Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

Мы описываем метод для генерации и усиления генетически модифицированные синцитиальный респираторных вирусов (RSVs) и оптимизированной налета assay RSVs. Проиллюстрируем этот Протокол путем создания двух рекомбинантных вирусов, которые соответственно дать количественную оценку данной RSV репликации и жить анализ RSV включения органов и органов включение связанных гранулы динамики.

Применение рекомбинантного вирусов приобрел решающее значение в основных или прикладной вирусологии. Было доказано обратного генетика быть чрезвычайно мощная технология, как расшифровать механизмы вирусной репликации и для изучения противовирусные препараты или предоставить платформу для разработки вакцин для. Строительство и манипуляции обратный генетической системы для отрицательные strand РНК вируса таких респираторно-синцитиальный вирус (RSV), однако, остается нестабильным и требует специального ноу-хау. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который служит в качестве шаблона для вирусной РНК репликации и транскрипции. Наша система обратной генетики использует cDNA копию генома человека RSV длинные штамм (HRSV). Этот cDNA, а также cDNAs кодирования вирусные белки комплекс полимеразы (L, P, N и м2-1), помещаются в отдельные выражения векторов под T7 полимеразы управляющие последовательности. Трансфекция этих элементов в ЧКР-T7/5 клеток, которые стабильно Экспресс T7 полимеразы, позволяет цитоплазматических репликации и транскрипции рекомбинантных RSV, рождая генетически модифицированных вирионов. Новый RSV, которая присутствует на поверхности клеток и в надосадке культуры BSRT7/5, собирается для того, чтобы заразить клетки человека HEp-2 для амплификации вирусной. Два или три круга усиления необходимы для получения вирусных запасов, содержащих 1 x 10-⁶ до 1 x 10⁷ металлическ формируя единиц (ОРП) / мл. Здесь подробно описаны методы для оптимального сбора урожая, замораживания и титрование вирусных запасов. Мы иллюстрируем протокола, представленные здесь, создав две рекомбинантных вирусов, соответственно выражая бесплатно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) (RSV-GFP) или вирусный м2-1 сливается с GFP (RSV-м2-1-ГФП). Мы покажем, как использовать RSV-GFP квантифицировать RSV репликации и RSV-м2-1-GFP визуализировать вирусный структур, а также динамика вирусных белков в живой клетке, с использованием методов видео микроскопии.

RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире¹. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых²взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития^3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.

RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,⁵. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5' конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5'. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор⁶. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales^7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики^{8,9,11, 12}. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков^{13,14,,1516, 17}. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы¹². Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.

Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году¹⁸. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки¹⁹ имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году²⁰. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.

Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.

1. Подготовка

1. Приобрести мобильные средства массовой информации (сокращение сыворотке СМИ, минимум основных СМИ [мкм], 10 x MEM и Дульбекко модифицированная орла средних [DMEM]), transfection реагента и микрокристаллическая целлюлоза (см. Таблицу материалы).
2. Получить следующую векторов обратной генетики: геномной vector(s) и векторы выражения, кодирование N белка и сложные протеины полимеразы. Геномный векторы содержат полный cDNA геном RSV-GFP (p-RSV-GFP) и RSV-м2 1GFP (p-RSV-м2 1GFP) вниз по течению от бактериофага Т7 РНК полимеразы (T7 pol) промоутер. Векторы выражения (как p-N, p -P, p-L и p м2-1) содержат кодирующая последовательность N, P, L или м2-1 вниз по течению Поль T7 (см. Rincheval et al.¹² и²¹ Rameix-Уэлти et al. для подробной информации относительно плазмидные конструкции).
3. Подготовьте СМИ для клеточной культуры в стерильных условиях и для transfection и инфекции. Использование DMEM с 2 мм L-глютамин дополнены с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 1000 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 1 мг/мл (или без антибиотиков) и MEM с 2 мм L-глютамин дополнена 0%, 2% или 10% FCS, 1000 единиц/мл пенициллин и 1 мг/мл стрептомицин, как «полного среднего» в следующий протокол.
4. Получить BSRT7/5²² клетки и запасов в полного среднего, дополнена 10% диметилсульфоксида (ДМСО) на 1-2 х 10⁶ клеток/мл. Сохранение запасов клеток в жидком азоте. Получите HEp-2 клетки. Культура клетки BSRT7/5 в полной DMEM и HEp-2 клетки в полной MEM при 37 ° C и 5% CO₂ в стерильных условиях.
5. Приготовляют 10 x RSV сохранения раствор (0,5 М HEPES и 1 М MgSO₄ [pH 7.5] в воде) в стерильных условиях.
6. Получите Перевернутый флуоресценции микроскопа совместимы с измерений флуоресценции GFP и совместимы с живой изображений, если это необходимо контролировать инфекцию. Получите Считыватель микропланшетов совместим с GFP измерений флуоресценции для количественный RSV-GFP репликации.

