Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

Здесь мы представляем протокол для измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, который позволил бы пользователю оценить индуцированные наркотиками возмущения сложной динамики eIF4F в форматах скрининга.

Было показано, что формирование комплекса eIF4F является ключевым нисходящим узелом для конвергенции сигнальных путей, которые часто подвергаются онкогенной активации у людей. eIF4F является комплексом, связывающим крышку, участвующим в этапе набора мРНА-рибосомы для начала перевода. Во многих клеточных и доклинических моделей рака дерегулирование eIF4F приводит к увеличению перевода конкретных подмножего мРНК, которые участвуют в распространении и выживании рака. eIF4F - это гетеро-тримерный комплекс, построенный из подразделительного подразделения eIF4E, вертолетного шкафа eIF4A и строительного подразделения eIF4G. Критически важным для сборки активных комплексов eIF4F является белково-белковое взаимодействие между белками eIF4E и eIF4G. В этой статье мы описываем протокол для измерения сборки eIF4F, который отслеживает состояние взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках. Анализ взаимодействия белково-белковой системы eIF4e:4G также позволяет точно и надежно оценивать вызванные препаратом изменения в комплексной целостности eIF4F. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для проверки деятельности коммерчески доступных соединений или для дальнейшего скрининга новых соединений или методов, которые эффективно нарушают образование комплекса eIF4F.

Контроль экспрессии генов играет ключевую роль в правильном исполнении клеточных программ, таких как пролиферацию роста и дифференциацию. Механизм регулятивного контроля может осуществляться либо на уровне транскрипции генов, либо на уровне перевода мРНК. В последнее десятилетие становится все более очевидным, что трансляционный контроль путем модуляции процесса инициации, а не более поздних шагов удлинение и прекращение может тонко регулировать синтез конкретных подмножего белков, которые играют широкий спектр биологических функций.

Увеличение перевода мРНК, участвующих в выживании, антиавтофагических и анти-апоптотических ответов были вовлечены в несколько видов рака, а также были причинно связаны либо с аномальной активации или за выражение факторов инициации^{перевода 1}.

Комплекс eIF4F является мастер-регулятором инициирования перевода. Связывая кап-структуру на 5' конце мРНК, eIF4F является движущей силой первоначального набора мРНА-рибосомы и, в свою очередь, повышает эффективность перевода мРНК слабо переведенных эукариотических^{мРНК 2}. eIF4F опосредованное перевод связанных с раком mRNAs было сообщено для многих моделей рака укрывательство аномальной активации RAS / MAPK или АКТ / ТОР пути, предполагая, что раковые клетки upregulate eIF4F для повышения их собственной про-неопластической активности. Нарушение этой кормовой петли путем ингибирования комплексного формирования eIF4F является, таким образом, очень перспективной терапевтической^{стратегией 3,4.}

Комплекс eIF4F состоит из (i) eIF4E, кап-связывающего подразделения eIF4F, которое взаимодействует со структурой крышки, найденной в 5' UTR mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase и (iii) eIF4G, белок эшафота, который взаимодействует как с eIF4A, так и с eIF4E и который в конечном итоге набирает 40S рибосомный^{субъедин.} eIF4G ассоциация с eIF4E является ограничивающим скорость шагом для сборки функциональных комплексов eIF4F и негативно регулируется связывающими белками eIF4E (4EBPs, члены 1, 2 и 3))⁶. Конкурируя с eIF4G, связывающим eIF4E через интерфейс, который состоит из канонических и неканонических eIF4E^{связывающих последовательностей 7,8,9} (регион, охватывающий aa 604-646 на человеческом eIF4E), 4EBP уменьшает пул eIF4E, активно участвующих в переводе и предотвращении комплексного формирования eIF4F. Взаимодействие этих белково-белковых взаимодействий в основном регулируется целью млекопитающих рапамицина (mTOR)-опосредованного фосфорилирования 4EBP. При митогенных стимулах mTOR непосредственно фосфорилатирует членов семьи белков 4E-BP, уменьшая их связь с eIF4E и тем самым способствуя взаимодействию eIF4E-eIF4G и формированию функциональных комплексов eIF4F^10.

