Method Article
Мы описываем метод для генерации и усиления генетически модифицированные синцитиальный респираторных вирусов (RSVs) и оптимизированной налета assay RSVs. Проиллюстрируем этот Протокол путем создания двух рекомбинантных вирусов, которые соответственно дать количественную оценку данной RSV репликации и жить анализ RSV включения органов и органов включение связанных гранулы динамики.
Применение рекомбинантного вирусов приобрел решающее значение в основных или прикладной вирусологии. Было доказано обратного генетика быть чрезвычайно мощная технология, как расшифровать механизмы вирусной репликации и для изучения противовирусные препараты или предоставить платформу для разработки вакцин для. Строительство и манипуляции обратный генетической системы для отрицательные strand РНК вируса таких респираторно-синцитиальный вирус (RSV), однако, остается нестабильным и требует специального ноу-хау. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который служит в качестве шаблона для вирусной РНК репликации и транскрипции. Наша система обратной генетики использует cDNA копию генома человека RSV длинные штамм (HRSV). Этот cDNA, а также cDNAs кодирования вирусные белки комплекс полимеразы (L, P, N и м2-1), помещаются в отдельные выражения векторов под T7 полимеразы управляющие последовательности. Трансфекция этих элементов в ЧКР-T7/5 клеток, которые стабильно Экспресс T7 полимеразы, позволяет цитоплазматических репликации и транскрипции рекомбинантных RSV, рождая генетически модифицированных вирионов. Новый RSV, которая присутствует на поверхности клеток и в надосадке культуры BSRT7/5, собирается для того, чтобы заразить клетки человека HEp-2 для амплификации вирусной. Два или три круга усиления необходимы для получения вирусных запасов, содержащих 1 x 10-6 до 1 x 107 металлическ формируя единиц (ОРП) / мл. Здесь подробно описаны методы для оптимального сбора урожая, замораживания и титрование вирусных запасов. Мы иллюстрируем протокола, представленные здесь, создав две рекомбинантных вирусов, соответственно выражая бесплатно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) (RSV-GFP) или вирусный м2-1 сливается с GFP (RSV-м2-1-ГФП). Мы покажем, как использовать RSV-GFP квантифицировать RSV репликации и RSV-м2-1-GFP визуализировать вирусный структур, а также динамика вирусных белков в живой клетке, с использованием методов видео микроскопии.
RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире1. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых2взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.
RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,5. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5' конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5'. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор6. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики8,9,11, 12. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков13,14,,1516, 17. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы12. Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.
Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году18. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки19 имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году20. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.
Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.
1. Подготовка
2. спасение и первый проход рекомбинантных вируса
Примечание: Выполните все следующие действия в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.
3. усиление спасли вирусов
Примечание: Следующий протокол описывает амплификации спасли вирусов в колбе2 75 см. Адаптировать колбу размер тома необходимо и необходимые кратность инфекции (МВД). Таблица 1 показывает томов для различных колбы. Выполните все следующие действия в стерильных условиях в класс безопасности II кабинета.
4. доска титрования Assay
5. Использование HRSV-GFP рекомбинантных вируса для мониторинга репликации вируса в клетках, обработанных с малые интерферирующие РНК или противовирусные препараты
Примечание: Выполните все действия за исключением 5.1 и 5.2.5 в стерильных условиях с помощью класса II безопасности кабинета.
6. характеристика м2-1 локализации в Vivo с RSV-м2-1-GFP рекомбинантных вирус
Примечание: Выполните действия 6.1 и 6.2 в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.
