x) pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   3. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos para eluir el ARN de lascuentas, luego coloque el(los) tubo(s) en un imán para capturar las perlas hasta que el líquido esté limpio.
   4. Transfiera cuidadosamente 20 l de sobrenadante en un tubo o tubos. Deseche los tubos con cuentas.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro, ya que las muestras se pueden almacenar a -20 oC durante ≤24 h.
   5. Colocar el(los) tubo(s) en un termociclo y llevar a cabo la fragmentación y cebado a 94oC durante 6 min. Resultando en fragmentos de 200-300 bp de largo aproximados.
      NOTA: Incubar durante 8 min a 94oC para fragmentos de 100–200 bp. Cuando utilice ARN parcialmente degradado, fragmente entre 1-6 min a 85 oC dependiendo de la gravedad de la degradación.
   6. Coloque los tubos sobre hielo y proceda inmediatamente a la síntesis de la primera hebra.
4. Síntesis de la primera hebra
   1. Preparar la primera mezcla maestra de síntesis de hebras (total de 12 l, con 11 l de tampón de síntesis de primera hebra y 1 l de script KAPA).
   2. Configurar el programa de reacción de PCR en un termociclador: 25 oC durante 10 min; 42 oC durante 15 min; 70 oC durante 15 min; 4 oC para siempre.
   3. En hielo, combine 20 ml de ARN cebado fragmentado con 10 ml de la primera mezcla maestra de síntesis de hebra. Mantenga los tubos sobre hielo, mezcle bien pipeteando suavemente la reacción hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   4. Coloque el(los) tubo(s) en el termociclador preprogramado e inicie el programa.
5. Síntesis de segunda hebra y cola A
   1. Preparar la síntesis de la segunda hebra y la mezcla maestra de cola A en hielo (total de 33 l, con 31 ml de tampón de síntesis de segunda hebra y 2 l de síntesis de segunda hebra y mezcla de enzimas de cola A).
   2. Configurar el programa de reacción de PCR en un termociclador: 16 oC durante 30 min; 62 oC durante 10 min; 4 oC para siempre.
   3. Combine 30 ml del primer producto de síntesis de hebras con 30 ml de síntesis de segunda hebra y mezcla maestra de cola A, y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces sobre hielo.
   4. Coloque el(los) tubo(s) en el termociclador preprogramado e inicie el programa.
6. Ligadura del adaptador y limpieza posterior a la ligadura
   1. Adaptadores de stock diluido (códigos de barras DE ADN NEXTflex, 25 m) 3,57x en agua libre de RNase a 7 m.
   2. Preparar la mezcla maestra de ligadura de adaptador (total de 50 l, con 40 ml de tampón de ligadura y 10 l de ligasa de ADN).
   3. Combine 60 ml de producto de síntesis de segunda hebra, 45 ml de mezcla maestra de ligadura de adaptador y 5 ml de adaptadores diluidos. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces sobre hielo.
   4. Incubar los tubos a 20oC durante 15 min y continuar inmediatamente con la primera limpieza posterior a la ligadura.
   5. Realice una limpieza basada en cuentas de 0,63x combinando ADN ligado por adaptador (110 l) y cuentas puras KAPA (70 oL), luego resuspender a fondo las cuentas en la mezcla de ADN pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   6. Repita los pasos 4.1.7–4.1.9.
   7. Retire los tubos del imán. Resuspender a fondo las perlas en 50 ml de 10 mM Tris HCL (pH a 8,0–8,5) e incubar las perlas en RT durante 2 min.
   8. Coloque la placa sobre el imán y espere hasta que el líquido esté limpio. Transfiera 50 l del sobrenadante transparente a un tubo nuevo.
