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* これらの著者は同等に貢献しました
ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。
ヒトの原発性角化細胞は、表皮分化および関連疾患に関する研究のためのインビトロモデルとしてしばしば使用される。種々の誘導条件を用いて2次元(2D)水没式で培養したケラチノサイトのインビトロ分化に関する方法が報告されている。ここで説明する、RNA-seqによる接触阻害およびその後の分子特性化による2Dインビトロケラチノサイト分化法の手順について説明する。簡単に言えば, ケラチノサイトは、それらが完全にコンフルエントになるまで成長因子を補充定義されたケラチノサイト培地で成長します。.分化は、ケラチノサイト間の密接な接触によって誘導され、培地中の成長因子を除外することによってさらに刺激される。RNA-seq分析を用いて、1)分化された角化細胞の両方が分化中に異なる分子シグネチャを示し、2)動的遺伝子発現パターンは表皮層構造中の細胞に大きく似ていることが示される。正常なケラチノサイト分化との比較については、転写因子p63の変異を運ぶ角化細胞は、それらの分化欠陥と一致する変化した形態および分子シグネチャを示す。結論として、このプロトコルはRNA-seqデータのバイオインフォマティクス分析に重点を置いて、2D in vitroケラチノサイト分化とその分子特性解析のステップを詳述する。RNA抽出およびRNA-seqの手順は十分に文書化されているので、このプロトコルの焦点ではありません。in vitroケラチノサイト分化およびバイオインインフォマティクス分析パイプラインの実験手順は、健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するために使用することができる。
ヒト皮膚由来のヒト原発性角化細胞は、表皮1、2、3、4の生物学を研究する細胞モデルとしてしばしば用いられる。表皮の層は、ケラチノサイト分化法により、2D水没単層法または3Dエアリフトオルガノツモデル2、3、5、6、7のいずれかでモデル化することができる。表皮の構造や機能を評価するために3Dモデルがますます重要になってきていますが、2D分化モデルは、その利便性と分析のために多数の細胞を生成する可能性のために、まだ広く使用されています。
血清の添加、カルシウムの高濃度、表皮成長因子受容体2、3の低温および阻害を含む、2Dにおけるケラチノサイト分化を誘導するために様々な条件が適用されている。これらの各方法は、ケラチノサイト分化マーカー遺伝子の数によって検証されており、病理学的条件下を含むケラチノサイト分化の評価に有効であることが示されている。しかし、これらの誘導条件は、マーカー遺伝子の特定のパネルを2,3に調べた場合の分化効率と運動学の違いも示す。
これらの方法の1つは、培養培地8におけるケラチノサイト接触阻害および成長因子の枯渇を含む。細胞が完全な密度に達すると、ケラチノサイトが自発的に分化することが示されています。 培養培地中の成長因子を除くと、さらに分化を増強することができる。接触阻害と枯渇成長因子を組み合わせた方法は、いくつかの表皮マーカー3を用いた場合に、通常の表皮に類似した遺伝子発現パターンを有する分化ケラチノサイトを生成することが示されており、このモデルは正常なケラチノサイト分化の研究に適していることを示唆している。最近、このモデルを用いたケラチノサイト分化の2つの包括的な遺伝子発現解析が9,10に報告されている。研究者は、分子レベルでこのモデルを検証し、それが正常および病気のケラチノサイト分化を研究するために使用できることを示しました.
本プロトコルは、RNA-seqを用いた分化細胞のインビトロ分化法および分子解析の手順を説明する。また、分化0日目(増殖段階)、2日目、4日目、7日目(早期、中間、後期分化)における細胞の転写物の特徴を示す図である。分化された角化細胞は、表皮層の間に細胞に大きく似た遺伝子発現パターンを示す。この方法が皮膚病理の研究に使用できるかどうかを調べるために、同じ実験および分析パイプラインを適用して、眼球、外胚葉異形成および口唇口蓋裂症候群11、12を有する患者に由来する転写因子p63の突然変異を運ぶ角化細胞を調査した。このプロトコルは、ケラチノサイトのインビトロ分化と、RNA-seqのその後のバイオインフォマティクス解析に焦点を当てています。RNA抽出、RNA-seqサンプル調製、ライブラリ構築などの完全な手順の他のステップは、十分に文書化されており、特に多くの一般的に使用される商用キットを使用する場合に簡単に従うことができます。したがって、これらの手順はプロトコルで簡単に説明するだけです。このデータは、このパイプラインが健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するのに適していることを示している。
皮膚生検は、健常なボランティアまたはp63突然変異を有する患者の幹から採取し、主要な角化細胞培養を設定した。ヒトの主要なケラチノサイトの確立に関するすべての手順は、ラドボウド大学ナイメーヘン医療センターの倫理委員会によって承認されました(「コミッシー・メンスゲボンデン・オンデルゾーク・アーネム・ナイメーヘン」)。インフォームドコンセントを取得しました。