В этой работе мы описали подробный протокол производить рекомбинантные RSV вирусов, выражая флуоресцентный белок (рис. 2). В pRSV-GFP гена GFP была введена между P и M генов, как описано для вишни гена в ранее опубликованной работе21. В pRSV м2-1-GFP м2 ген был слева нетронутая и между SH и G гены12дополнительных гена кодирования для M2-1-GFP был вставлен. Первый шаг, соответствующий спасательных вируса в клетках BSRT7/5, показано на рисунке 2А. Небольших кластеров Зеленый флуоресцентный клеток были видны 72 h posttransfection в скважинах, соответствующий RSV-GFP и RSV-м2-1-GFP спасения. Флуоресцентного сигнала можно наблюдать в цитоплазмы и ядра в RSV-GFP-инфицированных клеток, соответствующее выражение бесплатно GFP. Напротив в RSV-м2-1-GFP спасения, флуоресцентный цитоплазматических точек можно наблюдать, соответствующее накопление м2-1-ГФП в IBs. Обычно на этом этапе наблюдается не CPE (syncytia, отдельные клетки). Наоборот, во время второй шаг, соответствующий вирус амплификации (первый проход) на Нер-2 клетки, CPE был виден в инфицированных клетках на 72 h п.и. (рис. 2B). На рисунке 3A B показывает сильный CPE инфекции RSV, характеризуется большой syncytia, отсоединена или нет и многие плавучие клетки. Syncytia и клетки выставлены ярко зеленой флуоресценцией. На рисунке 3A показывает эволюцию цитопатического эффекта между 24 и 72 h p.i. в клетках, инфицированных вирусом RSV-м2-1-GFP. Несколько разбросанных флуоресцентные клетки были видны на 24 h п.и. без обнаружению CPE. Малые syncytia (кластер люминесцентные клеток) и несколько отдельных клеток/syncytia начали появляться на 48 h п.и. большой флуоресцентный syncytia и плавающие клетки были ясно видны на 72 h п.и.
Фотографии assay металлической пластинкы титрования и вирусных титры, соответствующий процесс производства RSV показаны на рисунке 5. Выполнение assay металлической пластинкы на отрицательный контроль, transfected с только выражение плазмид N, P, L и м2-1, показали не налета на низкие разрежения. Титры, полученные из transfected клеток были как ожидается, будет выше 100 ОРП/мл, если спасение было эффективным, как показано на рисунке 5. Затем титры возросла проходов, чтобы достичь 106– 107 ОРП/мл в 1 или 2. Обратите внимание, что вирусный титры были похожи между двумя рекомбинантных вирусов.
Клетки были transfected с siRNA, ориентация мРНК вирусного белка (N) или двух клеточных белков (инозин-5'-монофосфат дегидрогеназа [IMPDH] и 3'-фосфат-дегидрогеназы Глицеральдегид [GAPDH]). Клетки были также transfected с nontargeting siRNA. Рисунок 6 показывает, мониторинг RSV умножения с помощью RSV-GFP вирус на малых интерферирующих РНК лечение клетки. Сильный сигнал GFP было отмечено (рис. 6A) и измеренных (Рисунок 6B) на клетки управления transfected с nontargeting siRNA или transfected клеток с siRNA против мРНК GAPDH. В отличие от этого было уменьшено экспрессия гена GFP в инфицированных клетках, выражая siRNA, N или IMPDH. Обратите внимание, что мы проверили, что GFP флуоресцентного сигнала в RSV-GFP-инфицированных клеток на 48h п.и. коррелировалось с вирусной доза ранее свидетельством для аналогичных рекомбинантных RSV, выражая Черри (RSV-вишня)21. Чтобы оценить эффективность препарата на RSV умножения, HEp-2 клетки были инфицированы RSV-GFP за 48 ч при наличии различных концентраций препарата. Мы наблюдали сильное снижение GFP сигнала, который достиг фонового шума (было отмечено на неинфицированных клеток сигнал), при наличии концентрации наркотиков, как показано на рисунке 7. Наблюдаемые IC50 для AZD4316 было около 4 Нм, похож на опубликованные ЭК50 около 2 – 40 Нм против разных штаммов HRSV23. Анализ динамики IBs и IBAGs в живых клетках, благодаря RSV-м2-1-GFP, показано в рисунке 8 и Рисунок 9 (и 1 кино и кино 2). IBs появляются как мобильные сферических структуры способны предохранитель, формируя крупных сферических включение. IBAGs очень динамичный. Они проходят непрерывной сборки разборки циклов с образованием небольших IBAGs, которые растут, предохранитель в крупных IBAGs, а затем исчезают.