Несмотря на большие усилия по разработке соединений, ориентированных на сложную целостность eIF4F, отсутствие анализов, измеряя прямое нарушение взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, ограничило поиск клеточных активных пораженных соединений. Мы применили анализ люциферазы на основе аналога коэнтеразина (например, анализ дополнений на основе Nanoluc) для мониторинга в режиме реального времени состояния целостности eIF4F через взаимодействие eIF4E-eIF4G. Белковая система дополнения люциферазы состоит из фрагмента белка 18 кДа (SubA) и 11 аминокислот пептидного фрагмента (SubB), оптимизированного для минимальной самоа ассоциации^{и стабильности 11}. После того, как выражается как продукт синтеза с человеческой полной длины eIF4E и eIF4E взаимодействия домена от человека eiF4G1 (аа 604-646), два взаимодействующих белков принесет SubA и SubB фрагмент в непосредственной близости друг от друга и будет вызывать образование активной люциферазы, что, в присутствии ячейки проницаемый субстрат, в конечном итоге генерировать яркий люминесцентный сигнал (Рисунок 1). Мы сообщали в других местах о строительстве и проверке системы дополнения eIF4E:eIF4G^{604-646 16}.

Здесь мы описываем, как система дополнения eIF4E:eIF4G^604-646 (доступна по запросу) может быть применена для точного измерения нарушения работы 4EBP1 при посредничестве eIF4E-eIF4G в живых клетках. Кроме того, мы демонстрируем его полезность, измеряя эффекты нескольких ингибиторов mTOR, которые в настоящее время находятся под клиническими испытаниями в качестве потенциальных терапевтических^{препаратов рака 12}. Поскольку внецелеспособные эффекты часто маскируют деятельность, связанную с наркотиками, мы также описываем, как универсальность измерения системы eIF4E:eIF4G^{604-646 может} быть расширена с помощью ортогональных измерений клеточной жизнеспособности с учетом этих данных.

Линия клеток HEK293 была использована для протокола и была откощена в модифицированной иглой Dulbecco, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамином и 100 U/mL пенициллином/стрептомицином. Клетки были выущены при 37 градусах Цельсия с 5% CO₂ во влажной среде.

1. Количественная оценка комплексного сбоя eIF4F с помощью анализа дополнений eIF4E:eIF4G^604-646

1. Культура клеток и преходящая трансфекция анализа дополнений eIF4E:eIF4G^604-646
   1. Используйте свежеоттая клетки с менее чем 20 проходами для всех экспериментов. На 1 день определите номер ячейки с помощью стандартного счетчика ячеек и подсчитайте общие жизнеспособные ячейки с помощью метода исключения trypan blue^13.
   2. Семена 6-хорошо пластин с 0,9 - 1,2 х 10⁶ HEK 293 клеток на колодец в 2 мл стандартной среды роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшей эффективности трансфекции в клеточных линиях, указанных выше, убедитесь, что поцароченные клетки 70-90% стечения на следующий день после посева.
   3. Утром 2-го дня, совместно трансфектные клетки с SubA-eIF4E и eIF4G^604-646-SubB плазмид с использованием липидной трансфекции реагент (см. Таблицу материалов), как описано ниже.
      1. Разбавить 9 МКЛ раствора на основе липосомы в трубке, содержащей 125 МКЛ пониженной среды сыворотки без фенола красного цвета (см. Таблицу материалов)для каждой трансфекции и инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Подготовка мастер смесь ДНК путем разбавления 3 мкг каждой плазмиды в 125 МКЛ уменьшенной среде сыворотки для каждой трансфекции трубки.
      3. Добавьте 12 йл реагентов усилителя в трубку смеси мастера ДНК, хорошо перемешайте и немедленно добавьте ДНК: усилитель мастер-микс к каждой трубке разбавленных липосом в соотношении 1:1. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
      4. Добавьте к каждому хорошо ДНК-липидный комплекс и инкубировать клетки в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂ в течение 24 ч.
   4. Утром 3 дня, промыть каждый колодец с 1 мл PBS.
   5. Удалите PBS и инкубировать клетки в каждом хорошо с 0,3 мл трипсина в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию.
   6. Нейтрализовать трипсин, добавив 2 мл уменьшенной среды сыворотки без фенола красного, содержащего 0% FCS в каждой хорошо и передачи трансфицированных клеток в 15 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный может вмешиваться в активность люциферазы; таким образом, клетки должны быть обработаны с этого шага вперед в среде без фенола красного цвета.
   7. Спин вниз клетки в течение 5 мин на 290 х г и аспирировать среды. Resuspend клетки в 2 мл уменьшенной среды сыворотки без фенола красный, содержащий 0% FCS. Подсчитайте, как описано в шаге 1.1.
   8. Семена трансфицированных HEK 293 клеток в 96 хорошо непрозрачных пластин при плотности 30000 клеток на колодец в 90 йл среды без фенола красный, содержащий 0% FCS. Для того, чтобы получить 3 технических репликаций в рамках одного и того же эксперимента для 3 различных соединений, семена 60 скважин пластин с клетками, исключая скважины по краям.
   9. Сразу же после посева трансфицированных клеток добавьте 10 МКЛ из 10% раствора соединения DMSO (см. шаг 1.2).
2. Соединение подготовки
   1. Подготовка 1 мМ комплекс фондовых решений путем растворения соединения интереса в 100% DMSO (v/v). Для того, чтобы иметь 3 репликации для каждого соединения titration, используйте 8 йл из 1 мМ комплекс запасов раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 1 мМ фондового соединения используется больше, чем это необходимо. Это делается с учетом ошибок трубопроводов, если таковые имеются.
   2. Выполните 2-кратное серийное разбавление раствора соединения запасов с 4 йл запаса 1 мм в 4 МКЛ 100% DMSO для каждой точки титрования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного соединения titration, выполнить 9 серийных разбавления из стартового запаса в 100% DMSO. Если несколько соединений должны быть проверены, используйте 96 пластины и многоканальный пипетку для облегчения этого шага и последующих разбавлений.
   3. Добавьте 36 л стерильной воды класса HPLC для каждой точки 2-кратного серийного разбавления, чтобы подготовить 40 л 10-кратного рабочего решения в 10% DMSO (v/v) (т.е. От 100 МКМ до 0,39 МКМ 10% DMSO фондовой серии приведет к окончательному решению от 10 МКМ до 0,039 МКМ, в 1% DMSO при добавлении к ячейкам). Что касается контроля очистки, также подготовить 10% DMSO только фондовый раствор в HPLC класса стерильной воды.
   4. Добавьте 10 МКЛ 10-х рабочих растворов к клеткам в 96 хорошо непрозрачной пластине для того, чтобы дать предназначенную окончательную концентрацию с остаточной концентрацией DMSO 1% (v/v) в общем объеме 100 МКЛ и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% v/v атмосферной CO₂.
3. Luciferase дополнения и жизнеспособности анализа
   1. После 3 ч употребления наркотиков начните готовить субагент люциферазы, объединив 1 том субстрата с 19 томами разбавляемого реагента (см. инструкции производителя).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ люциферазы выполняется с использованием коммерчески доступного комплекта (см. таблицу материалов).
   2. Используйте многоканальный пипетку, чтобы немедленно добавить 25 МКЛ субстрат-реагента.
   3. Встряхните пластину при 350 об/мин в течение 50 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
   4. Оцените люминесценцию с помощью считыватель пластин. Для этого установите зеркальный считыватель на люминесценцию и фильтр выбросов на 455. Используйте измеримую высоту 6,5 мм со временем измерения 1 с.
   5. Для того, чтобы ослов жизнеспособности клеток, добавить 33 йл жизнеспособности анализа реагента, а затем повторно измерить люминесценцию снова после 15 мин при комнатной температуре, используя пластины читателя.
   6. Оцените люминесценцию с помощью считыватель пластин, установив зеркальный считыватель на люминесценции и фильтр выбросов на 600 нм. Используйте измеримую высоту 6,5 мм со временем измерения 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность оценивается путем измерения внутриклеточного уровня АТФ при лизе клеток в соответствии с инструкциями производителя. Мультиплексирование возможно в этом случае, так как жизнеспособность анализа использует различные люциферазы с другой длины волны излучения.
   7. Используйте данные для определения значений IC50 каждого соединения по кривой, подходящей для данных в уравнение кривой 4 параметра:
      Y (A-D)/(1"(x/C))
      Числовые значения D и A должны быть ограничены в процессе установки кривой:
      D - люминесцентное значение на оси Y для минимального асимптота кривой или минимального теоретического уровня реакции, ожидаемого от анализа дополнения eIF4E:4G.
      - люминесцентное значение на оси Y для максимального асимптота кривой или ответа максимального теоретического уровня, ожидаемого от анализа дополнения eIF4E:4G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение для минимального ответа вытекает из 1% DMSO (v/v) контрольной обработки и значение для максимального ответа происходит от максимальной реакции ингибитора mTOR высокой сродства, который плато без какого-либо влияния на жизнеспособность клеток.

2. Корреляция eIF4E:eIF4G^604-646 ингибирование анализа с комплексным нарушением eIF4F в клетках

1. Чтобы подтвердить, что сигнал, измеряемый анализом, соответствует физическому нарушению взаимодействия eIF4E-eIF4G соединением, семенные клетки, описанные в шаге 1.1.
2. На следующий день заменить средний с 1 мл уменьшенной среде сыворотки, не содержащей фенол красный и инкубировать в течение 4 ч с соединением интереса. Обеспечить остаточную концентрацию DMSO 1% (v/v) в общем объеме 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы легко позволить корреляцию с результатом, использовать соединения концентраций в начале, средней точке и конечной точке измеренной кривой титрации анализа дополнения.
3. Lyse клетки и^{выполняется м 7}GTP тянуть вниз, чтобы изолировать eIF4F и eIF4E:4EBP1 комплексов. Подробные процедуры о том, как выполнить m⁷GTP стащить эксперимент можно найти в другом^{месте 14}.
4. Обнаружить^{м 7}GTP связанных eIF4G, eIF4E и 4EBP1 белковых уровней по западному анализу пятно, а затем коррелируют с eIF4F сложных нарушений с ингибированием анализа добавок сигнала.

Для проверки чувствительности системы дополнения eIF4E:eIF4G^604-646 при посредничестве 4EBP1 было оценено ингибирование комплексной сборки eIF4F с помощью ингибиторов mTOR. Путем ингибирования mTORC1 киназы зависимого фосфорилирования 4EBP белка семьи, mTOR ингибирование повышает 4EBP1 ассоциации с eIF4E и, следовательно, eIF4F разборки¹⁵. Были протестированы два класса механистически разных ингибиторов мТОР киназы: рапалогов (например, рапамицин), которые являются алостерическими ингибиторами mTORC1, но не mTORC2 и АТФ конкурентоспособных ингибиторов (например, PP242), которые предназначены для конкретного ингибирования как mTORC1, так и mTORC2 киназы каталитической активности.

Клетки HEK293 были трансфицированы с помощью системы дополнения eIF4E:eIF4G^604-646, описанной в шаге 1. После 24 ч трансфекции клетки были повторно посеяны и обработаны ингибиторами mTOR PP242 и рапамицином (как описано в шаге 1.2). Через четыре часа после лечения, люминесценция была оценена, как описано ранее, с последующим жизнеспособности клеток. Как показано на рисунке 2, PP242 производит дозозависимых ингибирование сигнала с расчетным IC50 из 0,72 ± 0,04 МКМ, в то время как IC50 из 6,88 ± 0,88 МКМ является производным для рапамицина (Рисунок 2A). Плиты были затем мультиплексы для клеточной жизнеспособности анализа (Рисунок 2D). Этот анализ показывает, что ни PP242, ни рапамицин не производят значительного снижения жизнеспособности клеток, доказывая, что снижение люминесценции в eIF4E:eIF4G^{604-646 системы} дополнения не из-за неспецифической гибели клеток, а скорее через нарушение взаимодействия eIF4E:4G.

Эксперимент m⁷GTP, выполненный инкубацией нетрансфицированных клеток с составными концентрациями, которые соответствуют началу, середине и конечной точкам измеренной кривой титрования на рисунке 2А, показывает, что 4EBP1-опосредованное нарушение эндогенного сигнала eIF4E-eIF4G коррелирует с измеренным eIF4E:eIF4G^604-646 сигналом анализа(рисунок 2B, 2C). В соответствии с этими результатами, PP242 показан как более мощный ингибитор общего фосфорилирования 4EBP1, чем рапамицин в экспериментальных условиях, протестированных в клетках HEK 293(рисунок3A ), в то время как оба ингибитора показали влияние на mTOR сигнализации нормально, с рапамицин более активным против mTORC1 субстратов и PP242 ориентации как mTORC1 и mTORC2 (Рисунок 3B).

