Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide^1,2,3,4. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D^2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.

Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l'aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico^2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specifici^{di geni marcatori 2,3}.

Uno di questi metodi prevede l'inibizione del contatto dei cheratinociti e l'esaurimento dei fattori di crescita nel mezzo^{di coltura 8}. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l'inibizione del contatto e l'esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici³, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell'espressione genica della differenziazione dei cheratinociti^{utilizzando questo modello 9,10}. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.

Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l'analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)^11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell'RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l'estrazione dell'RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Le biopsie cutanee sono state prelevate dal tronco di volontari sani o pazienti con mutazioni p63, per impostare la coltura primaria di cheratinociti. Tutte le procedure relative alla creazione di cheratinociti primari umani sono state approvate dal comitato etico del Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). È stato ottenuto il consenso informato.

1. Differenziazione dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto

1. Preparare il mezzo di crescita dei cheratinociti (KGM) dal mezzo basale cheratinocita(tabella dei materiali)quando necessario.
2. Realizzare un mezzo di proliferazione di 500 mL utilizzando scorte pre-preparate (KGM-pro; cfr. tabella 1).
3. Rendere mezzo di differenziazione di 500 mL (KGM-dif; vedi tabella 2).
   NOTA: KGM con integratori può essere conservato a 4 °C per due settimane. Per una conservazione più lunga, può essere aliquotato e conservato a -20°C.
4. Seme cheratinociti primari nella densità di 5,0-20 x 10³ cellule/cm², a seconda della capacità proliferativa cellulare. Aggiungere un mezzo KGM-pro sufficiente per coprire le cellule.
   NOTA: 1) I dettagli della coltura cellulare regolare all'interno del mezzo KGM sono disponibili nel sito web di Lonza¹³. 2) La densità di semina deve essere testata per ciascuna linea cellulare. Ad esempio, una normale linea primaria di cheratinociti può essere seminata ad una densità di 5,0 x 10³ cellule/cm 2 ,^mentreuna linea che porta mutazioni nel fattore di trascrizione p63 meno proliferativa deve essere seminata ad una densità di 20 x 10³ cellule/cm². 3) A seconda dell'insieme sperimentale, diversi piatti o pozzi di cellule devono essere seminati per consentire la raccolta di campioni in diversi giorni di differenziazione nelle repliche.
5. Aggiornare le cellule con il mezzo KGM-pro per due giorni dopo la semina (semina il giorno 0, rinfrescante per l'ora di 1^° il giorno 3). Successivamente, rinfrescarsi con il mezzo KGM-pro a giorni diversi. Controllare regolarmente le celle, almeno a giorni dall'altro.
6. Indurre la differenziazione cellulare quando le cellule sono più del 90% confluenti cambiando il mezzo in KGM-dif. Il giorno del passaggio da medio a KGM-dif è definito come giorno di differenziazione 0. Raccogliere le cellule per ulteriori analisi dell'RNA lavando prima 2 volte con DPBS, successivamente aggiungendo nel tampone di lisi (da un kit di estrazione dell'RNA).
   NOTA: Con la densità di semina di cui sopra, le cellule devono raggiungere la confluenza entro 7-10 giorni. Le cellule possono essere sementi con una densità iniziale più elevata per raggiungere prima la confluenza. Se le cellule non sono proliferativi, l'attesa più lunga potrebbe non dar luogo a cellule completamente confluenti. Potrebbe essere necessaria una maggiore densità di semina.
7. Aggiornare le celle con il mezzo KGM-dif ogni giorno e raccogliere le cellule il giorno di differenziazione 2, 4. e 7 per un'ulteriore estrazione dell'RNA.

2. Estrazione dell'RNA

1. Isolare l'RNA totale. Questo può essere eseguito utilizzando un kit di isolamento dell'RNA commerciale (come Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA) o utilizzando fenolo¹⁴. Tuttavia, un kit di isolamento contenente un trattamento DNAsi è altamente raccomandato per campioni di RNA-seq per prevenire la contaminazione del DNA e il fenolo. Un esempio di kit di isolamento dell'RNA commerciale è fornito nella tabella dei materiali.
2. Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrometro. Sia il DNA che l'RNA hanno un picco di assorbimento a 260 nm.
   NOTA: 1) Il rapporto tra le assorbanze a 260 nm e 280 nm viene utilizzato per valutare la purezza dell'RNA. Un rapporto di circa 2,0 è generalmente accettato come RNA "puro". Se il rapporto è sostanzialmente inferiore a 2,0, il campione potrebbe essere contaminato da contaminanti che assorbono a 280 nm come proteine, fenoli o altre sostanze. 2) Il rapporto tra le assorbanze a 260 nm e 230 nm misura la purezza dell'acido nucleico. È previsto un rapporto tra 2,0 e 2,2. Se il rapporto è sostanzialmente inferiore, il campione potrebbe essere contaminato da contaminanti che assorbono a 230 nm come EDTA, etanolo o altre sostanze.