Плиты или фляги | HEp-2 клетки, чтобы быть посеяны в день до | Средний объем (мл) | Вирус посевным материалом объем (мл) |
флакон2 150 см | 15 x 10-6 | 30 | 5 |
флакон2 75 см | 7.5 x 106 | 15 | 3 |
флакон2 25 см | 2,5 х 106 | 5 | 1 |
6-ну пластина | 1 x 10-6 | 2 | 0.5 |
Таблица 1: Количество клеток и объем посевным материалом для использования в различных контейнерах.
Рисунок 1: Схематическое представление шагов спасения и амплификации. Трансфекция вектора выражения N, P, L, м2-1 и RSV антигеномного РНК в клетки (спасения) BSRT5/7. Выражение антигеномного RSV РНК и мРНК N, P, L и м2-1, T7 РНК-полимеразы. М2-1, L, N и P белки реплицировать и транскрибировать геномной РНК, инициализировала вирусный умножения. Новые вирусные частицы производятся и размножаться, давая рост P0. Затем вирус, добываемых из спасения (P0) усиливаются на Нер-2 клетки производить высокий титр вирусных подвеска (P1) (усиления). Затем это усиливается получить вирусный запасов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: CPE и шаблон флуоресценции, наблюдаемых в течение спасение RSV-GFP и RSV-м2-1-GFP. (A) BSRT5/7 клетки были transfected с обратной генетики векторов как указано, и фазово контрастной и флуоресценции изображения были взяты в 72 ч posttransfection. Отрицательный контроль (Neg Ctrl) соответствует клетки transfected с векторы выражения м2-1, L, N и P без обратного генетического вектора. (B) HEp-2 клетки были инфицированы вирусом, добываемых из transfected клеток BSRT5/7 (нулевой проход, 72 h posttransfection) и изображения были приняты 72 h postinfection. Изображения показаны являются представительной полей; Шкалы бар = 100 мкм. Области в штучной упаковке прилагается клетки показано увеличение; Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эволюция CPE и флуоресценции наблюдается во время усиления рекомбинантных RSV. HEp-2 клетки были инфицированы в MOI 0,01/клеток ОРП за 72 ч с первый проход (A) RSV-м2-1-GFP или (B) RSV-GFP. Фазово контрастной и флуоресценции изображения были взяты на 24 ч, 48 h и 72 ч postinfection. Изображения показаны являются представительной поля; Шкалы бар = 100 мкм. Области в штучной упаковке прилагается клетки показано увеличение; Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: определение титра RSV, используя assay металлической пластинкы. (A) результаты титрования assay металлической пластинкы в пластине 12-хорошо. Показаны шесть скважин заражены серийных разведений одной вирусные акции. Разбавления указаны в базы-10 логарифм. Клетки, инфицированные с трех первых разведений все отсоединены. Номера налета был замечен с 10-4, 10-5, и 10-6 разведений согласуются. (B) Иллюстрация налета перечисления (желтые номера). Зеленая звезда показывает царапины на слоя клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: титрование спасенных и усиленные вируса. Доска фенотипов RSV-GFP и RSV-м2-1-ГФП в различных отрывков assayed на Нер-2 клетки в 12-ну пластине (изображения показывают полностью скважин). Титры последующие ходы показаны в таблице. Репрезентативных данных отображаются. Разведений вирусный запасов указаны в базы-10 логарифм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: ингибирование RSV-GFP выражение siRNA, RSV N или IMPDH. A549 клетки обрабатывали управления nontargeting малых интерферирующих РНК (NT) (светло синяя полоса) или siRNA ориентации GAPDH (синяя полоса), RSV N (оранжевый бар) или IMPDH2 (зеленый бар) в течение 48 часов и затем инфицированных RSV-ГФП в MOI 0,05 ОРП/ячейки. Зеленая Флуоресценция было зачитано на 48 ч postinfection. (A) представитель изображения RSV-GFP-инфицированных клеток на 48 ч п.и., лечение с малых интерферирующих РНК, как видно на фотографии. Шкалы бар = 100 µm. (B) данные являются среднее ± SD двух независимых эксперименты, проведенные в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: ингибирование RSV-GFP умножение составных AZD4136. HEp-2 клетки в 96-луночных пластины были инфицированы RSV-ГФП в MOI 0,05 ОРП/ячейки присутствии серийных разведений AZD4316 составные или управления ДМСО. Зеленая Флуоресценция было зачитано на 48 h п.