2. спасение и первый проход рекомбинантных вируса

Примечание: Выполните все следующие действия в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.

1. За день до трансфекции, сделать подвеска клеточной линии BSRT7/5 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полной средней. Распространение 2 мл суспензии клеток в колодец в пластине 6-хорошо. Один хорошо за вирус, что собирается быть спасены и один дополнительный хорошо подготовиться отрицательного контроля. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO₂. Убедитесь, что клетки при впадении в 80 – 90% следующий день.
2. Разморозить обратной генетики векторов (с шагом 1,2) p-RSV-GFP и p-RSV-м2-1-GFP, а также p-N, p -P, p-L и p м2-1. Mix, для каждого вируса, чтобы спасти, 1 мкг p-N и p -P, 0,5 мкг p-L, 0,25 мкг p-м2-1 и 1,25 мкг p-RSV (GFP или м2-1 GFP) в трубку.
   Примечание: Могут использоваться различные выражения векторов для N, P, L и м2-1; Однако соотношение белков должен быть сохранен. Выполните отрицательный контроль, заменив вектора p-RSV пустой вектор.
3. Перейти к трансфекции, после протокол transfection реагент производителя (см. таблицу материалы).
   1. 250 мкл сокращение сыворотке среднего, к смешанной векторов. В другой трубки развести 10 мкл Реагента трансфекции в 250 мкл сокращение сыворотке среды. Аккуратно вихревых труб и подождать 5 минут смеси содержимое обоих труб и ждать 20 минут при комнатной температуре.
   2. Промыть BSRT7/5 клеток с 1 мл среды сокращение сыворотке и распространять 1,5 мл MEM с 10% FCS без антибиотиков в колодец. При необходимости, Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ , до завершения инкубации, описанные в шаге 2.3.1.
   3. 500 мкл трансфекции смеси, подготовленную на этапе 2.3.1 в колодец, когда закончится время инкубации 20 мин. Место клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ на 3 дня. Не изменяйте культуры средних клеток во время transfection.
4. Соблюдать GFP флуоресцирования (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном 1 x в день для контроля эффективности спасательных, с использованием GFP фильтр.
5. На второй день после трансфекции семян клетки для первого прохода спасли вирусов. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среды. Распространение 2 мл суспензии клеток в колодец в 6-ну пластине (один хорошо за вирус для спасения и один отрицательный контроль).
6. На третий день трансфекции, скретч клеток в каждой скважине transfected пластины 6-хорошо BSRT7/5, с помощью различных скребок для каждой скважины. Перенесите каждый хорошо содержания (клетки и супернатант) в стерильные 2-мл пробирку microcentrifuge. Вихревой каждой трубки энергично для по крайней мере 30 s выпустить спасли вируса от клеточных мембран.
   Примечание: Это соответствует прохода 0 (P0) спасли вируса (рис. 1).
7. Используйте свежие вирусный P0 подвеска для выполнения первые усилители спасли вирусов.
   1. Удаление питательной среды от пластины 6-ну HEp-2 семенами накануне (см. шаг 2.5) и быстро 500 мкл суспензии P0 (от шага 2.6) в хорошо. Место пластину HEp-2 при 37 ° C на Качели балансир рокер для мягкой агитации за 2 ч.
   2. Удалить и сбросить 500 мкл посевным материалом и добавить 2 мл MEM с 2% FCS. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO₂ на 3 дня. Это позволит производить первый проход (P1) спасли вирусов (рис. 1).
8. Добавьте 1/10 объема 10 x RSV сохранения раствора (0,5 М HEPES и 1 М MgSO₄ [pH 7.5]) в оставшихся P0 подвеска (из шага 2.6). Вихревой пробирок энергично для 5 s и Алиготе содержание в криогенных трубки помечены с алкоголем стойкие метки. Погружать трубы для по крайней мере 1 час в спирте, охладить в-80 ° C и хранить их в-80 ° C.
9. Титруйте P0 запасов (см. шаг 2.6) каждого спасли вируса (см. раздел 4 для титрования целлюлоза микрокристаллическая).
10. Наблюдаю GFP флуоресцирования (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм клеток Нер-2 инфицированных P0 подвеска под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном 1 x в день контролировать инфекцию. Наблюдать под микроскопом brightfield появление мелких syncytia и клеточной отряд, который отражает RSV цитопатогенного эффекта (CPE) (см. Рисунок 2).
11. Обратите внимание, что спасение не если флуоресценции ни CPE виден после 2-3 дня.
12. Соберите первый проход (P1) на день 3 или 4, как описано в пункте 2.6. Вкратце скрести ячейкам, собирать клетки и супернатант вместе, вихревой их, добавить решение сохранения, как описано в шаге 2.8, аликвота образца и заморозить ее.
13. Титруйте (см. раздел 4 для титрования assay) и усилить первый проход (см. раздел 3 для усиления).