      NOTA: Punto de parada seguro por menos de 24 h a 4 oC.
   9. Realice una limpieza basada en cuentas de 0,7x combinando 50 ml de perlas con ADN ligado a un adaptador purificado con 35 ml de solución PEG/NaCL. Mezclar bien por vórtice.
   10. Realice los pasos de limpieza 4.1.7–4.1.9. Resuspender a fondo las perlas en 20 ml de 10 mM Tris HCL (pH a 8,0–8,5), e incubar las perlas en RT durante 2 min.
   11. Coloque la placa sobre el imán; esperar hasta que el líquido esté limpio. Transfiera 20 l del sobrenadante transparente a un tubo nuevo y proceda a la sección 4.7.
       NOTA: Punto de parada seguro durante menos de 1 semana a 4 oC o menos de 1 mes a -20 oC.
7. Amplificación y limpieza de la biblioteca
   1. Preparar la mezcla maestra de amplificación de la biblioteca (total de 33 l, con 27,5 l de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix y 5,5 l de mezcla de imprimación de amplificación de biblioteca 10x).
   2. Configure el programa de reacción PCR en un termociclador utilizando los siguientes parámetros. 98 oC para 45 s; N ciclos (véase la nota a continuación) de: 98 oC para 15 s; 60 oC para 30 s; 72 oC para 30 s; 72 oC durante 1 min; y 4 oC para siempre.
      NOTA: Los ciclos para la amplificación de la biblioteca dependen del material de entrada. Se puede estimar más o menos como tal: comenzando con el ARN a 25–100 ng, N a 11–15 ciclos; 100–250 ng, N a 9–12 ciclos; 250–500 ng, N a 7–10 ciclos.
   3. Realice una limpieza basada en cuentas de 0,8x combinando ADN de biblioteca amplificada (50 l) y cuentas puras KAPA (40 oL), luego resuspender a fondo las perlas en la mezcla de ADN mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   4. Realice los pasos de limpieza 4.1.7–4.1.9. Resuspender a fondo las perlas en 50 ml de 10 mM Tris HCL (pH a 8,0–8,5), e incubar las perlas en RT durante 2 min.
   5. Transfiera 50 l del sobrenadante transparente a un tubo nuevo y proceda a la limpieza de amplificación de la segunda biblioteca.
   6. Realice una limpieza basada en cuentas de 1x combinando ADN de biblioteca amplificada (50 l) y cuentas puras KAPA (50 l), luego resuspend a fondo las perlas en la mezcla de ADN pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   7. Realice los pasos de limpieza 4.1.7–4.1.9. Resuspender a fondo las perlas en 22 l de 10 mM Tris HCL (pH a 8,0–8,5), e incubar las perlas en RT durante 2 min.
   8. Transfiera 20 l del sobrenadante transparente a un nuevo tubo proceda a las mediciones de Qbit y bioanalyzer.
8. Concentración y tamaño de fragmentación
   1. Mida las concentraciones de ADN de las muestras. Utilizando un kit basado en colorante fluorescente altamente sensible (por ejemplo, Denovix Qbit, ver Tabla de Materiales),o si la concentración parece estar por debajo de 0,5 ng/L, recuantificar utilizando un enfoque qPCR más sensible (por ejemplo, Cuantificación Kappa, ver Tabla de Materiales).
   2. Determinar el tamaño del fragmento de la biblioteca, utilizando electroforesis de alta sensibilidad (por ejemplo, un bioanalyzer).
      NOTA: Opcionalmente, el control de calidad por qPCR se puede realizar antes de la secuenciación (Apéndice) utilizando una biblioteca preparada diluida en lugar de cDNA.
9. Secuenciación
   1. Envíe la biblioteca para su secuenciación. Para el análisis de expresión génica diferencial de ARN-seq, una profundidad de secuenciación de lecturas entre 10-25 millones por muestra es generalmente suficiente.

5. Preprocesamiento de datos

1. Comprobación de calidad Archivos Fastq
   1. Descargue e instale Trimgalore¹⁶ para eliminar pares base de baja calidad y lecturas vacías dentro de los archivos Fastq.
      NOTA: 1) La mayoría del software mencionado aquí sólo funciona en Linux. Si se limita a un equipo Windows, es posible ejecutar análisis en un servidor Linux utilizando el software MobaXterm o Putty. Tenga en cuenta que para la indexación del genoma se requiere una gran cantidad de memoria de acceso aleatorio (RAM) (alrededor de 64 GB). 2) La instalación de todo el software necesario en un entorno conda es muy recomendable. Esto permitirá una fácil instalación del software y la gestión de paquetes. Para obtener más información sobre conda, visite .
   2. Cree un directorio (carpeta) para los datos, por ejemplo, la carpeta 'RNA_seq_KC_diff'. Establezca esto como directorio de trabajo escribiendo: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      NOTA: Para obtener información general sobre la estructura de carpetas, consulte 'folder_structure.txt' en los archivos de codificación suplementarios.
   3. Cree varias carpetas en el directorio de trabajo con los nombres específicos: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' y 'Mapping'.
   4. Mueva los archivos fasta de los datos secuenciados a la carpeta fastq. Alternativamente, genere enlaces flexibles usando el comando: "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" a los archivos Fastq para ahorrar espacio en disco.
   5. Ejecute Trim galore en los archivos Fastq, consulte el archivo TrimGalore.txt para que el código copie pegar en bash. Cambie los nombres y la configuración de las carpetas dentro del comando cuando sea necesario.
2. Asignación
   1. Descargue un genoma para mapear las lecturas, por ejemplo, hg38 ensembl release 97 (versión sin máscaras): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; y el archivo de anotación de genes correspondiente: hg 38 gen annotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Transfiera ambos archivos a la carpeta CRCh38_fasta.
      NOTA: Alternativamente, utilice una versión diferente del genoma, por ejemplo, la versión UCSC de hg38, si se prefiere mapear a los ID de transcripción en lugar de los UTIL genéticos.
   2. Instalar STAR 2.7.1¹⁷.
   3. Genere un genoma de referencia interno utilizando STAR 2.7.1 mediante el script de generación de genoma (consulte Archivos de codificación suplementarios). Cambie la cantidad de subprocesos a lo que tiene el procesor (--runThreadN X). Cambie los nombres de carpeta y la configuración de este script cuando sea necesario. Ejecútelo copiando/pegando en bash.
   4. Instale samtools 1.9¹⁸ para indexar los archivos bam y gzip para comprimir los archivos de ondulación.
   5. Alinee las lecturas de secuenciación validadas de Trim Galore con el ensamblaje del genoma humano hg38 (versión 97) con STAR 2.7.1 seguido de la indexación mediante samtools y gzip. Esto se debe realizar utilizando el script map_fastq.txt (consulte Archivos de codificación suplementarios). Cambie los nombres de carpeta y la configuración de este script cuando sea necesario. Ejecútelo copiando/pegando en bash.
      NOTA: La asignación STAR genera varios archivos de salida, incluido un archivo bam, un archivo de ondulación y una tabla de recuentos de lectura denominada *_ReadsPerGene.out.tab, que R puede utilizar directamente para utilizarla como entrada para Deseq2.
3. Visualización del navegador del genoma
   1. Instalar wigToBigWig desde las herramientas del navegador del genoma UCSC para generar archivos bigwig con el script big2bw¹⁹.
   2. Transfiera los archivos 'convertBigWigChroms.py' y 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' de los archivos de codificación suplementarios a una carpeta 'scripts' en el directorio de trabajo.
   3. Haga que el convertBigWigChroms.py sea ejecutable (mediante el comando: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' en una máquina Linux).
   4. Genere archivos bigWig a partir de los archivos Wiggle, utilizando el script wig2bw.txt (consulte Archivos de codificación suplementarios). Ejecútelo copiando/pegando en bash.
   5. Introduzca los archivos BigWig en el navegador del genoma UCSC o en el Visor de Genómica Integrativa (IGV) para su visualización.