1. 接触阻害によるヒト一次角化細胞分化
2. RNA抽出
3. RNA品質チェック
4. RNA-セクライブラリ調製
注: RNA-seq ライブラリの準備は、多くの場合、市販キットまたは商用設定で行われます。記載されたプロトコルは、市販キットから適応される、RIBOErase(Illumina)を用いたKAPA RNA HyperPrepキットは、ヒトリボソームRNAへのオリゴハイブリダイゼーションによるrRNA枯渇、RNA断片化、第1鎖合成、第二鎖合成およびA-テーリング、および各ステップ15後のクリーンアップを簡単に説明する。他のライブラリ準備キットもこの目的に使用できます。生成されたcDNAライブラリの品質は一貫していることが多いため、市販キットを使用してこのステップを実行することをお勧めします。2) 以下の手順は、1x ライブラリの準備について説明します。複数のサンプルを準備する場合は、マスターミックスを10%の追加ボリュームと組み合わせます。
5. データの前処理
6. RNA-セクデータ解析
正常ケラチノサイト分化とRNA-seq分析
本実験では、5個体由来のケラチノサイト線を分化およびRNA-seq解析に用いた。図1は、分化およびRNA-seq分析結果の実験手順を要約した。分化中の正常な角化細胞および細胞形態変化のin vitro分化手順の概要を図1Aに示す。主成分分析(PCA)は、分化を行っているケラチノサイトが、全般的な遺伝子発現プロファイルを結合していたが、それぞれ異なっていることを示した(図1B)。高可変遺伝子は、分化中の遺伝子発現ダイナミクスとパターンを可視化するためにkmeansによってクラスター化された(図1C)。
遺伝子の各クラスターは、ケラチノサイト分化特徴遺伝子(例えば、増殖のためのKRT5、早期および中分化のためのKRT1およびKRT10、後期分化のためのIVL/LOR/FLG)によって表された。遺伝子腫瘍学(GO)遺伝子の遺伝子の注釈解析(図1C)は、これらの遺伝子クラスターの遺伝子機能の明確な違いを示した(例えば、分化の中間段階における角化、および表皮細胞分化、ケラチノサイト分化、およびペプチド架橋後期段階での交差リンク;図1D)。いくつかの分化マーカーのタンパク質発現は、ウェスタンブロッティングにより測定した(図1E)。
P63変異ケラチノサイト分化およびRNA-seq分析:
2番目の実験では、健常性対照からのケラチノサイトとp63変異を持つ患者(変異体R204W、R279H、およびR304W)に由来する3つのラインの細胞形態と遺伝子発現の違いを比較した。 図2Aは 、分化手順および細胞形態変化の概要を示す。変異ケラチノサイトは、皿の表面に平らなままであり、7日目にケラチノサイトをコントロールとして混雑または重なり合った成長にはならなかった。
PCA 分析では、コントロールセルラインは 、図 1Bと比較して、明確に分化パターンに従った。しかし、分化中の変異細胞の遺伝子発現パターンは、増殖/未分化細胞のパターンとほぼ同じままである。3つの変異線のうち、分化したR279サンプルはある程度PC1とPC2に沿って移動し、R204WおよびR304Wと比較してその分化が少ないことを示す。
クラスタリング解析(図2C)では、コントロール細胞(クラスタ1)でダウンレギュレートされた遺伝子はR204WおよびR279Wでは部分的にダウンレギュレートされたが、R304Wでは遺伝子発現が大幅に変化しなかった。GOアノテーション(図2D)に示すように、これらの遺伝子は細胞増殖に役割を果たす可能性が高い。クラスター2(図2C)において、遺伝子はまず制御細胞において最初に誘導され、その後ダウンレギュレートされた。これらの遺伝子は、このクラスター遺伝子に対して表皮分化および角化機能が高く富化したため、ケラチノサイト分化に関与する可能性が高い(図2D)。これらの遺伝子はR204WおよびR304Wでは誘導されなかったが、R279H細胞では、これらの遺伝子は誘導されたが、コントロール細胞ほどダウンレギュレートされなかった。
クラスター3の遺伝子は、コントロール細胞における分化の終わりにのみ誘導された(図2D)。これと一致して、これらの遺伝子は、外部刺激および炎症に対して応答性であることが示されているように、表皮の最外層に役割を有し得る(図2D)。これらの遺伝子の発現パターンは、3つの変異細胞系すべてにおいてあまり変化しなかった。対照細胞と変異細胞の間の遺伝子発現パターンの目に見える違いは、変異細胞がこれらのインビトロ分化モデルにおいて適切に分化できないことを示している。