В совокупности эти результаты показали, что PP242 более эффективен в нарушении комплексного образования eIF4F, чем рапамицин в клетках HEK293, и еще раз показывают, что система eIF4E:eIF4G^604-646 может точно измерять комплексную сборку eIF4F в живых клетках.

Рисунок 1: система дополнения eIF4E:eIF4G^604-646. Схематическое представление, показывающее, как взаимодействие белка X (eIF4E) и белка Y (eIF4G^604-646)позволяет слияниям SubA и SubB войти в близость друг с другом и воссоздать активную люциферазу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: 4EBP1-опосредованное разрушение комплекса eIF4F. (A) PP242 и рапамицин eIF4E:eIF4G^604-646 анализа титрован моделирования взаимодействия между eIF4E и eIF4G в трансфицированных heK 293 клеток. (B,C) Западный анализ помарки, показывающий эндогенный уровень eIF4E, eIF4G и 4EBP1 в экстрактах HEK 293 и в m7GTP, спускается после инкубации культивированных клеток с различной концентрацией PP242 или Рапамицина соответственно. (D)Обработанные клетки в A, где мультиплекс для жизнеспособности клеток и люминесценции оценивается. Все значения представляют среднее ± SD (n'3). Эта цифра была изменена с¹⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Дифференциальный эффект ингибирования mTOR на 4EBP1 фошориляцию. (A) Западный анализ помарки состояния фосфорилирования 4EBP1 в не-трансфицированных клетках HEK293 обработанных с указанной концентрацией PP242 и рапамицина. (B) Западный анализ помарки AKT и S6 фосфорилирования статус в не-трансфицированных HEK293 клеток, обработанных либо двойной MTORC1/2 активных ингибиторов сайта PP242, или алостерический ингибитор mTORC1 Рапамицин. Бета актин был визуализирован для управления загрузкой, а также всего 4EBP1, AKT и S6. Эта цифра была изменена с¹⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Метод, описанный в этой статье, использует анализ дополнения на основе люциферазы для количественного мониторинга комплексной сборки eIF4F путем прямого измерения взаимодействия eIF4G-eIF4E в живых клетках. Мы предоставили подробную информацию для использования системы дополнения eIF4E-eIF4G, и мы также показали, что система является чрезвычайно точной в измерении наркотиков индуцированной 4EBP1-опосредованной диссоциации взаимодействия eIF4E-eIF4G¹⁶. Для того, чтобы облегчить пропускную способность этого анализа, экспериментальная установка, описанная в этой статье, была разработана для использования формата микроплатформы 96.

Для достижения оптимальных результатов следует учитывать два критических шага при выполнении анализа. Во-первых, эффективность трансфекции между экспериментами должна оставаться аналогичной. Это может быть обеспечено за счет использования клеток с низким числом проходов, а также путем строгого подсчета клеток в день посева. Слияние клеток также должно быть оценено до трансфекции ДНК, так как не рекомендуется трансфектировать клетки липидным трансфектным реагентом, если слияние клеток составляет менее 70-90%. Во-вторых, важно мультиплекс дополнения анализа с клеточной жизнеспособности анализа. Некоторые соединения могут влиять на сигнал люциферазы в первую очередь за счет уменьшения числа жизнеспособных клеток через пагубные эффекты. Поэтому важно измерять жизнеспособность ячейки сразу же после анализа дополнения eIF4E:eIF4G^604-646 для устранения нецелеспособных и неспецифических эффектов.

Белково-белковые интерфейсы, такие как интерфейсы между eIF4E и eIF4G, которые лишены гидрофобных расщелин и являются относительно большими и планарными, как правило, считаются "не-наркотическими" обычными малыми молекулами терапии (Lt;500 MW)¹⁷. Таким образом, растет интерес к разработке новых условий, которые эффективно взаимодействуют с этим типом поверхностей (например, макроциклические и пептидомиметические соединения). Тем не менее, многие из этих новых условий врожденно не в состоянии пересечь клеточную мембрану и заниматься своей цели. Чтобы обойти эти проблемы, многие исследовательские группы проводят исследования в новых химических оптимизации и сотовых стратегий доставки. Мы предполагаем, что анализ живой ячейки eIF4E:eIF4G^604-646 и другие аналогичные анализы ИЦП будут играть ключевую роль в укреплении этих стратегий и их проверке.

Авторов нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана основным бюджетом от p53lab (BMSI, АЗХАРД) и ГРАНТА JCO VIP (АЗСТА).