3. усиление спасли вирусов

Примечание: Следующий протокол описывает амплификации спасли вирусов в колбе² 75 см. Адаптировать колбу размер тома необходимо и необходимые кратность инфекции (МВД). Таблица 1 показывает томов для различных колбы. Выполните все следующие действия в стерильных условиях в класс безопасности II кабинета.

1. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полного среднего, за день до усиления. Распространять 15 мл суспензии клеток за флакон² 75 см и инкубировать и фляги при 37 ° C и 5% CO₂. Подготовьте один флакон за вирус для того чтобы усилить.
2. На следующий день после начала инкубации, проверьте, что клетки являются 80%-100% притока.
3. Разбавьте вирусный подвеска из шага 2.12 в MEM без FCS для получения 3 мл суспензии на 50000 ОРП/мл (соответствует MOI 0.01 ОРП/ячейки).
4. Удалите носитель и быстро добавить вирусный подвеска 3 мл. Место настой при 37 ° C на Качели балансир рокер для мягкой агитации за 2 ч.
5. Удалить и сбросить посевным материалом и добавляют 15 мл MEM с 2% FCS. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ на 2-4 дней.
6. Проверьте морфологии клеток и флуоресценции ГФП (возбуждение 488 нм) и выбросов на 515-535 Нм под Перевернутый флуоресцентным микроскопом при 20-кратном для того, чтобы оценить время урожай вирусов. Обратите внимание, что это, как правило, когда 50%-80% слоя клеток Нер-2 отсоединяется за CPE RSV, что происходит между 48 и 72 ч postinfection (ИП) (см. рис. 3).
7. Очистите все клетки, клетки скребком. Соберите клетки и супернатант и передавать их на 50 мл пластиковых пробирок.
8. Добавьте 1/10 объема 10 x RSV сохранения раствора (0,5 М HEPES и 1 М MgSO₄ [pH 7.5]). Вихревой трубы энергично для 5 s и уточнить подвеска центрифугированием 5 мин на 200 x g.
9. Передать супернатант Тюбик 50 мл. Вихревой кратко и Алиготе подвеска в криогенных трубки помечены с алкоголем стойкие метки. Погружать труб в помощи-80 ° C алкоголя для по крайней мере 1 час и хранить их в-80 ° C.
10. Размораживать один из аликвоты к Титруйте вирусный подвеска (см. раздел 4).