3. Controllo qualità RNA

1. Eseguire l'RNA su un chip RNA Pico bioanalizzatore per convalidare quantitativamente il numero di integrità dell'RNA (RIN) o su un gel per una misura qualitativa. In generale, un RIN di almeno otto è altamente consigliabile. Tuttavia, quando si estrae l'RNA dai tessuti, il RIN può essere inferiore.
   NOTA: Opzionalmente, il controllo di qualità può essere eseguito da qPCR sul materiale dell'RNA.

4. Preparazione della libreria RNA-seq

NOTA: La preparazione della libreria RNA-seq viene spesso eseguita con un kit commerciale o in ambienti commerciali. Il protocollo descritto è adattato da un kit commerciale, KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase (Illumina), con una breve descrizione di tutti i passaggi richiesti: esaurimento dell'rRNA con ibridazione dell'oligo agli RRNA ribosomiali umani, frammentazione dell'RNA, sintesi del primo filamento, sintesi del secondo filamento e a coda A e pulizia dopo ogni^{passaggio 15}. Altri kit di preparazione della biblioteca possono essere utilizzati anche per questo scopo. Si consiglia di eseguire questo passaggio utilizzando un kit disponibile in commercio, poiché la qualità della libreria cDNA generata è spesso più coerente. 2) I seguenti passaggi sono descritti per la preparazione della libreria 1x. Se si preparano più campioni, creare miscele master con un volume aggiuntivo del 10%.