и., данные являются среднее ± SD двух независимых эксперименты, проведенные в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: анализ динамики IBs, отслеживая флуоресцентный белок м2-1-ГФП в HEp-2-инфицированных клеток по микроскопии промежуток времени. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 минут для 5 h с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. IBs флуоресцентные (зеленый), потому что они принимающей м2-1-GFP и ядер запятнаны с Hoechst (синий). Белые стрелки указывают проходят слияние IBs. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: анализ динамики IBAGs в RSV-м2-1-GFP-инфицированных клеток по микроскопии промежуток время. В 18 ч п.и. клетки были образы с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. М2-1-GFP белка был визуализирован на зеленой флуоресценцией. Белые стрелки указывают IBs, проходят слияние IBAGs. Шкалы бар = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: In vivo анализ динамики IBs в RSV-м2-1-ГФП в клетках, инфицированных HEp-2. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 минут для 5 h с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. Шкалы бар = 10 мкм. Результате фильм показывает 7 кадров в секунду (fps). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: In vivo анализ динамики IBAGs в RSV-м2-1-GFP-инфицированных клеток. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 мин за 3 ч. и 40 мин с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. Шкалы бар = 2 мкм. Результате фильм показывает 4 fps. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Здесь мы представляем метод спасения рекомбинантного RSVs из пяти плазмид и их усиление. Возможность манипулировать геном вируса революционизировало вирусологии исследования для тестирования мутации и выразить дополнительных гена или тегами вирусного белка. RSV мы описал и используется в качестве примера в этой статье является вирус, выражая Репортер ген, RSV-GFP (Неизданное) и выражает м2-1 белок сплавили GFP тег12. RSV спасение является сложной задачей и требует практики. Эффективность трансфекции имеет решающее значение, в зависимости от мудрый выбор реагента transfection и предварительной оптимизации трансфекции протокола. Использование клеток, выражая бактериофага Т7 pol является обязательным, потому что вирусный cDNA находится ниже по течению T7 Поль промоутер в большинстве обратного генетического вектора. Альтернативой является выразить T7 ГСМ от vaccinia вируса помощник. Однако использование клеток, стабильно выражая T7 Поль отпадает необходимость разделения двух вирусов и предотвращает возможные помехи спасения коровью. Это имеет важное значение для выполнения первого прохода обратного генетического (P0 до P1) без замораживания посевным материалом для обеспечения максимальной спасения эффективности. Это означает, что МВД не контролируется. Однако на этом шаге, титры остаются очень низкая, что приводит к низкой МВД для первого прохода. Чтобы получить RSV запасов с высокой инфекционной титры (106– 107 ОРП/мл), важно дождаться сильного CPE и соскрести клетки для сбора вирусных частиц, прилагается к клеткам. В этом исследовании титры не увеличивается после 96 h п.и. Быстрое охлаждение вирусный подвеска важно поддерживать высокие титры. Вместо этого из путем погружения в спирте, охладить при температуре-80 ° C, это может также быть достигнуто путем погружения в смесь сухого льда/этанол или в жидком азоте. Помимо сохранения решения обеспечит больше стабильности вирус подвески в-80 ° C. Хранения при температуре-80 ° C является критическим, поскольку вирус будет быстро потери его инфективности при хранении при температуре-20 ° C, или в жидком азоте. Мы описали RSV усиления на Нер-2 клетки, который является наиболее популярной линии клетки расти RSV, но это также возможность расти эффективно на многочисленных других клеточных линий в пробирке. Однако, обратите внимание, что рост клеток Vero может привести к изменению в G выражение24.