4. доска титрования Assay

1. Подготовка 12-ну пластины для титрования за день до титрования генотипирования (шесть скважин будет необходимо Титруйте одной трубы вируса). Семя колодцы с 1 мл клеток Нер-2 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среды.
2. Следующий день, подготовить стерильные микрокристаллическая подвеска (2,4% [w/v] в воде) (см. таблицу материалы).
   1. Разогнать 2.4 g порошка микрокристаллической целлюлозы в 100 мл дистиллированной воды, с использованием стандартной магнитной мешалкой, до полного растворения порошка (обычно 4-12 ч). Автоклав подвеска при 121 ° C 20 мин и хранить при комнатной температуре перед использованием.
      Примечание: В таких условиях подвеска является стабильным на 1 год.
   2. После открытия решения в стерильных условиях, храните его при температуре 4 ° C 6 месяцев. Всегда смешивайте подвеска перед использованием (, рукопожатия или vortexing) чтобы убедиться, что это однородной.
3. Подготовьте 2 x мем в стерильных условиях. Разбавить коммерческих MEM 10 x с стерильной водой и добавить L-глютамина, 1000 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 1 мг/мл. Встряхнуть разбавления и хранить при 4 ° C.
   Примечание: Выполните шаги 4.4 – 4.10 в стерильных условиях с помощью класса II безопасности кабинета.
4. Подготовьте шесть пробирки, содержащие 900 мкл MEM без FCS на вирус, чтобы быть титруют (титрование трубки). Оттепель вирус аликвоты, вихревой их энергично за 5 сек и передачи 100 мкл до первого титрования трубки.
5. Выполните десятикратно разрежения 6 x, как показано ниже. Добавьте 100 мкл вируса до 900 мкл среды в первой трубе, наденьте крышку на трубе и смешать ее содержимое, vortexing на несколько секунд. Изменить кончик на пипетку, 100 мкл первого разбавления до 900 мкл среды в второй трубе, наденьте крышку на трубу и вихрь. Повторите процедуру до шестого трубки.
   Примечание: Это очень важно изменить кончик для каждого разведения.
6. Напишите вирус имя и фолд разведений на Нер-2 12-ну пластины. Добавьте знак соответствует пластину и ее обложке, потому что они могут быть разделены во время окрашивания (шаг 4.9). Удалите носитель из пластин и распространять 400 мкл одного разрежения в колодец. Инкубируйте пластины при 37 ° C на 2 ч для адсорбции вирус.
   Примечание: Измените наконечник пипетки между каждой посевным материалом или перейти от низкой к высокой концентрации с тот же Совет. Прививать ограниченной серии плит (1-2) одновременно, чтобы избежать высыхания клетки.
7. Подготовьте микрокристаллическая оверлея при адсорбции вирус (импровизированный подготовка). Чтобы получить 100 мл оверлея, Смешайте 10 мл 2,4% целлюлоза микрокристаллическая подвески, 10 мл 2 x MEM и 80 мл MEM с 2% FCS.
   1. Отрегулируйте пэ-аш 2 x MEM около 7,2 с стерильных бикарбоната натрия раствор 7,5%, после цвет индикатора. Добавьте микрокристаллическая подвеска и MEM и смесь энергично.
8. В конце 2 ч инкубации добавьте 2-3 мл оверлея в каждой скважине 12-ну плит без удаления посевным материалом. Будьте осторожны избежать заражения соседних скважин с высокой вирусной титр Инокулянты. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO₂ на 6 дней. Не двигаться пластину и не перемещайте инкубатора во время инкубации.
9. Перейти к запятнать клетки, с помощью решения кристалл фиолетового (фиолетовый кристалл 8% [v/v], 2% формальдегида [v/v] и 20% этанола [v/v] в воде).
   1. Защита рабочей поверхности биобезопасности, кабинет с листа (фиолетовый кристалл сильно цвета поверхностей).
   2. Осторожно встряхните пластины снимать микрокристаллическая оверлея. Удаление supernatants и вымыть клетки 2 x 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Обработки пластин по одному во избежание высыхания клетки. Добавить 1-2 мл раствора Фиолетовый Кристалл и подождите 10-15 мин удалить решение, которое может быть повторно использован для последующих пластины пятнать.
   3. Погружать пластины и крышки в свежих отбеливателя на несколько секунд и затем вымыть их с водопроводной водой. Обратите внимание, что пластины и охватывает обеззараживания от отбеливателя.
   4. Поместите пластины и крышки на бумажных полотенцах и дайте им высохнуть. Сухие пластины при окружающей температуре после ополаскивания водой и хранить их при комнатной температуре. Для длительного хранения (месяцев), Держите пластины, защищенном от света, чтобы защищать цвета. Обратите внимание, что если клетки теряют их окраски, они могут быть окрашены снова с Фиолетовый Кристалл.
10. Вычислите вирус титры. Граф бляшек в скважинах сухой плиты, которые видны невооруженным глазом. Убедитесь, что количество металлических пластинк в различных разведениях последовательной (фактор 10 между каждого разведения). Выберите хорошо, на котором таблички являются самыми простыми рассчитывать. Оцените количество металлических пластинк против тома посевным материалом и разрежения.
    Примечание: На пример, приведенный на рисунке 421 бляшек, учитываются при разбавлении 10^-5 . Они соответствуют титр
    
    

5. Использование HRSV-GFP рекомбинантных вируса для мониторинга репликации вируса в клетках, обработанных с малые интерферирующие РНК или противовирусные препараты

Примечание: Выполните все действия за исключением 5.1 и 5.2.5 в стерильных условиях с помощью класса II безопасности кабинета.