1. Ibridazione oligo e esaurimento rRNA
   1. Preparare il master mix di ibridazione dell'oligo (totale = 11 μL, con 4,4 μL di tampone di ibridazione, 4,4 μL di oligo di ibridazione e 2,2 μL di acqua priva di RNasi) e master mix di esaurimento (totale = 5,5 μL, con 3,3 μL di tampone di esaurimento e 2,2 μL di RNasi H).
   2. Impostare il programma di reazione PCR su un termociclo: 95 °C per 2 min; rampa fino a 45 °C a -0,1 °C/s; Pausa di 45 °C; 45 °C per 30 min; 4 °C per sempre.
      NOTA: Prendere in considerazione l'idea di iniziare con il doppio della quantità di RNA rispetto al necessario per l'amplificazione. Nel primo tentativo, utilizzare la metà dell'importo per continuare con i passaggi seguenti. Questo per assicurarsi che ci sia ancora materiale per ripetere questi passaggi con un numero diverso di cicli (vedi fase 4.7.2), se i cicli di amplificazione si sono risultati insufficienti o sovraamplificati.
   3. Utilizzare tra 25 ng e 1 μg di RNA totale in 10 μL di acqua priva di RNAse, aggiungere 10 μL di mix master di ibridazione oligo. Posizionare i campioni nel termociclore pre-programmato e avviare il programma.
   4. Quando il programma raggiunge il passo di pausa a 45 °C, aggiungere 5 μL di mix master di esaurimento alla reazione di ibridazione di 20 μL senza rimuoverlo dal termociclo. Mescolare accuratamente pipettando su e giù più volte.
   5. Riprendere il programma termociclo per continuare con la fase di esaurimento (45 °C per 30 min).
      NOTA: 1) Mettere le perline per l'esaurimento dell'rRNA (ad esempio, perline pure KAPA) a temperatura ambiente (RT) durante la fase di esaurimento per la parte successiva del protocollo. 2) Prendere in considerazione la preparazione della miscela principale di digestione della DNasi (per la sezione 4.2), poiché i reagenti sono necessari direttamente dopo la pulizia dell'esaurimento del rRNA.
   6. Eseguire una pulizia kapa pure beads a base di perline 2,2x: combinare il mix di RNA (25 μL) e KAPA Pure Beads (55 μL), rimornendo accuratamente le perline nel mix di RNA pipettando su e giù più volte.
   7. Incubare a RT per 5 minuti per consentire il legame dell'RNA alle perline e posizionare i tubi su un rack magnetico per catturare le perline fino a quando il liquido non è limpido e rimuovere e scartare con cura 60 μL di supernatante.
   8. Mantenendo i tubi sul magnete, lavare 2x con 200 μL di 80% di etanolo incubando le perline con l'etanolo per ≥30 s e scartare l'etanolo. Cercare di rimuovere tutto l'etanolo residuo senza disturbare le perline dopo il secondo lavaggio.
   9. Asciugare le perline a RT per 3-5 minuti o fino a quando tutto l'etanolo non è evaporato.
      NOTA: L'asciugatura esoria delle perline può comportare una resa ridotta.
2. Digestione della DNasi
   1. Preparare la miscela principale di digestione della DNasi (totale = 22 μL, con 2,2 μL di tampone di DNasi, 2 μL di DNasi e 17,8 μL di acqua priva di RNasi) .
   2. Rimescolare le perline nella miscela principale di digestione della DNAsi (20 μL) pipettando su e giù più volte. Incubare i tubi a RT per 3 minuti per elutare l'RNA dalle perline.
   3. Posizionare i tubi su un rack magnetico per catturare le perline, fino a quando il liquido non è limpido, e trasferire con cura 20 μL di supernatante in un tubo pulito.
   4. Incubare i tubi con supernatante a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: Prendere in considerazione la preparazione delle miscele master di eluizione, frammentazione e adescamento dell'RNA (per la sezione 4.3), poiché i reagenti sono direttamente necessari dopo la pulizia della digestione della DNasi.
   5. Eseguire una pulizia basata su perline 2.2x seguendo 4.1.6–4.1.9.
3. Eluizione, frammentazione e adescamento dell'RNA
   1. Preparare il mix master Fragment, Prime ed Elute Buffer (1x) con 11 μL di Fragment, Prime ed Elute Buffer (2x) e 11 μL di acqua priva di RNasi.
   2. Rimescolare accuratamente le perline con RNA purificato trattato con DNasi in 22 μL di frammentazione, Prime ed Elute Buffer (1x) pipettando su e giù più volte.
   3. Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti per elutare l'RNA dalleperline, quindi posizionare i tubi su un magnete per catturare le perline fino a quando il liquido non è limpido.
   4. Trasferire con cura 20 μL di supernatante in uno o più tubi. Scartare i tubi con perline.
      NOTA: Si tratta di un punto di arresto sicuro, in quanto i campioni possono essere conservati a -20 °C per ≤24 ore.
   5. Posizionare i tubi in un termociclo ed eseguire la frammentazione e l'adescamento a 94 °C per 6 min. Risultando in frammenti lunghi circa 200-300 bp.
      NOTA: Incubare per 8 min a 94 °C per 100-200 frammenti di bp. Quando si utilizza RNA parzialmente degradato, frammentare tra 1-6 minuti a 85 °C a seconda della gravità della degradazione.
   6. Posizionare i tubi sul ghiaccio e procedere immediatamente alla sintesi del primo filamento.
4. Sintesi del primo filamento
   1. Preparare il primo mix di master di sintesi del filamento (totale = 12 μL, con 11 μL di buffer di sintesi del primo filamento e 1 μL di scrittura KAPA).
   2. Impostare il programma di reazione PCR su un termociclo: 25 °C per 10 min; 42 °C per 15 min; 70 °C per 15 min; 4 °C per sempre.
   3. Sul ghiaccio, combinare 20 μL di RNA singolo frammentato con 10 μL del primo mix di master di sintesi del filamento. Tenere i tubi sul ghiaccio, mescolare accuratamente tubazionando delicatamente la reazione su e giù più volte.