Мы описали очень простой протокол налета титрования RSV, используя наложение микрокристаллическая целлюлоза. Что касается всех анализов титрования чувствительны к загрязнению с высокий титр суспензий, требующих тщательного манипуляции. Обычных анализов титрования RSV использовать агарозы или карбоксиметил целлюлозы (CMC) накладки и требуют иммуноокрашивания и микроскопические наблюдения для определения титра. Протокол, с помощью класса агарозы иммунодиффузии было описано включение прямой визуализации бляшки без иммуноокрашивания25. Однако, Нер-2 клетки очень чувствительны к подогреваемый агар оверлея, что делает этот протокол трудно использовать для нескольких вирус титрования (например, наложение слишком жарко разрушает слоя клеток); с другой стороны когда это не достаточно горячей, он твердеет после первого распространения пластины. Использование микрокристаллической целлюлозы для assay металлической пластинкы впервые описана, Матросович et al. для пробирного титрования вирус гриппа A26. Благодаря своей низкой вязкости оверлея микрокристаллическая легко отказаться и удалить из тарелка скважин, что делает его совместимым с 96-луночных пластинами. Это, таким образом, особенно пригодных для серологических исследований и анализа чувствительности наркотиков. Обратите внимание, что поскольку микрокристаллическая целлюлоза не нужно быть нагрета, препараты могут быть легко включены в оверлее. Важно, однако, что пластины остаются по-прежнему прекрасно во время инкубации; в противном случае большие кометы образный очагов сформирует вместо круглых металлических пластинк. Налета откровение, используя фиолетовый кристалл является дешевым и простым, но это решение является токсичным и должен быть надлежащим образом удаляться. Рециркуляции решения ограничивает отходов производства. Кроме того этот метод чувствителен к повреждения монослоя клеток, которая будет выглядеть как ложные белые пятна, которые не являются вирусные бляшек. Один из примеров показан на рисунке 4 (Зеленая звезда). Для предотвращения этого предубеждения, 1) клетки должны быть обработаны с осторожностью, чтобы избежать царапин или промывка монослое клеток, 2) стремление и дозирования всегда на том же месте для должны ограничить ущерб одной из известных областей, и 3) ложные белые пятна могут быть определены Благодаря их формы (не сферических), их острых краев и их позиции. Мы впервые использовали Avicel RC 581, как ранее опубликованные21,26. Однако RC 581 больше не доступен, и мы успешно заменены RC 591. Адаптировать этот assay для других пар клеток/вирус, концентрация микрокристаллическая должно быть установлено в зависимости от вируса и клетки. Слишком много микрокристаллической целлюлозы могут быть токсичными для клетки и приводит к небольшой таблички, слишком мало приведет к распространению вируса в среде.