6. Análisis de datos RNA-seq

1. Introduzca los datos de muestra en Deseq2
   1. Descargue e instale Rstudio (versión 1.1.456) y R (versión 3.6).
   2. Instale todos los paquetes R necesarios (consulte Archivos de codificación suplementarios).
      NOTA: Para obtener un archivo R-markdown detallado que muestre todo el código de programación y la salida, consulte los archivos adjuntos: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" y "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". A continuación se incluye una descripción general de todos los pasos.
   3. Genere una tabla count a partir de los archivos ReadsPerGene.out.tab.
   4. Escriba un archivo de datos de ejemplo que contenga todos los nombres de archivo, el día de la diferenciación y otros datos de ejemplo relevantes. Para ver un archivo de ejemplo de ejemplo, consulte "sample_data_example.csv" en Archivos de codificación suplementarios.
   5. Utilice la tabla de recuento y los datos de ejemplo para generar un objeto Deseq2²⁰ que contenga los datos contables y de ejemplo.
2. Normalización de la expresión génica, distancia de la muestra y PCA
   1. Normalice la tabla count en el objeto Deseq2, utilizando deseq2 rld o vst normalización. Se prefiere la normalización Rld, pero con muchas muestras, la normalización de vst es mucho más rápida.
   2. Trazar la distancia de la muestra en función de las intensidades de recuento de lectura normalizadas utilizando la función "dist" en R y, posteriormente, realizar la agrupación en clústeres "hclust" basada en la distancia de la muestra. Trazar el mapa de calor en sí utilizando el paquete pheatmap.
   3. Genere una gráfica PCA de las intensidades de recuento de lectura normalizadas utilizando la función plotPCA de Deseq2.
      NOTA: PCA sirve como una herramienta en el análisis de datos exploratorios y se puede utilizar para visualizar la distancia y la relación entre diferentes muestras.
3. Análisis de expresión génica diferencial/altamente variable
   1. Calcular los genes diferenciales utilizando la función de resultado Deseq2. Sin embargo, al evaluar los cambios en varios puntos de tiempo en los que no se aplican las comparaciones por pares, utilice genes altamente variables. En este caso, extraiga los 500 genes más altos de variables mediante el orden en la varianza entre muestras de diferentes puntos de tiempo con la función rowVars.
      NOTA: En nuestro análisis, para las muestras de control, los 500 genes de alta variable superior (los genes con la desviación estándar más alta de su intensidad normalizada a través de días de diferenciación) se utilizaron para un análisis posterior. Sin embargo, para el análisis enfermo vs control expresado diferencialmente los genes entre la enfermedad y los controles saludables a lo largo del tiempo fueron calculados por Deseq2 utilizando una prueba múltiple corrigida valor p de 1 x 10^-4 como límite. Otro posible paso de filtrado es excluir los genes diferenciales que cambian menos que un cierto corte de cambio de pliegue.
   2. Realizar clustering kmeans en los genes diferenciales o altamente variables para agruparlos por diferentes patrones de expresión.
   3. Visualice genes diferenciales o muy variables en un mapa térmico utilizando el paquete pheatmap. La intensidad trazada en el mapa de calor es la intensidad normalizada Deseq2 con el valor medio restado.
4. Análisis de enriquecimiento de anotaciones de Gene Ontology (GO)
   1. Genere una lista de genes de fondo expresados tomando todos los genes con más de 10 recuentos en una sola muestra.
   2. Realice análisis GO utilizando herramientas en línea como GOrilla²¹. Utilice las listas de genes diferenciales/altamente variables en racimos como "lista genética", y los genes de fondo como fondo para la comparación.
      NOTA: Los usuarios de R más avanzados pueden utilizar el paquete clusterProfiler²² para automatizar el análisis de enriquecimiento a Término de Go.

Diferenciación normal de queratinocitos y análisis de ARN-seq
En este experimento, se utilizaron líneas de queratinocitos derivadas de cinco individuos para la diferenciación y análisis de ARN-seq. La Figura 1 resume el procedimiento experimental de diferenciación y los resultados del análisis de ARN-seq. En la Figura 1Ase ilustra una visión general de los procedimientos de diferenciación in vitro de los queratinocitos normales y los cambios en la morfología celular durante la diferenciación. El análisis de componentes principales (PCA) mostró que los queratinocitos sometidos a diferenciación habían conectado pero distintos perfiles de expresión génica global (Figura 1B). Los genes altamente variables fueron agrupados por kmeans para visualizar la dinámica y los patrones de expresión génica durante la diferenciación (Figura 1C).

Cada grupo de genes estaba representado por los genes distintivos de la diferenciación de queratinocitos (por ejemplo, KRT5 para la proliferación, KRT1 y KRT10 para la diferenciación temprana y media, e IVL/LOR/FLG para la diferenciación tardía). El análisis de anotaciones de ontología genética (GO) de grupos genéticos altamente variables (Figura 1C) mostró una clara diferencia en las funciones genéticas de estos grupos genéticos (por ejemplo, queratinización en las etapas medias de diferenciación; y diferenciación celular epidérmica, diferenciación de queratinocitos y reenlace de péptidos en las etapas tardías; Figura 1D). La expresión proteica de varios marcadores de diferenciación se midió por hinchazón occidental (Figura 1E).

Diferenciación de queratinocitos mutantes P63 y análisis ARN-seq:
En el segundo experimento, se compararon las diferencias de morfología celular y expresión génica entre los queratinocitos de controles sanos y tres líneas derivadas de pacientes portadores de mutaciones p63 (mutantes R204W, R279H y R304W). La Figura 2A muestra una visión general de los procedimientos de diferenciación y los cambios en la morfología celular. Los queratinocitos mutantes permanecieron planos en la superficie del plato y no se aglomeraron ni se superponen al crecimiento como queratinocitos de control en el día 7.

En el análisis de PCA, las líneas celulares de control siguieron claramente un patrón de diferenciación, en comparación con la Figura 1B. Sin embargo, el patrón de expresión génica de las células mutantes durante la diferenciación permanece en gran medida similar a los de las células proliferantes/indiferenciadas. Entre las tres líneas mutantes, las muestras de R279 diferenciadas se movieron a lo largo de PC1 y PC2 en cierta medida, lo que indica que su diferenciación fue menos deteriorada, en comparación con R204W y R304W.

En el análisis de agrupación(Figura 2C),los genes regulados en las células de control (grupo 1) se regularon parcialmente en R204W y R279W, pero su expresión génica no se modificó drásticamente en R304W. Estos genes probablemente juegan un papel en la proliferación celular, como se muestra en la anotación GO (Figura 2D). En el grupo 2 (Figura 2C), los genes fueron inducidos por primera vez y posteriormente regulados en las células de control. Es probable que estos genes estén implicados en la diferenciación de queratinocitos, ya que las funciones de diferenciación epidérmica y queratinización se enriquecieron para estos genes de racimo(Figura 2D). Estos genes no fueron inducidos en R204W y R304W, mientras que en las células R279H, estos genes fueron inducidos pero no regulados tanto como las células de control.

Los genes del grupo 3 sólo se indujeron al final de la diferenciación en las células de control(Figura 2D). De acuerdo con esto, estos genes pueden tener un papel en la capa más externa de la epidermis, ya que se ha demostrado que responden a estímulos externos e inflamación(Figura 2D). El patrón de expresión de estos genes no cambió mucho en las tres líneas celulares mutantes. Las diferencias visibles en los patrones de expresión génica entre el control y las células mutantes demuestran que las células mutantes no pueden diferenciarse adecuadamente en estos modelos de diferenciación in vitro.

Figura 1: Diferenciación y análisis de queratinocitos. (A) Visión general del protocolo de diferenciación de queratinocitos y morfología celular. Barra de escala a 100 m. (B) Análisis de componentes principales de queratinocitos de control diferenciador. (C) Mapa térmico de los 500 genes más variables durante la diferenciación de queratinocitos. Los genes se agrupan en tres grupos mediante agrupación kmea. Los genes marcadores de diferenciación representativas para cada grupo genético se indican en el lado. (D) Análisis de enriquecimiento del término GO de funciones sobrerrepresentadas para genes en los grupos genéticos altamente variables, en comparación con un fondo de todos los genes expresados (recuentos de >10). GOrilla se utilizó para la prueba de enriquecimiento. (E) Mancha occidental de marcadores de diferenciación de queratinocitos durante la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación del control y los queratinocitos mutantes p63. (A) Visión general del protocolo de diferenciación de queratinocitos y morfología celular del control y queratinocitos mutantes p63. Escala a 100 m. (B) Análisis de componentes principales de control diferenciador y queratinocitos de pacientes (R204W, R279H y R304W). (C) Mapa térmico de genes diferenciales entre el control y los queratinocitos mutantes. Los genes se agrupan en tres grupos mediante agrupación kmea. Se indican genes marcadores de diferenciación representativos para cada grupo genético. (D) Análisis de enriquecimiento del término GO de funciones sobrerrepresentadas para genes en los grupos genéticos altamente variables, en comparación con un fondo de todos los genes expresados (recuentos de >10). GOrilla se utilizó para la prueba de enriquecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. KgM-pro suplementos medios.

Cuadro 2. KgM-diff suplementos medios.

Archivos de codificación suplementarios: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; y Wig2bw.txt. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Este trabajo describe un método para inducir la diferenciación de queratinocitos humanos y la posterior caracterización utilizando análisis de ARN-seq. En la literatura actual, muchos estudios sobre la diferenciación de queratinocitos humanos utilizan otros dos métodos, con una alta concentración de calcio o con suero como métodos para inducir la diferenciación^2,3,23. Un informe anterior comparó cuidadosamente estos tres métodos diferentes³ y demostró que estos métodos pueden representar una biología distinta de la diferenciación de queratinocitos. En este mismo informe, los autores mostraron que las células diferenciadas inducidas por el suero tienen un alto potencial proliferativo y genes expresos como KRT16 y SKALP/PI3 que se expresan en la piel de la psoriasis pero no en la epidermis normal, y que por lo tanto el modelo de diferenciación inducida por el suero se puede utilizar para estudiar la psoriasis. Por el contrario, el método de inhibición del contacto más la exclusión del factor de crecimiento puede inducir KRT1 y KRT10, que normalmente se expresan en la epidermis y se asemejan a la diferenciación normal de queratinocitos. La alta inducción del calcio da lugar a un perfil de expresión génica que se encuentra entre la inducción sérica y la inhibición del contacto, como el método menos específico. Los análisis que utilizan análisis de ARN-seq durante la diferenciación confirmaron que el método de inhibición del contacto más la exclusión del factor de crecimiento da lugar a queratinocitos diferenciados con perfiles de expresión génica similares a los esperados para la diferenciación epidérmica (por ejemplo, KRT5 en células proliferantes, KRT1 y KRT10 en inducción de diferenciación temprana, y LOR y FLG en la diferenciación tardía; Figura 1C).

Estos hallazgos demuestran que esta técnica de diferenciación es un método fácil de usar y confiable para estudiar la diferenciación de queratinocitos. Además, este trabajo sobre queratinocitos derivados de queratinocitos mutantes p63 también muestra que el método se puede utilizar para estudiar la diferenciación de queratinocitos afectadas en condiciones enfermas. En este enfoque de diferenciación in vitro, se utiliza KGM comprado a Lonza, ya que este medio produce resultados consistentes. En principio, otro medio epidérmico con una composición similar como el medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) de Thermo Fisher Scientific también es probablemente adecuado, aunque esto necesita ser probado.

Cabe señalar que este método tiene algunas limitaciones. Como se basa en la inhibición del contacto, se requiere la confluencia de la densidad celular. En nuestros experimentos con queratinocitos mutantes p63, se ha necesitado una mayor densidad inicial de siembra para asegurar que las células alcancen la confluencia. Además, cuando las células no crecen con la misma velocidad, la diferenciación a veces debe ser inducida en días diferentes. Estas consideraciones deben tenerse en cuenta al configurar experimentos. En entornos experimentales en los que las células deban ser inducidas al mismo tiempo, se deben considerar otros métodos de diferenciación, como la adición de suero, las altas concentraciones de calcio y la inhibición de los receptores del factor de crecimiento epidérmico^2,3. Sin embargo, todos los métodos de diferenciación in vitro tienen pros y contras, ya que probablemente representan señales de inducción de diferenciación parcial que están presentes durante el desarrollo de la piel in vivo^2.

Un análisis molecular completo que compare estos diferentes métodos será muy informativo y puede instruir la elección del método más adecuado para diferentes estudios sobre procesos biológicos. Además, la validación de los cambios medidos a nivel transcriptómico es muy recomendable, por ejemplo, a través de la hinchazón occidental o los análisis proteómicos. Además, los datos in vitro deben utilizarse con precaución, y las conclusiones de estos modelos deben validarse in vivo, preferiblemente en el desarrollo de la piel humana.

Los principios básicos de la extracción de ARN y la preparación de la biblioteca RNA-seq han sido bien descritos anteriormente^{24,25,26,27,28}. En este protocolo, los procedimientos de extracción de ARN y preparación de la biblioteca RNA-seq se basan en flujos de trabajo de kits disponibles comercialmente. En principio, los diferentes métodos para la extracción de ARN no deben tener una influencia importante en los análisis de ARN-seq si la calidad del ARN es buena. En los casos en que la calidad del ARN es deficiente (es decir, cuando se extrae ARN-fijo de parafina incrustada en tejidos), el ARN-seq todavía se puede realizar; sin embargo, el paso de fragmentación del ARN debe ajustarse. La preparación de la biblioteca RNA-seq abarca desde la eliminación del ARN ribosomal (ARNR) hasta la construcción de la biblioteca cDNA para la secuenciación. Los principales procedimientos pueden realizarse utilizando varios kits, o utilizando enzimas individuales y tampones caseros^29,30,31,32. Cabe señalar que, si el análisis de ARN-seq se realiza utilizando diferentes principios básicos (por ejemplo, agotamiento del ARN ribosomal o enriquecimiento de ARN de poliA por hibridación a oligos de poliT), el resultado de los análisis de ARN-seq puede diferir. Además, el protocolo utiliza la eliminación de ARN ribosomal por hibridación de oligos de ADN a RRNA humana, ratón y rata. Cuando se trabaja con diferentes especies, se debe emplear un oligosonte alternativo.

La secuenciación de la biblioteca generada se puede realizar en ambos extremos de los fragmentos (extremo emparejado) o en un extremo del fragmento (extremo único). En general, la secuenciación final emparejada mejora enormemente la mapeabilidad y proporciona más información sobre las variantes de transcripción. Sin embargo, para un análisis de genes diferenciales relativamente simple como se describe aquí, la secuenciación de un solo extremo también puede proporcionar suficiente información.

Para el paso importante del análisis de datos, se describe un método relativamente simple para el control de calidad de los archivos fastq, seguido de lecturas cartografías en el genoma. Aunque el código bash proporcionado no tiene escalabilidad ideal, tiene la ventaja de la transparencia. La elección del software, qué pasos realiza, y la versión del genoma utilizado durante el preprocesamiento de datos son todos pasos no típicos que deben estar bien documentados, lo que es esencial para la repetibilidad.

Para usuarios más avanzados, se puede utilizar una canalización automatizada para realizar los pasos de comprobación de calidad de archivos fastQ, recorte y mapeo de adaptadores, por ejemplo, el flujo de trabajo de haz de serpiente ARMOR³³ o el flujo de trabajo de Snakemake 'RNA-seq' desde el laboratorio de van Heeringen³⁴. Sin embargo, estas tuberías completamente automatizadas son menos transparentes y más difíciles de cambiar. Al utilizar estas herramientas, es vital comprender las funciones dentro de estas canalizaciones automatizadas. Por último, el protocolo incluye el análisis de datos RNA-seq con énfasis en la expresión génica variable a lo largo del tiempo. La expresión génica variable se prefiere en lugar de las pruebas diferenciales por pares cuando se examinan procesos con varios puntos de tiempo, como la diferenciación. En conclusión, esta canalización de análisis introduce herramientas relevantes para el análisis bioinformático de los datos de RNAseq. Contiene herramientas que pueden evaluar a fondo la diferenciación de queratinocitos, tanto en condiciones normales como enfermas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta investigación fue apoyada por la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Beca de la Universidad Radboud (H.Z.); y la subvención del Consejo De Becas China 201406330059 (J.Q.).