   4. Posizionare i tubi nel termociclore pre-programmato e avviare il programma.
5. Seconda sintesi del filamento e A-tailing
   1. Preparare la sintesi del secondo filamento e la miscela principale di coda A sul ghiaccio (totale = 33 μL, con 31 μL di tampone di sintesi del secondo filamento e 2 μL di sintesi del secondo filamento e miscela enzimatica A-tailing).
   2. Impostare il programma di reazione PCR su un termociclo: 16 °C per 30 min; 62 °C per 10 min; 4 °C per sempre.
   3. Combinare 30 μL di prodotto di sintesi del primo filamento con 30 μL di sintesi del secondo filamento e mix principale di coda A, e mescolare accuratamente pipettando su e giù più volte sul ghiaccio.
   4. Posizionare i tubi nel termociclore pre-programmato e avviare il programma.
6. Legatura dell'adattatore e pulizia post-legatura
   1. Diluire gli adattatori stock (codici a barre NEXTflex DNA, 25 μM) 3,57x in acqua priva di RNasi a 7 μM.
   2. Preparare il master mix di legatura dell'adattatore (totale = 50 μL, con 40 μL di tampone di legatura e 10 μL di DNA ligasi).
   3. Combinare 60 μL di prodotto di sintesi del secondo filamento, 45 μL di mix principale di legatura dell'adattatore e 5 μL di adattatori diluiti. Mescolare accuratamente pipettando su e giù più volte sul ghiaccio.
   4. Incubare i tubi a 20 °C per 15 minuti e continuare immediatamente con la prima pulizia post legatura.
   5. Eseguire una pulizia basata su perline 0,63x combinando DNA legato adattatore (110 μL) e perline pure KAPA (70 μL), quindi rimpischiare accuratamente le perline nel mix di DNA pipettando su e giù più volte.
   6. Ripetere i passaggi da 4.1.7 a 4.1.9.
   7. Rimuovere i tubi dal magnete. Rimescolare accuratamente le perline in 50 μL di Tris HCL da 10 mM (pH = 8,0-8,5) e incubare le perline a RT per 2 min.
   8. Posizionare la piastra sul magnete e attendere che il liquido sia limpido. Trasferire 50 μL del supernatante trasparente in un nuovo tubo.
      NOTA: Punto di arresto sicuro per meno di 24 ore a 4 °C.
   9. Eseguire una pulizia basata su perline 0,7x combinando 50 μL di perline con DNA legato adattatore purificato con 35 μL di soluzione PEG/NaCL. Mescolare accuratamente con il vortice.
   10. Eseguire i passaggi di pulizia 4.1.7–4.1.9. Rimescolare accuratamente le perline in 20 μL di Tris HCL da 10 mM (pH = 8,0-8,5) e incubare le perline a RT per 2 min.
   11. Posizionare la piastra sul magnete; attendere che il liquido sia limpido. Trasferire 20 μL del supernatante trasparente su un nuovo tubo e procedere al punto 4.7.
       NOTA: Punto di sosta sicuro per meno di 1 settimana a 4 °C o meno di 1 mese a -20 °C.
7. Amplificazione e pulizia della biblioteca
   1. Preparare il master mix di amplificazione della libreria (totale = 33 μL, con 27,5 μL di 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5,5 μL di mix di primer di amplificazione della libreria 10x).
   2. Impostare il programma di reazione PCR su un termociclo utilizzando i seguenti parametri. 98 °C per 45 s; N cicli (vedi la nota seguente) di: 98 °C per 15 s; 60 °C per 30 s; 72 °C per 30 s; 72 °C per 1 min; e 4 °C per sempre.
      NOTA: I cicli per l'amplificazione della libreria dipendono dal materiale di ingresso. Può essere approssimativamente stimato come tale: a partire dall'RNA = 25-100 ng, N = 11-15 cicli; 100–250 ng, N = 9-12 cicli; 250–500 ng, N = 7-10 cicli.
   3. Eseguire una pulizia a base di perline 0,8x combinando DNA della libreria amplificata (50 μL) e perline pure KAPA (40 μL), quindi rimpischiare accuratamente le perline nel mix di DNA pipettando su e giù più volte.
   4. Eseguire i passaggi di pulizia 4.1.7–4.1.9. Rimescolare accuratamente le perline in 50 μL di Tris HCL da 10 mM (pH = 8,0-8,5) e incubare le perline a RT per 2 min.
   5. Trasferire 50 μL del supernatante trasparente su un nuovo tubo e procedere alla pulizia di amplificazione della seconda libreria.
   6. Eseguire una pulizia a base di perline 1x combinando DNA della libreria amplificata (50 μL) e perline pure KAPA (50 μL), quindi rimpicolare accuratamente le perline nel mix di DNA pipettando su e giù più volte.
   7. Eseguire i passaggi di pulizia 4.1.7–4.1.9. Rimescolare accuratamente le perline in 22 μL di Tris HCL da 10 mM (pH = 8,0-8,5) e incubare le perline a RT per 2 min.
   8. Trasferire 20 μL del supernatante trasparente su un nuovo tubo procedere alle misurazioni Qbit e bioanalizzatore.
8. Dimensioni di concentrazione e frammentazione
   1. Misurare le concentrazioni di DNA dei campioni. Utilizzando un kit a base di colorante fluorescente altamente sensibile (ad esempio, Denovix Qbit, vedi Tabella dei materiali), o se la concentrazione sembra essere inferiore a 0,5 ng/μL, quantificare utilizzando un approccio qPCR più sensibile (ad esempio, quantificazione Kappa, vedi Tabella dei materiali).
   2. Determinare la dimensione del frammento della libreria, utilizzando un'elettroforesi ad alta sensibilità (ad esempio, un bioanalizzatore).
      NOTA: facoltativamente, il controllo di qualità da parte di qPCR può essere eseguito prima del sequenziamento (Appendice) utilizzando una libreria preparata diluita anziché cDNA.
9. Sequenziamento
   1. Inviare la libreria per il sequenziamento. Per l'analisi dell'espressione genica differenziale RNA-seq, una profondità di sequenziamento delle letture compresa tra 10 e 25 milioni per campione è generalmente sufficiente.

5. Pre-trattamento dei dati

1. Controllo qualità file Fastq
   1. Scaricare e installare Trimgalore^{16 per rimuovere coppie} di basi di bassa qualità e letture vuote all'interno dei file Fastq.
      NOTA: 1) La maggior parte del software menzionato qui funziona solo in Linux. Se limitato a un computer Windows, è possibile eseguire analisi su un server Linux utilizzando il software MobaXterm o Putty. Tieni presente che per l'indicizzazione del genoma è necessaria molta memoria ad accesso casuale (RAM) (circa 64 GB). 2) Si consiglia vivamente di installare tutto il software necessario in un ambiente conda. Ciò consentirà una facile installazione del software e la gestione dei pacchetti. Per ulteriori informazioni su conda, visitare .
   2. Creare una directory (cartella) per i dati, ad esempio la cartella 'RNA_seq_KC_diff'. Impostare questa impostazione come directory di lavoro digitando: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      NOTA: per una panoramica della struttura delle cartelle, vedere "folder_structure.txt" nei file di codifica supplementari.
   3. Creare diverse cartelle nella directory di lavoro con i nomi specifici: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'script' e 'Mapping'.
   4. Spostare i file fasta dei dati sequenziati nella cartella fastq. In alternativa, generare collegamenti soft utilizzando il comando "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" nei file Fastq per risparmiare spazio su disco.
   5. Eseguire Trim a bizzerri sui file Fastq, vedere il file TrimGalore.txt per il codice da copiare in bash. Modificare i nomi e le impostazioni delle cartelle all'interno del comando, se necessario.
2. Mapping
   1. Scaricare un genoma per mappare le letture, ad esempio hg38 ensembl release 97 (versione smascherata): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; e il corrispondente file di annotazione genica: hg 38 gene annotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Trasferire entrambi i file nella CRCh38_fasta cartella.
      NOTA: In alternativa, utilizzare una versione diversa del genoma, ad esempio la versione UCSC di hg38, se si preferisce mappare agli ID trascrizione piuttosto che agli ID gene.
   2. Installare STAR 2.7.1¹⁷.
   3. Generare un genoma di riferimento interno utilizzando STAR 2.7.1 mediante lo script generate genome (vedere Supplemental Coding Files). Modificare la quantità di thread in quella del processatore (--runThreadN X). Modificare i nomi e le impostazioni delle cartelle in questo script, se necessario. Eseguilo copiando / incollando in bash.
   4. Installare samtools 1.9^{18 per} l'indicizzazione dei file bam e gzip per comprimere i file di deformazione.
   5. Allineare le letture di sequenziamento convalidate Trim Galore all'assieme del genoma umano hg38 (ensembl release 97) utilizzando STAR 2.7.1 seguito dall'indicizzazione utilizzando samtools e gzip. Questa operazione deve essere eseguita utilizzando lo script map_fastq.txt (vedere File di codifica supplementari). Modificare i nomi e le impostazioni delle cartelle in questo script, se necessario. Eseguito copiando / incollando in bash.
      NOTA: il mapping STAR genera diversi file di output, tra cui un file bam, un file di deformazione e una tabella di conteggi di lettura denominata *_ReadsPerGene.out.tab, che può essere utilizzata direttamente concatenato da R per essere utilizzato come input per Deseq2.
3. Visualizzazione del browser del genoma
   1. Installare wigToBigWig dagli strumenti del browser del genoma UCSC per generare file bigwig con lo script big2bw¹⁹.
   2. Trasferire i file 'convertBigWigChroms.py' e 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' dai file di codifica supplementari a una cartella 'script' nella directory di lavoro.
   3. Rendere l convertBigWigChroms.py eseguibile (utilizzando il comando: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' su una macchina Linux).
   4. Generare file bigWig dai file Wiggle utilizzando lo script wig2bw.txt (vedere File di codifica supplementari). Eseguilo copiando / incollando in bash.
   5. Inserire i file BigWig nel browser del genoma UCSC o nell'IGV (Integrative Genomics Viewer) per la visualizzazione.

6. Analisi dei dati RNA-seq

1. Inserire dati di esempio in Deseq2
   1. Scaricare e installare Rstudio (versione 1.1.456) e R (versione 3.6).
   2. Installare tutti i pacchetti R necessari (vedere File di codifica supplementari).
      NOTA: per un file R-markdown dettagliato che mostra tutto il codice di programmazione e l'output, vedere i file allegati: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" e "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Di seguito è riportata una descrizione generale di tutti i passaggi.
   3. Generare una tabella di conteggio dai file ReadsPerGene.out.tab.
   4. Scrivere un file di dati di esempio contenente tutti i nomi di file, il giorno della differenziazione e altri dati di esempio pertinenti. Per un file di esempio, vedere "sample_data_example.csv" in Supplemental Coding Files.
   5. Utilizzare la tabella count e i dati di esempio per generare un oggetto Deseq2²⁰ contenente sia i dati countable che sample.
2. Normalizzazione dell'espressione genica, distanza del campione e PCA
   1. Normalizzare la tabella di conteggio nell'oggetto Deseq2 utilizzando Deseq2 rld o vst normalization. La normalizzazione Rld è preferita, ma con molti campioni, la normalizzazione vst è molto più veloce.
   2. Traccia la distanza del campione in base alle intensitànormalizzate delconteggio delle lette usando la funzione " dist " in R e successivamente eseguendo il clustering "hclust" in base alla distanza del campione. Traccia la mappa termica stessa usando il pacchetto pheatmap.
   3. Generate un plottaggio PCA delle intensità di conteggio delle lette normalizzate utilizzando la funzione plotPCA di Deseq2.
      NOTA: IL PCA funge da strumento nell'analisi esplorativa dei dati e può essere utilizzato per visualizzare la distanza e la relazione tra diversi campioni.
3. Analisi dell'espressione genica differenziale/altamente variabile
   1. Calcolare i geni differenziali utilizzando la funzione di risultato Deseq2. Tuttavia, quando si valutano i cambiamenti in diversi punti di tempo in cui i confronti a coppie non sono applicabili, utilizzare geni altamente variabili. In questo caso, estrarre i primi 500 geni altamente variabili ordinando la varianza tra campioni da diversi punti di tempo con la funzione rowVars.
      NOTA: Nella nostra analisi, per i campioni di controllo, i primi 500 geni altamente variabili (i geni con la più alta deviazione standard della loro intensità normalizzata attraverso i giorni di differenziazione) sono stati utilizzati per ulteriori analisi. Tuttavia, per l'analisi menteta vs controllo i geni espressi in modo differenziato tra malattia e controlli sani nel tempo sono stati calcolati da Deseq2 utilizzando un valore p corretto di test multipli di 1 x 10^-4 come cutoff. Un altro possibile passo di filtraggio è quello di escludere i geni differenziali che cambiano meno di un certo taglio del cambiamento di piegatura.
   2. Eseguire il clustering dei kmeani sui geni differenziali o altamente variabili per raggrupparli in base a diversi modelli di espressione.
   3. Visualizza geni differenziali o altamente variabili in una mappa termica usando il pacchetto pheatmap. L'intensità tracciata nella mappa termica è l'intensità normalizzata Deseq2 con il valore mediano sottratto.
4. Analisi dell'arricchimento delle annotazioni go (Gene Ontology)
   1. Genera un elenco di geni di sfondo espressi prendendo tutti i geni con più di 10 conteggi in un singolo campione.
   2. Eseguire l'analisi GO utilizzando strumenti online come GOrilla²¹. Utilizzare gli elenchi dei geni differenziali/altamente variabili negli ammassi come "lista genica", e i geni di sfondo come sfondo per il confronto.
      NOTA: gli utenti R più avanzati possono utilizzare il cluster di pacchettiProfiler^{22 per automatizzare} l'analisi dell'arricchimento a termine Go.