Мы описали два примера использования RSV-GFP вируса для мониторинга ИСВ умножения: присутствии АРВ или когда глушителей клеточных белков. Мы продемонстрировали, что сигнал GFP соотносится с вирусной умножения. Представленные здесь метод позволяет легкое оценки вирусных умножения в режиме реального времени. Это позволяет ученым легко определить IC50 противовирусного препарата, как показано на рисунке 7. Важно отметить, что это измерение адаптированы для использования в средних или широкополосной связи, особенно для скрининга химических библиотек. Этот репортер выражая вирус также может быть полезным для оценки воздействия на вирус умножение модуляции клеточных белков. Система РНК-интерференции это биологический процесс, согласно которому конкретные мРНК разлагается после его конкретное признание siRNA, тем самым уменьшая или, в идеале, отмене выражение соответствующего белка27. В пример, приведенный здесь, мониторинг интенсивности сигнала GFP RSV-GFP-инфицированных клеток мы оценивали влияние подавления вирусных нуклеокапсидом мРНК (N) или узел IMPDH мРНК на RSV умножения. IMPDH2 — Пуриновые биосинтетических фермент, который катализирует ограничения скорости шага к de novo биосинтеза гуаниновых нуклеотидов ИМП28. Таким образом, он является регулятором внутриклеточных гуаниновых нуклеотидов пула. IMPDH ингибиторы, такие как рибавирина, оказывают тормозящее действие на РНК-вирусов, включая RSV инфекции29,30,31. Как показано на рисунке 6, ингибированием экспрессии IMPDH повреждает вирусный умножения, как отмечалось сокращение GFP сигнала, влияние рибавирина на RSV рост передразнивать. Аналогичным образом вирусный умножения почти отменили присутствии siRNA, ориентация вирусного белка N. Ожидалось, что этот результат с siRNA, ориентация белка N ожидалось для предотвращения вирусных нуклеокапсидом Ассамблеи и оказалась сильно ухудшить вирусной репликации32. Администрация этих малых интерферирующих РНК путем распыления препятствует последующей инфекции RSV в здоровых взрослых33. Эффект N или IMPDH siRNA конкретных с ингибитирование GAPDH выражение, выбран в качестве управления гена, не нанесет ущерба вирусный умножения по сравнению с nontargeting siRNA. Обратите внимание, что отсутствие токсичности ячейки был обнаружен в любых условиях. Взятые вместе, эти результаты проверки стратегии, представленные здесь, которая может быть вверх, масштабируется до высокопроизводительного скрининга с помощью библиотек siRNA или другие методы нокаут, например ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технологии34.
Рекомбинантных вирусов, выражая флуоресцентный протеин сплавливания представляют собой мощные инструменты для изучения вирусные белки и вирусных структур динамики. RSV, выражая флуоресцентный белок м2-1 позволяет наблюдение динамики IBs и IBAGs. ИБС, которые могут рассматриваться как вирусные фабрики RSV, отображаются в виде сферических динамических структур. Они способны сливаются в крупных структур сферической формы (рис. 8 и 1 кино). Эти данные позволяют предположить, что RSV IBs являются жидкие органеллы, похож на то, что было описано для вируса бешенства35. IBAGs представляют собой subcompartment внутри IBs, в котором вирусный мРНК и м2-1 протеиновый концентрат, например геномной РНК, нуклеокапсидом и полимеразы, присутствуют только в остальной части IBs12. Видео микроскопии эксперименты показывают, что IBAGs очень динамичной структуры, экспонируется свойств жидкости (рис. 9 и 2 фильма). Они могут рассматриваться как жидкий отсеков в результате жидкость жидкость фазового перехода.
Инструмент выбора для изучения механизмов их умножения и их чувствительность к лекарствам остается возможность генетически манипулирования вирусов. Обратный генетики теперь может считаться частью «классических» методы вирусологии. Однако он остается трудным для некоторых вирусов, как RSV. Вот почему этот протокол описывает подробно шаги, чтобы успешно спасения и усилить рекомбинантных RSVs.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Авторы благодарят д-р Юй Цинь от компании АстраЗенека R & D Бостон, MA, США, за предоставление AZD4316 наркотиков. Авторы благодарны Cymages платформу для доступа к Микроскоп ScanR Olympus, которое было поддержано гранты от региона Иль (DIM один здоровья). Авторы признают поддержки от INSERM и Университет Версаль Сен-Кантен.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены