RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。

ヒトの原発性角化細胞は、表皮分化および関連疾患に関する研究のためのインビトロモデルとしてしばしば使用される。種々の誘導条件を用いて2次元(2D)水没式で培養したケラチノサイトのインビトロ分化に関する方法が報告されている。ここで説明する、RNA-seqによる接触阻害およびその後の分子特性化による2Dインビトロケラチノサイト分化法の手順について説明する。簡単に言えば, ケラチノサイトは、それらが完全にコンフルエントになるまで成長因子を補充定義されたケラチノサイト培地で成長します。.分化は、ケラチノサイト間の密接な接触によって誘導され、培地中の成長因子を除外することによってさらに刺激される。RNA-seq分析を用いて、1)分化された角化細胞の両方が分化中に異なる分子シグネチャを示し、2)動的遺伝子発現パターンは表皮層構造中の細胞に大きく似ていることが示される。正常なケラチノサイト分化との比較については、転写因子p63の変異を運ぶ角化細胞は、それらの分化欠陥と一致する変化した形態および分子シグネチャを示す。結論として、このプロトコルはRNA-seqデータのバイオインフォマティクス分析に重点を置いて、2D in vitroケラチノサイト分化とその分子特性解析のステップを詳述する。RNA抽出およびRNA-seqの手順は十分に文書化されているので、このプロトコルの焦点ではありません。in vitroケラチノサイト分化およびバイオインインフォマティクス分析パイプラインの実験手順は、健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するために使用することができる。

ヒト皮膚由来のヒト原発性角化細胞は、表皮^{1、2、3、4}の生物学を研究する細胞モデルとしてしばしば用^いられる。表皮の層は、ケラチノサイト分化法により、2D水没単層法または3Dエアリフトオルガノツモデル^{2、3、5、6、7}のいずれかでモデル化することができる。表皮の構造や機能を評価するために3Dモデルがますます重要になってきていますが、2D分化モデルは、その利便性と分析のために多数の細胞を生成する可能性のために、まだ広く使用されています。

血清の添加、カルシウムの高濃度、表皮成長因子受容体^2、3の低温および阻害を含む、2Dにおけるケラチノサイト分化を誘導するために様々な条件が適用されている。これらの各方法は、ケラチノサイト分化マーカー遺伝子の数によって検証されており、病理学的条件下を含むケラチノサイト分化の評価に有効であることが示されている。しかし、これらの誘導条件は、マーカー遺伝子の特定のパネルを^2,3に調べた場合の分化効率と運動学の違いも示す。

これらの方法の1つは、培養培地⁸におけるケラチノサイト接触阻害および成長因子の枯渇を含む。細胞が完全な密度に達すると、ケラチノサイトが自発的に分化することが示されています。 培養培地中の成長因子を除くと、さらに分化を増強することができる。接触阻害と枯渇成長因子を組み合わせた方法は、いくつかの表皮マーカー³を用いた場合に、通常の表皮に類似した遺伝子発現パターンを有する分化ケラチノサイトを生成することが示されており、このモデルは正常なケラチノサイト分化の研究に適していることを示唆している。最近、このモデルを用いたケラチノサイト分化の2つの包括的な遺伝子発現解析が^9,10に報告されている。研究者は、分子レベルでこのモデルを検証し、それが正常および病気のケラチノサイト分化を研究するために使用できることを示しました.

本プロトコルは、RNA-seqを用いた分化細胞のインビトロ分化法および分子解析の手順を説明する。また、分化0日目(増殖段階)、2日目、4日目、7日目(早期、中間、後期分化)における細胞の転写物の特徴を示す図である。分化された角化細胞は、表皮層の間に細胞に大きく似た遺伝子発現パターンを示す。この方法が皮膚病理の研究に使用できるかどうかを調べるために、同じ実験および分析パイプラインを適用して、眼球、外胚葉異形成および口唇口蓋裂症候群^11、12を有する患者に由来する転写因子p63の突然変異を運ぶ角化細胞を調査した。このプロトコルは、ケラチノサイトのインビトロ分化と、RNA-seqのその後のバイオインフォマティクス解析に焦点を当てています。RNA抽出、RNA-seqサンプル調製、ライブラリ構築などの完全な手順の他のステップは、十分に文書化されており、特に多くの一般的に使用される商用キットを使用する場合に簡単に従うことができます。したがって、これらの手順はプロトコルで簡単に説明するだけです。このデータは、このパイプラインが健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するのに適していることを示している。

皮膚生検は、健常なボランティアまたはp63突然変異を有する患者の幹から採取し、主要な角化細胞培養を設定した。ヒトの主要なケラチノサイトの確立に関するすべての手順は、ラドボウド大学ナイメーヘン医療センターの倫理委員会によって承認されました(「コミッシー・メンスゲボンデン・オンデルゾーク・アーネム・ナイメーヘン」)。インフォームドコンセントを取得しました。

1. 接触阻害によるヒト一次角化細胞分化

1. 必要に応じてケラチノサイト基底培地(材料表)からケラチノサイト増殖培地(KGM)を調製する。
2. 事前に準備された株式を使用して500 mLの拡散媒体を作る(KGMプロ; 表1を参照)。
3. 500 mL 分化媒体を作る (KGM-dif; 表 2を参照)。
   注:サプリメント付きのKGMは2週間4°Cで保つことができます。より長い貯蔵のために、それは-20°Cで囲まれ、貯えることができる。
4. 細胞増殖能力に応じて、5.0~20 x 10³ 細胞^/cm2の密度で一次角化細胞をシードします。細胞をカバーするのに十分なKGMプロ培地を加える。
   注:1)KGM培地内の通常の細胞培養の詳細は、Lonza¹³のウェブサイトで見つけることができます。2) シード密度は、各細胞株についてテストする必要があります。例えば、通常の一次角化細胞線は5.0 x 10³ 細胞^/cm2の密度で播種することができるが、転写因子p63の突然変異を運ぶ線は20 x 10³ 細胞^/cm2の密度で播種されるべきである。3)実験のセットアップに応じて、いくつかの皿や細胞の井戸は、レプリカの異なる日にサンプルを収集できるようにシードする必要があります。
5. KGMプロ培地で、播種後2日間のセルをリフレッシュします(0日目に播種し、3日目の1^回目 のリフレッシュ)。その後、1日おきにKGMプロメディアでリフレッシュしてください。セルを定期的にチェックします, 少なくとも一日おき.
6. 培地をKGM-difに変えることで、細胞が90%以上のコンフルエントである場合に細胞分化を誘導する。培地をKGM-difに変更する日は、分化日0と定義されます。最初にDPBSで2xを洗浄し、その後(RNA抽出キットから)リシスバッファーに添加することによって、さらなるRNA分析のための細胞を収集します。
   注: 上記のシード密度では、細胞は 7 ~ 10 日以内に合流する必要があります。細胞は、より高い初期密度で播種して、より早く合流に達することができます。細胞が増殖しない場合、待ち時間が長くなり、完全にコンフルエントな細胞が生じなくなる可能性があります。より高い播種密度が必要になる場合があります。
7. KGM-dif培地で細胞を毎日リフレッシュし、分化2日目、4日目に細胞を収集します。さらにRNA抽出のための7。

2. RNA抽出

1. 総RNAを分離する。これは、市販のRNA分離キット(Zymo Quick-RNA MicroPrep RNAなど)を使用して、またはフェノール¹⁴を使用して行うことができます。しかし、DNA汚染やフェノールを防ぐためのRNA-seqサンプルには、DNAAse処理を含む分離キットを推奨します。市販の RNA 分離キットの例は、 材料表に示されています。
2. 分光計でRNA濃度を測定します。DNAとRNAの両方が260nmで吸収ピークを有する。
   注: 1) 260 nm と 280 nm の吸光度の比率は、RNA の純度を評価するために使用されます。約2.0の比率は、一般的に「純粋な」RNAとして受け入れられます。比率が2.0より実質的に低い場合、サンプルはタンパク質、フェノール、または他の物質などの280 nmで吸収する汚染物質で汚染される可能性があります。2) 260nmと230nmの吸光度の比は、核酸の純度を測定する。2.0 と 2.2 の間の比率が予想されます。比率が実質的に低い場合、試料は、EDTA、エタノール、または他の物質などの230 nmで吸収する汚染物質で汚染される可能性があります。

3. RNA品質チェック

1. RNA をバイオアナライザーの RNA ピコ チップ上で実行し、RNA インテグリティナンバー (RIN) を定量的に検証するか、またはゲルで定性的な測定を行います。一般に、少なくとも 8 の RIN は非常に推奨されます。しかし、組織からRNAを抽出する場合には、RINは低くてもよい。
   注: オプションで、品質管理は、RNA材料に対するqPCRによって行うことができます。

4. RNA-セクライブラリ調製

注: RNA-seq ライブラリの準備は、多くの場合、市販キットまたは商用設定で行われます。記載されたプロトコルは、市販キットから適応される、RIBOErase(Illumina)を用いたKAPA RNA HyperPrepキットは、ヒトリボソームRNAへのオリゴハイブリダイゼーションによるrRNA枯渇、RNA断片化、第1鎖合成、第二鎖合成およびA-テーリング、および各ステップ¹⁵後のクリーンアップを簡単に説明する。他のライブラリ準備キットもこの目的に使用できます。生成されたcDNAライブラリの品質は一貫していることが多いため、市販キットを使用してこのステップを実行することをお勧めします。2) 以下の手順は、1x ライブラリの準備について説明します。複数のサンプルを準備する場合は、マスターミックスを10%の追加ボリュームと組み合わせます。

1. オリゴハイブリダイゼーションとrRNA枯渇
   1. オリゴハイブリダイゼーションマスターミックス(合計= 11 μL、ハイブリダイゼーションバッファ4.4 μL、ハイブリダイゼーションオリゴ4.4 μL、RNaseフリー水2.2μL)と枯渇マスターミックス(合計= 5.5 μL、3.3 μLの枯渇バッファー、2.2 μLのRNase H)を準備します。
   2. サーモサイクラーにPCR反応プログラムを設定する:95°C 2分間;-0.1 °C/sで45°Cまで下げます。45 °Cの休止;45°C 30分間。4°Cは永遠に。
      注: 増幅に必要な量の 2 倍の RNA から始めることを検討してください。最初の試みでは、金額の半分を使用して次の手順を続行します。これは、増幅サイクルが不十分または過剰増幅であることが判明した場合に、異なるサイクル数(ステップ4.7.2を参照)でこれらのステップを繰り返す材料がまだあることを確認するためです。
   3. RNAAseフリー水の10 μLで25ngと1μgの総RNAを使用し、10 μLのオリゴハイブリダイゼーションマスターミックスを加えます。事前にプログラムされたサーモサイクラーにサンプルを入れ、プログラムを開始します。
   4. プログラムが45°Cで休止ステップに達したら、サーモサイクラーから取り出すことなく、20 μLのハイブリダイゼーション反応に5 μLの枯渇マスターミックスを加えます。何度か上下にピペットを入れるだけで十分に混ぜます。
   5. サーモサイクラープログラムを再開し、枯渇ステップ(45°C)を30分間継続します。
      注: 1) プロトコルの次の部分の枯渇ステップの間に、rRNAの枯渇のためのビーズ(例えば、KAPA純粋なビーズ)を室温(RT)に置いてください。2) RRNA枯渇クリーンアップの直後に試薬が必要となるので、DNase消化マスターミックス(セクション4.2)を準備することを検討してください。
   6. 2.2xビーズベースのKAPAピュアビーズのクリーンアップを実行する:RNAミックス(25 μL)とKAPAピュアビーズ(55 μL)を組み合わせ、RNAミックス中のビーズを数回ピペット処理して徹底的に再中断します。
   7. RTで5分間インキュベートしてビーズにRNAを結合させ、チューブをマグネットラックに置いてビーズを取り込み、液体が透明になるまでビーズを取り込み、60μLの上清を慎重に取り除いて捨てます。
   8. チューブを磁石に入れ、200 μLの80%エタノールで2倍洗い、≥30 sのエタノールでビーズをインキュベートし、エタノールを捨てます。2回目の洗浄後にビーズを邪魔することなく、残留エタノールをすべて除去してください。
   9. RTでビーズを3~5分間、または全てのエタノールが蒸発するまで乾燥させます。
      注:ビーズを過度に乾燥させると、収率が低下する可能性があります。
2. DNase消化
   1. DNase消化マスターミックス(合計= 22 μL、DNaseバッファー2.2 μL、DNase 2 μL、RNaseフリー水17.8 μL)を準備します。
   2. ドナーゼ消化マスターミックス(20 μL)のビーズを数回上下にピペット処理して再中断します。チューブをRTで3分間インキュベートし、ビーズからRNAを溶出します。
   3. 液体が透明になるまで、マグネットラックにチューブを置いてビーズを取り込み、20 μLの上澄み物を慎重にきれいなチューブに移します。
   4. 37°Cでチューブを30分間インキュベートします。
      注: DNase 消化のクリーンアップ後に直接試薬が必要になるため、RNA溶出、断片化、プライミングマスターミックス(セクション 4.3)を準備することを検討してください。
   5. 4.1.6 ~4.1.9 を実行して、2.2x ビード ベースのクリーンアップを実行します。
3. RNA溶出、断片化、プライミング
   1. フラグメント、プライム、エルルートバッファー(1x)マスターミックスをフラグメント、プライム、エルルートバッファー(2x)11 μL、RNaseフリー水11μLで調製します。
   2. 精製されたDNase処理RNAを22 μLのフラグメンテーション、プライムおよびエルテバッファー(1x)で、ビーズを数回ピペット化して徹底的に再懸濁します。
   3. 室温で3分間インキュベートしてビーズからRNAを溶出し、 チューブを磁石の上に置いて、液体が透明になるまでビーズを捕捉します。
   4. 慎重にチューブに上清の20 μLを移します。ビーズでチューブを捨てます。
      注: サンプルは≤24時間の場合-20 °Cで保存できるため、安全な停止点です。
   5. チューブをサーモサイクラーに入れ、94°Cで6分間断片化とプライミングを行います。およそ200-300 bpの長い断片を生じる。
      注:100~200 bpフラグメントの場合は94°Cで8分間インキュベートしてください。部分的に分解されたRNAを使用する場合、分解の重症度に応じて85°Cで1〜6分の間の断片。
   6. チューブを氷の上に置き、すぐに最初のストランド合成に進みます。
4. 最初のストランド合成
   1. 最初のストランド合成マスターミックス(合計= 12 μL、最初のストランド合成バッファーの11 μLとKAPAスクリプトの1 μL)を準備します。
   2. サーモサイクラーにPCR反応プログラムをセットアップ:25°C 10分間。42°C 15分間。70°C 15分間4°Cは永遠に。
   3. 氷の上で、断片化したプライミングされたRNAの20 μLを、最初のストランド合成マスターミックスの10 μLと組み合わせます。チューブを氷の上に置き、反応を数回軽くピペットで十分に混ぜます。
   4. 事前にプログラムされたサーモサイクラーにチューブを入れ、プログラムを開始します。
5. 第2の鎖の合成およびA-尾行
   1. 2番目のストランド合成と氷の上のAテーリングマスターミックス(合計= 33 μL、2本鎖合成バッファーの31 μL、2μLの第2ストランド合成&Aテーリング酵素ミックス)を準備します。
   2. サーモサイクラーにPCR反応プログラムを設定する:16°C 30分間。62°C 10分間4°Cは永遠に。
   3. 第1ストランド合成製品の30 μLを30 μLの第2の鎖合成とAテーリングマスターミックスと組み合わせ、氷の上で数回上下にピペットで十分に混ぜます。
   4. 事前にプログラムされたサーモサイクラーにチューブを入れ、プログラムを開始します。
6. アダプターライゲーションとリゲーション後のクリーンアップ
   1. 希薄在庫アダプター(NEXTflex DNAバーコード、25 μM)3.57x RNaseフリーウォーターで7 μM。
   2. アダプターライゲーションマスターミックス(合計 = 50 μL、40 μLのライゲーションバッファー、10 μLのDNAリガーゼ) を準備します。
   3. 2本目のストランド合成製品60μL、45μLのアダプターライゲーションマスターミックス、希釈アダプタ5μLを組み合わせます。氷の上で何度か上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。
   4. 20°Cでチューブを15分間インキュベートし、最初のライゲーション後のクリーンアップを直ちに継続します。
   5. アダプタ合わせDNA(110 μL)とKAPA純粋ビーズ(70 μL)を組み合わせて0.63xビーズベースのクリーンアップを行い、数回上下にピペット処理を行い、DNAミックス中のビーズを徹底的に再中断します。
   6. ステップ 4.1.7 ~ 4.1.9 を繰り返します。
   7. マグネットからチューブを取り外します。10 mM Tris HCL(pH = 8.0~8.5)のビーズを50 μLに完全に再中断し、RTで2分間インキュベートします。
   8. 磁石の上にプレートを置き、液体が透明になるまで待ちます。クリア上清の50μLを新しいチューブに移します。
      注:4°Cで24時間未満の安全停止点。
   9. 50 μL のビーズと精製されたアダプター連結 DNA と PEG/NaCL 溶液の 35 μL を組み合わせることで、0.7x ビーズベースのクリーンアップを実行します。渦を入れるだけで十分に混ぜます。
   10. クリーンアップ手順 4.1.7 ~ 4.1.9 を実行します。10 mM Tris HCL(pH = 8.0~8.5)の20 μLでビーズを徹底的に再中断し、RTで2分間インキュベートします。
   11. プレートを磁石の上に置きます。液体が透明になるまで待ちます。20μLの清上清を新しいチューブに移し、セクション4.7に進みます。
       注:4°Cで1週間未満、または-20°Cで1ヶ月未満の安全停止点。
7. ライブラリの増幅とクリーンアップ
   1. ライブラリ増幅マスターミックス(合計= 33 μL、2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixの27.5 μL、10xライブラリ増幅プライマーミックスの5.5 μL)を準備します。
   2. 以下のパラメータを使用して、サーモサイクラーにPCR反応プログラムをセットアップします。98 °C 45 s;N サイクル (以下の注を参照) の: 98 °C 15 s;30 sのための60 °C;30 sのための72 °C;72 °C 1分間;4°Cを永遠に。
      注: ライブラリ増幅のサイクルは、入力マテリアルによって異なります。これは、RNA = 25~100 ng、N = 11~15 サイクルで始まるという概念として推定できます。100–250 ng, N = 9-12 サイクル;250–500 ng、 N = 7-10 サイクル。
   3. 増幅されたライブラリーDNA(50 μL)とKAPA純粋ビーズ(40 μL)を組み合わせて0.8xビーズベースのクリーンアップを行い、数回上下にピペットを作ってDNAミックス中のビーズを徹底的に再懸濁させます。
   4. クリーンアップ手順 4.1.7 ~ 4.1.9 を実行します。10 mM Tris HCL(pH = 8.0~8.5)のビーズを50 μLに完全に再中断し、RTで2分間インキュベートします。
   5. クリア上清の50μLを新しいチューブに移し、第2のライブラリー増幅クリーンアップに進みます。
   6. 増幅されたライブラリーDNA(50μL)とKAPA純粋ビーズ(50 μL)を組み合わせて1xビーズベースのクリーンアップを行い、数回上下にピペットを作ってDNAミックス中のビーズを徹底的に再中断します。
   7. クリーンアップ手順 4.1.7 ~ 4.1.9 を実行します。10 mM Tris HCL (pH = 8.0 ~ 8.5) の 22 μL でビーズを徹底的に再中断し、RT で 2 分間インキュベートします。
   8. クリア上清の20 μLを新しいチューブに移し、Qbitおよびバイオアナライザの測定に進みます。
8. 濃度と断片化のサイズ
   1. サンプルのDNA濃度を測定します。高感度蛍光色素ベースのキット(例えば、Denovix Qbit、 材料表を参照)を使用するか、濃度が0.5 ng/μL未満であるように見える場合は、より敏感なqPCRアプローチを使用して再定量化する(例えば、カッパ定量化、 材料表を参照)。
   2. 高感度電気泳動(例えば、バイオアナライザー)を用いて、ライブラリの断片サイズを決定する。
      注: オプションで、cDNA の代わりに希釈された準備ライブラリを使用して、シーケンス (付録) の前に qPCR による品質管理を行うことができます。
9. シーケンス
   1. シーケンスのためにライブラリを送信します。RNA-seqの遺伝子発現解析では、サンプルあたり10~2500万読み込みの深度で十分です。

5. データの前処理

1. 品質チェック Fastq ファイル
   1. Trimgalore¹⁶ をダウンロードしてインストールすると、Fastq ファイル内の低品質の基本ペアと空の読み取りを削除できます。
      注: 1) ここで言及されているほとんどのソフトウェアは、Linux でのみ動作します。Windowsコンピュータに限定されている場合、ソフトウェアMobaXtermまたはPuttyを使用してLinuxサーバ上で分析を実行することが可能です。ゲノムインデックス作成には、ランダムアクセスメモリ(RAM)が多く必要です(約64 GB)。2) 必要なソフトウェアをすべて conda 環境にインストールすることを強くお勧めします。これにより、ソフトウェアのインストールとパッケージの管理が容易になります。コンダの詳細については、を参照してください。
   2. データのディレクトリ(フォルダ)を作成します(例えば、フォルダの「RNA_seq_KC_diff」)。「cd /ホーム/ユーザー/RNA_seq_KC_diff/」と入力して、これを作業ディレクトリとして設定します。
      注: フォルダ構造の概要については、補足コード ファイルの「folder_structure.txt」を参照してください。
   3. 作業ディレクトリに「Fastq」「CRCh38_fasta」「CRCh38」「スクリプト」「マッピング」という特定の名前を持つ複数のフォルダを作成します。
   4. シーケンスデータの fasta ファイルを fastq フォルダーに移動します。または、ディスク領域を節約するために、Fastq ファイルに対して"ln -s ホーム/ユーザー/old_location_fastq/FastqFile ホーム/ユーザー/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" というコマンドを使用してソフトリンクを生成します。
   5. Fastq ファイルで Trim galore を実行し、bash に貼り付けをコピーするコードの TrimGalore.txt ファイルを参照してください。必要に応じて、コマンド内のフォルダ名と設定を変更します。
2. マッピング
   1. 読み取りをマップするゲノムをダウンロードし、例えばhg38 ensemblリリース97(マスクされていないバージョン):ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz;対応する遺伝子注釈ファイル: hg 38遺伝子注釈 ensemblリリース97、ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz.両方のファイルをCRCh38_fastaフォルダに転送します。
      注:あるいは、遺伝子IDではなく転写IDへのマッピングが好ましい場合は、例えば、ucsCバージョンのhg38などの異なるバージョンのゲノムを使用する。
   2. STAR 2.7.1¹⁷をインストールします。
   3. 生成ゲノムスクリプトによってSTAR 2.7.1を使用して社内参照ゲノムを生成する( 補足的なコーディングファイルを参照)。スレッドの量を、プロセスのプロセスが持っている数に変更します (--runThreadN X)。必要に応じて、このスクリプトのフォルダ名と設定を変更します。bashにコピー/ペーストして実行します。
   4. bamファイルをインデックス化するためのsamtools 1.9¹⁸ をインストールし、ウィグルファイルを圧縮するためにgzipをインストールします。
   5. TRIM Galore検証シーケンシング読み取りを、STAR 2.7.1を使用してヒトゲノムアセンブリhg38(ensemblリリース97)に合わせ、サムツールとgzipを使用してインデックスを作成します。これはスクリプトmap_fastq.txtを使用して実行する必要があります (「 補足的なコーディング ファイル」を参照)。必要に応じて、このスクリプトのフォルダ名と設定を変更します。bashにコピー/貼り付けて実行します。
      注: STAR マッピングでは、bam ファイル、ウィグル ファイル、および読み取りカウント テーブル *_ReadsPerGene.out.tab など、複数の出力ファイルが生成されます。
3. ゲノムブラウザの可視化
   1. ucsCゲノムブラウザツールからwigToBigWigをインストールしてbig2bwスクリプト¹⁹でbigwigファイルを生成します。
   2. 補足のコーディング ファイルから、ファイルの 'convertBigWigChroms.py' と 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' を作業ディレクトリ内のフォルダー 「スクリプト」に転送します。
   3. convertBigWigChroms.pyを実行する (Linux マシンで 'chmod +x スクリプト/変換BigWigChroms.py' コマンドを使用して下さい。
   4. スクリプト wig2bw.txt を使用して、ウィグルファイルから bigWig ファイルを生成します ( 補足コーディングファイルを参照)。bashにコピー/ペーストして実行します。
   5. 視覚化のために UCSC ゲノムブラウザーまたは統合ゲノミクス ビューアー (IGV) 上の BigWig ファイルを入力します。

6. RNA-セクデータ解析

1. Deseq2 へのサンプル データの入力
   1. Rstudio (バージョン 1.1.456) および R (バージョン 3.6) をダウンロードしてインストールします。
   2. 必要な R パッケージをすべてインストールします (補足コーディング ファイルを参照)。
      注: すべてのプログラミング コードと出力を示す詳細な R マークダウン ファイルについては、添付ファイル「RNA_seq_kc_differentiation_wt.html」と「RNA_seq_kc_differentiation_patient.html」を参照してください。すべての手順の一般的な説明を以下に示します。
   3. ファイルからカウント テーブルを生成します。
   4. すべてのファイル名、区別の日、およびその他の関連するサンプル データを含むサンプル データ ファイルを作成します。サンプル ファイルの例については、「 補足コード ファイル」の「sample_data_example.csv」を参照してください。
   5. カウントテーブルとサンプルデータを使用して、カウント可能データとサンプルデータの両方を含むDeseq2²⁰ オブジェクトを生成します。
2. 遺伝子発現の正規化、サンプル距離、PCA
   1. Deseq2 オブジェクトのカウント テーブルを、Deseq2 rld または vst 正規化のいずれかを使用して正規化します。Rldの正規化が好ましいが、多くのサンプルでは、vst正規化ははるかに速い。
   2. R のdist関数を使用して正規化された読み取りカウントの強度に基づいてサンプル距離をプロットし、その後、サンプル距離に基づいて"hclust"クラスタリングを実行します。pheatmap パッケージを使用してヒートマップ自体をプロットします。
   3. Deseq2のplotPCA関数を使用して、正規化された読み取りカウント強度のPCAプロットを生成します。
      注: PCA は探索的データ解析のツールとして機能し、異なるサンプル間の距離と関連を視覚化するために使用できます。
3. 微分/高可変遺伝子発現解析
   1. Deseq2結果関数を使用して、いずれかの微分遺伝子を計算します。ただし、ペアワイズ比較が適用できない複数のタイムポイントの変化を評価する場合は、高変数遺伝子を使用します。この場合、rowVars関数を使用して異なる時点からサンプル間の分散を順序付けして、上位500個の高変数遺伝子を抽出します。
      注:我々の分析では、対照サンプルでは、上位500の高可変遺伝子(分化の日にわたる正規化された強度の最も高い標準偏差を持つ遺伝子)がさらなる分析に使用されました。しかし、疾患対対照分析のために、経時的に疾患と健康なコントロールの間で遺伝子を差し出して発現した遺伝子を、カットオフとして1 x^10-4 の複数の検査補正p値を用いてDeseq2によって計算した。別の可能なフィルタリングステップは、あるフォールド変化カットオフ未満で変化する微分遺伝子を除外することです。
   2. 異なる発現パターンによってそれらをクラスタリングするために、遺伝子の微分または高い可変遺伝子にkmeansクラスタリングを行います。
   3. pheatmap パッケージを使用して、ヒートマップ内の微分または非常に可変の遺伝子を視覚化します。ヒートマップにプロットされる強度は、中央値を減算した、Deseq2 正規化された強度です。
4. 遺伝子オントロジー(GO)アノテーションエンリッチメント解析
   1. 1つのサンプルで10個以上のカウントを持つすべての遺伝子を取ることによって発現した背景遺伝子のリストを生成する。
   2. GOrilla²¹などのオンライン ツールを使用して GO 解析を実行します。クラスター内の微分/高可変遺伝子のリストを「遺伝子リスト」として、背景遺伝子を比較の背景として使用します。
      注: より高度な R ユーザーは、パッケージ clusterProfiler²² を使用して、Go-term エンリッチメント分析を自動化できます。

正常ケラチノサイト分化とRNA-seq分析
本実験では、5個体由来のケラチノサイト線を分化およびRNA-seq解析に用いた。図1は、分化およびRNA-seq分析結果の実験手順を要約した。分化中の正常な角化細胞および細胞形態変化のin vitro分化手順の概要を図1Aに示す。主成分分析(PCA)は、分化を行っているケラチノサイトが、全般的な遺伝子発現プロファイルを結合していたが、それぞれ異なっていることを示した(図1B)。高可変遺伝子は、分化中の遺伝子発現ダイナミクスとパターンを可視化するためにkmeansによってクラスター化された(図1C)。

遺伝子の各クラスターは、ケラチノサイト分化特徴遺伝子(例えば、増殖のためのKRT5、早期および中分化のためのKRT1およびKRT10、後期分化のためのIVL/LOR/FLG)によって表された。遺伝子腫瘍学(GO)遺伝子の遺伝子の注釈解析(図1C)は、これらの遺伝子クラスターの遺伝子機能の明確な違いを示した(例えば、分化の中間段階における角化、および表皮細胞分化、ケラチノサイト分化、およびペプチド架橋後期段階での交差リンク;図1D)。いくつかの分化マーカーのタンパク質発現は、ウェスタンブロッティングにより測定した(図1E)。

P63変異ケラチノサイト分化およびRNA-seq分析:
2番目の実験では、健常性対照からのケラチノサイトとp63変異を持つ患者(変異体R204W、R279H、およびR304W)に由来する3つのラインの細胞形態と遺伝子発現の違いを比較した。 図2Aは 、分化手順および細胞形態変化の概要を示す。変異ケラチノサイトは、皿の表面に平らなままであり、7日目にケラチノサイトをコントロールとして混雑または重なり合った成長にはならなかった。

PCA 分析では、コントロールセルラインは 、図 1Bと比較して、明確に分化パターンに従った。しかし、分化中の変異細胞の遺伝子発現パターンは、増殖/未分化細胞のパターンとほぼ同じままである。3つの変異線のうち、分化したR279サンプルはある程度PC1とPC2に沿って移動し、R204WおよびR304Wと比較してその分化が少ないことを示す。

クラスタリング解析(図2C)では、コントロール細胞(クラスタ1)でダウンレギュレートされた遺伝子はR204WおよびR279Wでは部分的にダウンレギュレートされたが、R304Wでは遺伝子発現が大幅に変化しなかった。GOアノテーション(図2D)に示すように、これらの遺伝子は細胞増殖に役割を果たす可能性が高い。クラスター2(図2C)において、遺伝子はまず制御細胞において最初に誘導され、その後ダウンレギュレートされた。これらの遺伝子は、このクラスター遺伝子に対して表皮分化および角化機能が高く富化したため、ケラチノサイト分化に関与する可能性が高い(図2D)。これらの遺伝子はR204WおよびR304Wでは誘導されなかったが、R279H細胞では、これらの遺伝子は誘導されたが、コントロール細胞ほどダウンレギュレートされなかった。

クラスター3の遺伝子は、コントロール細胞における分化の終わりにのみ誘導された(図2D)。これと一致して、これらの遺伝子は、外部刺激および炎症に対して応答性であることが示されているように、表皮の最外層に役割を有し得る(図2D)。これらの遺伝子の発現パターンは、3つの変異細胞系すべてにおいてあまり変化しなかった。対照細胞と変異細胞の間の遺伝子発現パターンの目に見える違いは、変異細胞がこれらのインビトロ分化モデルにおいて適切に分化できないことを示している。

図1:ケラチノサイトの分化と分析。(A) ケラチノサイト分化プロトコルと細胞形態の概要。スケールバー= 100 μm. (B) 分化制御角化細胞の主成分分析。 (C) ケラチノサイト分化中の上位500個の高可変遺伝子のヒートマップ。遺伝子は、kmeanクラスタリングを使用して3つのクラスターにクラスター化されます。各遺伝子クラスターの代表的な分化マーカー遺伝子は、側面に示されている。 (D)GO 用語は、全発現遺伝子の背景と比較して、高可変遺伝子クラスター中の遺伝子に対する過剰発現機能の濃縮分析(>10のカウント)。GOrillaは濃縮試験に使用されました。 (e) 分化中のケラチノサイト分化マーカーのウェスタンブロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:対照とp63変異角化細胞の比較。(A) ケラチノサイト分化プロトコルの概要および制御およびp63変異角化細胞の細胞形態。スケール= 100 μm. (B) 分化制御および患者(R204W、R279HおよびR304W)ケラチノサイトの主成分分析。 (C) 対照と変異角化細胞との間の差動遺伝子のヒートマップ。遺伝子は、kmeanクラスタリングを使用して3つのクラスターにクラスター化されます。各遺伝子クラスターに対する代表的な分化マーカー遺伝子が示されている。 (D)GO 用語は、全発現遺伝子の背景と比較して、高可変遺伝子クラスター中の遺伝子に対する過剰発現機能の濃縮分析(>10のカウント)。GOrillaは濃縮試験に使用されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1.KGM プロ培地サプリメント.

表 2.KGM-相違培地サプリメント.

補足的なコーディング ファイル: Folder_structure.txt;Generate_genome.txt;Map_fastq.txt;RNA_seq_kc_differentiation_patient.html;RNA_seq_kc_differentiation_wt.html;Sample_data_example.csv;トリムガロア.txt;そしてWig2bw.txt。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

本研究では、RNA-seq解析を用いてヒトケラチノサイト分化とその後の特性解析を誘導する方法について説明する。現在の文献では、ヒトケラチノサイト分化に関する多くの研究は、他の2つの方法を使用し、高カルシウム濃度または血清を用いて分化を誘導する方法^{として2、3、23。}以前の報告では、これら3つの異なる方法³を慎重に比較し、これらの方法がケラチノサイト分化の異なる生物学を表し得る示した。この報告書では、血清によって誘導される分化細胞は、乾癬皮膚で発現されるが正常な表皮では発現しないKRT16およびSKALP/PI3のような高い増殖性および発現遺伝子を有し、したがって血清誘発分化モデルを使用して乾癬を研究できることを示した。対照的に、接触阻害と成長因子排除の方法は、通常表皮で発現し、正常な角化細胞分化に似ているKRT1およびKRT10を誘導することができる。高カルシウム誘導は、最も特異的な方法として、血清誘導と接触阻害の間にある遺伝子発現プロファイルを生じさせる。分化中のRNA-seq分析を用いた分析により、接触阻害法と成長因子排除法は、表皮分化に期待されるものと同様の遺伝子発現プロファイルを有する分化ケラチノサイト(例えば、初期分化誘導におけるKRT5、KRT1およびKRT10、後期分化におけるKRT1およびKRT10)を生じることが確認された。図1C)。

これらの知見は、この分化技術がケラチノサイト分化を研究するための使いやすく信頼性の高い方法であることを示している。さらに、この研究は、p63変異角化細胞に由来するケラチノサイトに関する研究は、疾患条件下で影響を受けたケラチノサイト分化の研究に使用できることを示している。このインビトロ分化アプローチでは、ロンザから購入したKGMが使用され、この媒体は一貫した結果をもたらす。原則として、サーモフィッシャーサイエンティフィック由来のケラチノサイト血清遊離培地(KSFM)のような類似の組成物を有する他の表皮培地も適している可能性が高いが、これを試験する必要がある。

なお、この方法には、いくつかの制限があります。接触阻害に基づいているため、細胞密度の合流性が要求される。p63変異角化細胞を用いた実験では、細胞が合流するようにするためには、より高い初期播種密度が必要であった。また、細胞が同じ速度で増殖しない場合、異なる日に分化を誘発しなければならない場合があります。実験をセットアップする際には、これらの考慮事項を考慮する必要があります。細胞を同時に誘導する必要がある実験設定では、血清の添加、カルシウムの高濃度、および表皮成長因子受容体^2、3の阻害を含む他の分化方法を考慮すべきである。それにもかかわらず、インビトロ分化法はすべて、インビボ皮膚発達^中に存在する部分的な分化誘導シグナルを表す可能性があるため、賛美および短所を有する。

これらの異なる方法を比較する包括的な分子解析は、非常に有益であり、生物学的プロセスに関する異なる研究に最も適した方法の選択を指示することができます。さらに、転写レベルで測定された変化を検証することは、例えば、ウェスタンブロッティングまたはプロテオミクス分析を介して、非常に助言される。さらに、in vitroデータは慎重に使用する必要があり、これらのモデルからの結論は、好ましくはヒト皮膚発達において、生体内で検証されるべきである。

RNA抽出およびRNA-seqライブラリー調製の基本原理は、前に24、25、26、27、28に記載されている。このプロトコルでは、RNA抽出およびRNA-seqライブラリ調製手順は、市販キットのワークフローに基づいています。RNAの品質が良い場合、原理的に、RNA抽出のための異なる方法は、RNA-seq分析に大きな影響を与えるべきではありません。RNAの品質が悪い場合(すなわち、RNAがホルマリン固定パラフィン包埋組織を抽出した場合)、RNA-seqを引き続き実行することができます。ただし、RNA の断片化ステップは調整する必要があります。RNA-seqライブラリ調製は、リボソームRNA(rRNA)除去からシーケンシング用のcDNAライブラリ構築までカバーします。主要な手順は、様々なキットを使用して、または個々の酵素と自家製バッファー29、30、31、32を使用して行うことができる。RNA-seq分析が異なる基本原理(例えば、ポリトオリゴへのハイブリダイゼーションによるリボソームRNA枯渇またはポリAmRNA濃縮のいずれか)を用いて行われる場合、RNA-seq分析の結果が異なる場合があります。さらに、このプロトコルは、ヒト、マウス、およびラットrRNAに対するDNAオリゴのハイブリダイゼーションによるリボソームRNA除去を利用する。異なる種で作業する場合は、代替オリゴセットを採用する必要があります。

生成されたライブラリーのシーケンスは、フラグメントの両端(ペアエンド)またはフラグメントの一端(単一端)で行うことができる。一般に、ペアエンドシーケンスは、マッピング可能性を大幅に向上させ、トランスクリプトバリアントに関するより多くの情報を提供します。しかし、ここで説明する比較的単純な微分遺伝子解析では、シングルエンドシーケンシングも十分な情報を提供できる。

データ解析の重要なステップでは、fastqファイルの品質管理のための比較的簡単な方法を説明し、続いて読み取りをゲノムにマッピングします。提供された bash コードは、理想的なスケーラビリティを持っていませんが、透過性の利点があります。ソフトウェアの選択、それが実行するステップ、およびデータの前処理中に使用されるゲノムのバージョンは、すべて十分に文書化されるべき重要なステップであり、反復性に不可欠です。

より高度なユーザーのために、自動化されたパイプラインは、fastQファイル品質チェック、アダプタトリミングとマッピングの手順を実行するために使用することができます,例えばARMORスネークメイクワークフロー³³ またはファンHeheingenラボ³⁴からの'RNA-seq'スネークメイクワークフロー。ただし、これらの完全に自動化されたパイプラインは、透明性が低く、変更が難しくなります。これらのツールを使用する場合、これらの自動化されたパイプライン内の機能を理解することが重要です。最後に、このプロトコルには、時間の経過に伴う可変的な遺伝子発現に重点を置いたRNA-seqデータ分析が含まれます。分化などの複数のタイムポイントを持つプロセスを見る場合、遺伝子発現は対方向の微分検査よりも好ましい。結論として、この分析パイプラインは、RNAEqデータのバイオインフォマティクス分析に関連するツールを導入しています。これは、正常な疾患と病気の条件の両方で、ケラチノサイト分化を徹底的に評価することができるツールが含まれています。

著者らは開示するものは何もない。

この研究はオランダ科学研究機構(NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010,H.Z.)によって支援されました。(NWO/ALW/オープンコンペティション/ALWOP 376、H.Z.、J.G.A.S.);ラドボウド大学フェローシップ(H.Z.);中国奨学金評議会助成金201406330059(J.Q.)