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seq
In questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell'analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustrata nella figura 1A. L'analisi dei componenti principali (PCA) ha mostrato che i cheratinociti sottoposti a differenziazione avevano profili di espressione genica generali collegati ma distinti (Figura 1B). I geni altamente variabili sono stati raggruppati da kmeani per visualizzare la dinamica e i modelli di espressione genica durante la differenziazione (Figura 1C).

Ogni gruppo di geni era rappresentato dai geni distintivi della differenziazione dei cheratinociti (ad esempio, KRT5 per la proliferazione, KRT1 e KRT10 per la differenziazione precoce e media e IVL/LOR/FLG per la differenziazione tardiva). L'analisi dell'annotazione dell'ontologia genica (GO) dei cluster genici altamente variabili(Figura 1C)ha mostrato una chiara differenza nelle funzioni geniche di questi ammassi genici (ad esempio, cheratinizzazione negli stadi intermedi della differenziazione; e differenziazione delle cellule epidermiche, differenziazione dei cheratinociti e retizzazione peptidica nelle fasi finali; Figura 1D). L'espressione proteica di diversi marcatori di differenziazione è stata misurata mediante soffiatura occidentale (Figura 1E).

Differenziazione dei cheratinociti mutanti P63 e analisi RNA-seq:
Nel secondo esperimento, la morfologia cellulare e le differenze di espressione genica sono state confrontate tra cheratinociti da controlli sani e tre linee derivate da pazienti portatori di mutazioni p63 (mutanti R204W, R279H e R304W). La figura 2A mostra una panoramica delle procedure di differenziazione e dei cambiamenti della morfologia cellulare. I cheratinociti mutanti rimasero piatti sulla superficie del piatto e non divennero affollati o si sovrapponevano alla crescita come cheratinociti di controllo il giorno 7.

Nell'analisi PCA, le linee cellulari di controllo seguivano chiaramente un modello di differenziazione rispetto alla figura 1B. Tuttavia, il modello di espressione genica delle cellule mutanti durante la differenziazione rimane in gran parte simile a quello delle cellule prolifere/indifferenziate. Tra le tre linee mutanti, differenziando i campioni R279 spostati lungo PC1 e PC2 in una certa misura, indicando che la sua differenziazione era meno compromessa, rispetto a R204W e R304W.

Nell'analisi del clustering (Figura 2C), i geni downregolati nelle cellule di controllo (cluster 1) sono stati parzialmente deregolamentati in R204W e R279W, ma la loro espressione genica non è stata drasticamente cambiata in R304W. Questi geni probabilmente svolgono un ruolo nella proliferazione cellulare, come mostrato dall'annotazione GO (Figura 2D). Nel cluster 2 (Figura 2C), i geni sono stati prima indotti e successivamente deregolamentati nelle cellule di controllo. Questi geni sono probabilmente coinvolti nella differenziazione dei cheratinociti, poiché le funzioni di differenziazione epidermica e cheratinizzazione sono state altamente arricchite per questi geni a grappolo (Figura 2D). Questi geni non sono stati indotti in R204W e R304W, mentre nelle cellule R279H, questi geni sono stati indotti ma non deregolamentati tanto quanto le cellule di controllo.

I geni dell'ammasso 3 sono stati indotti solo alla fine della differenziazione nelle cellule di controllo (Figura 2D). Coerentemente con questo, questi geni possono avere un ruolo nello strato più esterno dell'epidermide, in quanto hanno dimostrato di essere reattivi agli stimoli esterni e all'infiammazione (Figura 2D). Lo schema di espressione di questi geni non cambiò molto in tutte e tre le linee cellulari mutanti. Le differenze visibili nei modelli di espressione genica tra cellule di controllo e cellule mutanti dimostrano che le cellule mutanti non possono differenziarsi correttamente in questi modelli di differenziazione in vitro.

Figura 1: Differenziazione e analisi dei cheratinociti. (A) Panoramica del protocollo di differenziazione dei cheratinociti e della morfologia cellulare. Barra di scala = 100 μm. (B) Analisi dei componenti principali dei cheratinociti di controllo differenzianti. (C) Heatmap dei primi 500 geni altamente variabili durante la differenziazione dei cheratinociti. I geni sono raggruppati in tre ammassi usando il clustering kmeano. I geni marcatori di differenziazione rappresentativi per ogni ammasso genico sono indicati di lato. (D) Analisi dell'arricchimento a termine GO delle funzioni sovrarappresentate per i geni negli ammassi genetici altamente variabili, rispetto a uno sfondo di tutti i geni espressi (conteggi di >10). GOrilla è stato utilizzato per la prova di arricchimento. (E) Macchia occidentale di marcatori di differenziazione dei cheratinociti durante la differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Confronto tra cheratinociti mutanti di controllo e p63. (A) Panoramica del protocollo di differenziazione dei cheratinociti e della morfologia cellulare del controllo e dei cheratinociti mutanti p63. Scala = 100 μm. (B) Analisi dei componenti principali dei cheratinociti di controllo differenziante e paziente (R204W, R279H e R304W). (C) Mappa termica dei geni differenziali tra controllo e cheratinociti mutanti. I geni sono raggruppati in tre ammassi usando il clustering kmeano. Sono indicati geni marcatori di differenziazione rappresentativi per ogni ammasso genico. (D) Analisi dell'arricchimento a termine GO delle funzioni sovrarappresentate per i geni negli ammassi genetici altamente variabili, rispetto a uno sfondo di tutti i geni espressi (conteggi di >10). GOrilla è stato utilizzato per la prova di arricchimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La tabella 1. Integratori medi KGM-pro.

La tabella 2. Integratori medi KGM-diff.

File di codifica supplementari: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; e Wig2bw.txt. Clicca qui per scaricare questo file.

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un'alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre la^{differenziazione 2,3,23}. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi^{metodi 3} e ha dimostrato che questi metodi possono rappresentare una biologia distinta della differenziazione dei cheratinociti. In questo stesso rapporto, gli autori hanno dimostrato che le cellule differenziate indotte dal siero hanno un alto potenziale proliferatorio ed esprimono geni come KRT16 e SKALP / PI3 che sono espressi nella pelle della psoriasi ma non nell'epidermide normale, e che quindi il modello di differenziazione indotto dal siero può essere utilizzato per studiare la psoriasi. Al contrario, il metodo di inibizione del contatto più l'esclusione del fattore di crescita può indurre KRT1 e KRT10, che sono normalmente espressi nell'epidermide e assomigliano alla normale differenziazione dei cheratinociti. L'elevata induzione di calcio dà origine a un profilo di espressione genica che è tra l'induzione del siero e l'inibizione del contatto, come metodo meno specifico. Le analisi che utilizzano analisi RNA-seq durante la differenziazione hanno confermato che il metodo di inibizione del contatto più l'esclusione del fattore di crescita si traduce in cheratinociti differenziati con profili di espressione genica simili a quelli previsti per la differenziazione epidermica (ad esempio, KRT5 nelle cellule proliferate, KRT1 e KRT10 nell'induzione di differenziazione precoce e LOR e FLG nella differenziazione tardiva; Figura 1C).

Questi risultati dimostrano che questa tecnica di differenziazione è un metodo facile da usare e affidabile per studiare la differenziazione dei cheratinociti. Inoltre, questo lavoro sui cheratinociti derivati da cheratinociti mutanti p63 mostra anche che il metodo può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti colpiti in condizioni di malattia. In questo approccio di differenziazione in vitro, viene utilizzato il KGM acquistato da Lonza, poiché questo mezzo produce risultati coerenti. In linea di principio, è probabile che sia adatto anche altri mezzi epidermici con composizione simile come il mezzo privo di siero cheratinocita (KSFM) di Thermo Fisher Scientific, anche se questo deve essere testato.

Va notato che questo metodo ha alcune limitazioni. Poiché si basa sull'inibizione del contatto, è necessaria la confluenza della densità cellulare. Nei nostri esperimenti con i cheratinociti mutanti p63, è stata necessaria una maggiore densità iniziale di semina per garantire che le cellule raggiungano la confluenza. Inoltre, quando le cellule non crescono con la stessa velocità, la differenziazione a volte deve essere indotta in giorni diversi. Queste considerazioni dovrebbero essere prese in considerazione al momento di impostare gli esperimenti. In contesti sperimentali in cui le cellule devono essere indotte contemporaneamente, dovrebbero essere presi in considerazione altri metodi di differenziazione, tra cui l'aggiunta di siero, alte concentrazioni di calcio e l'inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico^2,3. Tuttavia, tutti i metodi di differenziazione in vitro hanno pro e contro, in quanto probabilmente rappresentano segnali di induzione di differenziazione parziale presenti durante lo sviluppo cutaneo in vivo².

Un'analisi molecolare completa che confronti questi diversi metodi sarà altamente istruttiva e può istruire la scelta del metodo più adatto per diversi studi sui processi biologici. Inoltre, la convalida dei cambiamenti misurati a livello trascritomico è altamente consigliata, ad esempio, tramite analisi western blotting o proteomiche. Inoltre, i dati in vitro devono essere usati con cautela e le conclusioni di questi modelli dovrebbero essere convalidate in vivo, preferibilmente nello sviluppo della pelle umana.

I principi di base dell'estrazione dell'RNA e della preparazione della libreria RNA-seq sono stati ben^{descritti in precedenza 24,25,26,27,28}. In questo protocollo, le procedure di estrazione dell'RNA e di preparazione della libreria RNA-seq si basano su flussi di lavoro di kit disponibili in commercio. In linea di principio, diversi metodi per l'estrazione dell'RNA non dovrebbero avere una grande influenza sulle analisi RNA-seq se la qualità dell'RNA è buona. Nei casi in cui la qualità dell'RNA è scarsa (cioè, quando l'RNA viene estratto tessuti fissi alla paraffina formalina), l'RNA-seq può ancora essere eseguito; tuttavia, il passaggio di frammentazione dell'RNA dovrebbe essere regolato. La preparazione della libreria RNA-seq copre dalla rimozione dell'RNA ribosomiale (rRNA) alla costruzione della libreria cDNA per il sequenziamento. Le procedure principali possono essere eseguite utilizzando vari kit, o utilizzando singoli enzimi e tamponi fatti in casa^29,30,31,32. Va notato che, se l'analisi RNA-seq viene eseguita utilizzando diversi principi di base (ad esempio, l'esaurimento dell'RNA ribosomiale o l'arricchimento dell'mRNA poliA mediante ibridazione agli oligo poliT), il risultato delle analisi RNA-seq può differire. Inoltre, il protocollo utilizza la rimozione dell'RNA ribosomiale mediante ibridazione degli oligo di DNA all'rRNA umano, topo e ratto. Quando si lavora con specie diverse, è necessario impiegare un set di oligo alternativo.

Il sequenziamento della libreria generata può essere eseguito su entrambe le estremità dei frammenti (estremità accoppiata) o su un'estremità del frammento (estremità singola). In generale, il sequenziamento finale accoppiato migliora notevolmente la mappabilità e fornisce ulteriori informazioni sulle varianti di trascrizione. Tuttavia, per un'analisi genica differenziale relativamente semplice come descritto qui, il sequenziamento a estremità singola può anche fornire informazioni sufficienti.

Per la fase importante dell'analisi dei dati, viene descritto un metodo relativamente semplice per il controllo di qualità dei file fastq, seguito dalla mappatura delle letture sul genoma. Anche se il codice bash fornito non ha una scalabilità ideale, ha il vantaggio della trasparenza. La scelta del software, quali passaggi esegue, e la versione del genoma utilizzato durante la pre-elaborazione dei dati sono tutti passaggi non positivi che dovrebbero essere ben documentati, il che è essenziale per la ripetibilità.

Per gli utenti più avanzati, una pipeline automatizzata può essere utilizzata per eseguire i passaggi del controllo della qualità dei file fastQ, del taglio e della mappatura dell'adattatore, ad esempio il flusso di lavoro ARMOR snakemake³³ o il flusso di lavoro Snakemake "RNA-seq" del van Heeringen lab³⁴. Tuttavia, queste pipeline completamente automatizzate sono meno trasparenti e più difficili da cambiare. Quando si utilizzano questi strumenti, è fondamentale comprendere le funzioni all'interno di queste pipeline automatizzate. Infine, il protocollo include l'analisi dei dati RNA-seq con un'enfasi sull'espressione genica variabile nel tempo. L'espressione genica variabile è preferita rispetto ai test differenziali a coppie quando si guardano processi con più punti di tempo, come la differenziazione. In conclusione, questa pipeline di analisi introduce strumenti pertinenti per l'analisi bioinformatica dei dati RNAseq. Contiene strumenti in grado di valutare a fondo la differenziazione dei cheratinociti, sia in condizioni normali che masse.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Borsa di studio della Radboud University (H.Z.); e sovvenzione del Consiglio delle borse di studio cinesi 201406330059 (J.Q.).