図1:ケラチノサイトの分化と分析。(A) ケラチノサイト分化プロトコルと細胞形態の概要。スケールバー= 100 μm. (B) 分化制御角化細胞の主成分分析。 (C) ケラチノサイト分化中の上位500個の高可変遺伝子のヒートマップ。遺伝子は、kmeanクラスタリングを使用して3つのクラスターにクラスター化されます。各遺伝子クラスターの代表的な分化マーカー遺伝子は、側面に示されている。 (D)GO 用語は、全発現遺伝子の背景と比較して、高可変遺伝子クラスター中の遺伝子に対する過剰発現機能の濃縮分析(>10のカウント)。GOrillaは濃縮試験に使用されました。 (e) 分化中のケラチノサイト分化マーカーのウェスタンブロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:対照とp63変異角化細胞の比較。(A) ケラチノサイト分化プロトコルの概要および制御およびp63変異角化細胞の細胞形態。スケール= 100 μm. (B) 分化制御および患者(R204W、R279HおよびR304W)ケラチノサイトの主成分分析。 (C) 対照と変異角化細胞との間の差動遺伝子のヒートマップ。遺伝子は、kmeanクラスタリングを使用して3つのクラスターにクラスター化されます。各遺伝子クラスターに対する代表的な分化マーカー遺伝子が示されている。 (D)GO 用語は、全発現遺伝子の背景と比較して、高可変遺伝子クラスター中の遺伝子に対する過剰発現機能の濃縮分析(>10のカウント)。GOrillaは濃縮試験に使用されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
KGM コンポーネント | 株式 | 中程度 | ボリューム |
Kbm | 500 mL | ||
ペン/ストレップ | 100,000単位/mL | 100単位/mL | 5 mL |
BPE | ~13 mg/mL | 0.4% | 2 mL |
エタノールアミン | 0.1 M | 0.1 mM | 500 μL |
oホスホエタノールアミン | 0.1 M | 0.1 mM | 500 μL |
ヒドロコルチゾン | 0.5 mg/mL | 0.5 μg/mL | 500 μL |
インスリン | 5 mg/mL | 5 μg/mL | 500 μL |
Egf | 10 μg/mL | 10 ng/mL | 500 μL |
表 1.KGM プロ培地サプリメント.
KGM コンポーネント | 株式 | 中程度 | ボリューム |
Kbm | 500 mL | ||
ペン/ストレップ | 100,000単位/mL | 100単位/mL | 5 mL |
エタノールアミン | 0.1 M | 0.1 mM | 500 μL |
oホスホエタノールアミン | 0.1 M | 0.1 mM | 500 μL |
表 2.KGM-相違培地サプリメント.
補足的なコーディング ファイル: Folder_structure.txt;Generate_genome.txt;Map_fastq.txt;RNA_seq_kc_differentiation_patient.html;RNA_seq_kc_differentiation_wt.html;Sample_data_example.csv;トリムガロア.txt;そしてWig2bw.txt。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
本研究では、RNA-seq解析を用いてヒトケラチノサイト分化とその後の特性解析を誘導する方法について説明する。現在の文献では、ヒトケラチノサイト分化に関する多くの研究は、他の2つの方法を使用し、高カルシウム濃度または血清を用いて分化を誘導する方法として2、3、23。以前の報告では、これら3つの異なる方法3を慎重に比較し、これらの方法がケラチノサイト分化の異なる生物学を表し得る示した。この報告書では、血清によって誘導される分化細胞は、乾癬皮膚で発現されるが正常な表皮では発現しないKRT16およびSKALP/PI3のような高い増殖性および発現遺伝子を有し、したがって血清誘発分化モデルを使用して乾癬を研究できることを示した。対照的に、接触阻害と成長因子排除の方法は、通常表皮で発現し、正常な角化細胞分化に似ているKRT1およびKRT10を誘導することができる。高カルシウム誘導は、最も特異的な方法として、血清誘導と接触阻害の間にある遺伝子発現プロファイルを生じさせる。分化中のRNA-seq分析を用いた分析により、接触阻害法と成長因子排除法は、表皮分化に期待されるものと同様の遺伝子発現プロファイルを有する分化ケラチノサイト(例えば、初期分化誘導におけるKRT5、KRT1およびKRT10、後期分化におけるKRT1およびKRT10)を生じることが確認された。図1C)。
これらの知見は、この分化技術がケラチノサイト分化を研究するための使いやすく信頼性の高い方法であることを示している。さらに、この研究は、p63変異角化細胞に由来するケラチノサイトに関する研究は、疾患条件下で影響を受けたケラチノサイト分化の研究に使用できることを示している。このインビトロ分化アプローチでは、ロンザから購入したKGMが使用され、この媒体は一貫した結果をもたらす。原則として、サーモフィッシャーサイエンティフィック由来のケラチノサイト血清遊離培地(KSFM)のような類似の組成物を有する他の表皮培地も適している可能性が高いが、これを試験する必要がある。
なお、この方法には、いくつかの制限があります。接触阻害に基づいているため、細胞密度の合流性が要求される。p63変異角化細胞を用いた実験では、細胞が合流するようにするためには、より高い初期播種密度が必要であった。また、細胞が同じ速度で増殖しない場合、異なる日に分化を誘発しなければならない場合があります。実験をセットアップする際には、これらの考慮事項を考慮する必要があります。細胞を同時に誘導する必要がある実験設定では、血清の添加、カルシウムの高濃度、および表皮成長因子受容体2、3の阻害を含む他の分化方法を考慮すべきである。それにもかかわらず、インビトロ分化法はすべて、インビボ皮膚発達中に存在する部分的な分化誘導シグナルを表す可能性があるため、賛美および短所を有する。
これらの異なる方法を比較する包括的な分子解析は、非常に有益であり、生物学的プロセスに関する異なる研究に最も適した方法の選択を指示することができます。さらに、転写レベルで測定された変化を検証することは、例えば、ウェスタンブロッティングまたはプロテオミクス分析を介して、非常に助言される。さらに、in vitroデータは慎重に使用する必要があり、これらのモデルからの結論は、好ましくはヒト皮膚発達において、生体内で検証されるべきである。
RNA抽出およびRNA-seqライブラリー調製の基本原理は、前に24、25、26、27、28に記載されている。このプロトコルでは、RNA抽出およびRNA-seqライブラリ調製手順は、市販キットのワークフローに基づいています。RNAの品質が良い場合、原理的に、RNA抽出のための異なる方法は、RNA-seq分析に大きな影響を与えるべきではありません。RNAの品質が悪い場合(すなわち、RNAがホルマリン固定パラフィン包埋組織を抽出した場合)、RNA-seqを引き続き実行することができます。ただし、RNA の断片化ステップは調整する必要があります。RNA-seqライブラリ調製は、リボソームRNA(rRNA)除去からシーケンシング用のcDNAライブラリ構築までカバーします。主要な手順は、様々なキットを使用して、または個々の酵素と自家製バッファー29、30、31、32を使用して行うことができる。RNA-seq分析が異なる基本原理(例えば、ポリトオリゴへのハイブリダイゼーションによるリボソームRNA枯渇またはポリAmRNA濃縮のいずれか)を用いて行われる場合、RNA-seq分析の結果が異なる場合があります。さらに、このプロトコルは、ヒト、マウス、およびラットrRNAに対するDNAオリゴのハイブリダイゼーションによるリボソームRNA除去を利用する。異なる種で作業する場合は、代替オリゴセットを採用する必要があります。
生成されたライブラリーのシーケンスは、フラグメントの両端(ペアエンド)またはフラグメントの一端(単一端)で行うことができる。一般に、ペアエンドシーケンスは、マッピング可能性を大幅に向上させ、トランスクリプトバリアントに関するより多くの情報を提供します。しかし、ここで説明する比較的単純な微分遺伝子解析では、シングルエンドシーケンシングも十分な情報を提供できる。
データ解析の重要なステップでは、fastqファイルの品質管理のための比較的簡単な方法を説明し、続いて読み取りをゲノムにマッピングします。提供された bash コードは、理想的なスケーラビリティを持っていませんが、透過性の利点があります。ソフトウェアの選択、それが実行するステップ、およびデータの前処理中に使用されるゲノムのバージョンは、すべて十分に文書化されるべき重要なステップであり、反復性に不可欠です。
より高度なユーザーのために、自動化されたパイプラインは、fastQファイル品質チェック、アダプタトリミングとマッピングの手順を実行するために使用することができます,例えばARMORスネークメイクワークフロー33 またはファンHeheingenラボ34からの'RNA-seq'スネークメイクワークフロー。ただし、これらの完全に自動化されたパイプラインは、透明性が低く、変更が難しくなります。これらのツールを使用する場合、これらの自動化されたパイプライン内の機能を理解することが重要です。最後に、このプロトコルには、時間の経過に伴う可変的な遺伝子発現に重点を置いたRNA-seqデータ分析が含まれます。分化などの複数のタイムポイントを持つプロセスを見る場合、遺伝子発現は対方向の微分検査よりも好ましい。結論として、この分析パイプラインは、RNAEqデータのバイオインフォマティクス分析に関連するツールを導入しています。これは、正常な疾患と病気の条件の両方で、ケラチノサイト分化を徹底的に評価することができるツールが含まれています。
著者らは開示するものは何もない。
この研究はオランダ科学研究機構(NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010,H.Z.)によって支援されました。(NWO/ALW/オープンコンペティション/ALWOP 376、H.Z.、J.G.A.S.);ラドボウド大学フェローシップ(H.Z.);中国奨学金評議会助成金201406330059(J.Q.)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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