1. Контроль за эффектом клеточных генов, глушителей на RSV умножения
   Примечание: Протокол transfection зависит реагент (см. Таблицу материалы).
   1. Подготовьте 96-луночных пластины для измерения GFP. За два дня до assay, учитывая малые интерферирующие РНК (siRNA), подготовить раствор сокращение сыворотке сред, содержащих малых интерферирующих РНК в концентрации 100 Нм и siRNA трансфекции реагент разбавлять на 1/500. Инкубируйте решение для 30 мин при комнатной температуре.
   2. Добавьте 25 мкл раствора к добрам плиты, подготовленный в 5.1.1 (в трех экземплярах). Семя колодцы с 75 мкл суспензии клеток A549 в 4 x 10⁵ клеток/мл в полной среды без антибиотиков для получения окончательного ячейки концентрации 3 x 10⁵ кл/мл. Инкубируйте пластину для 48 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
      Примечание: Окончательный siRNA концентрация составляет 25 Нм и окончательный трансфекции объем реагента – 0.5 мкл/хорошо).
   3. Заразить клетки следующим образом. Удалите носитель из скважин. Добавьте 100 мкл суспензии RSV-GFP в 50000 ОРП/мл и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C и 5% CO₂. Удаление вирусный подвеска и 100 мкл DMEM с 2% FCS и без фенола красного. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO₂.
   4. На 24 часа и 48 h п.и., измерения флуоресценции, используя spectrofluorometer набор для возбуждения и выбросов волны 488 и 520 Нм, соответственно (флуоресценции выражается в единицах относительной флуоресценции). Использование noninfected A549 клетки как стандарты для флуоресценции и фоновый уровень.
      Примечание: Клетки должны быть исправлены с параформальдегида 4% (PFA) перед началом измерения их без плиты покрытия.
2. Оценка с помощью RSV-GFP ингибирования наркотиков
   1. Подготовьте 96-луночных пластины для измерения GFP. За день до assay, семя колодцы с 100 мкл суспензии клеток Нер-2 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среды без фенола красного.
   2. Подготовьте серийный разбавление испытанные препараты (AZ4316 в этом примере) в MEM, дополняется 2% FCS и антибиотики (50 мкл на хорошо). Подготовьте вирусный подвеска на 10000 ОРП/мл в MEM без стромальные сосудистый фактор (СФДВ) и фенола красного (50 мкл на хорошо).
   3. Удалите носитель из 96-луночных HEp-2 пластины и добавьте 50 мкл суспензии препарата и 50 мкл вирусный подвеска (в трех экземплярах). Выполните пробный инфекции параллельно как элемент управления.
      Примечание: Разбавления наркотиков и вирусных подвески могут быть смешаны перед их добавлением на клетки, или они могут быть добавлены последовательно.
   4. Инкубируйте пластину для 48 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
   5. Измерьте флуоресценции, используя spectrofluorometer, как описано в шаге 5.1.4. Используйте макет инфицированных клеток Нер-2 в качестве стандартов для флуоресценции фоновых уровней.

6. характеристика м2-1 локализации в Vivo с RSV-м2-1-GFP рекомбинантных вирус

Примечание: Выполните действия 6.1 и 6.2 в стерильных условиях, используя класс безопасности II кабинета.

1. Готовят суспензию клеток Нер-2 на 5 x 10⁵ клеток/мл в полной среды. Семя 1,5 мл суспензии клеток в 35 мм Петри permeant CO₂ и адаптирован для жить изображений.
2. Выполните инфекции на следующий день после посева с вирусом RSV-м2-1-ГФП в MOI 1, как описано в шагах 3.3-3.5 (удалить носитель, 500 мкл до 1 мл посевным материалом и инкубации образца при 37 ° C во время нежно тряска 2 h; удалить посевным материалом и добавить 1,5 мл MEM с 2 % FCS). Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO₂ на требуемое время (IBs начнут появляться от 10 h п.и.).
3. Разогрейте инкубации палаты инвертированным микроскопом с 40 x 100 x целей при 37 ° C, до размещения Петри, содержащие зараженные клетки на сцене. Открыть подачу CO₂ и ждать фокус стабилизации.
4. Выполнение визуализации с фильтрами GFP-совместимых, под возбуждения низкой интенсивности и изображения частоты (от 1 до 0,1 изображений в минуту) для сведения к минимуму Фототоксичность.

В этой работе мы описали подробный протокол производить рекомбинантные RSV вирусов, выражая флуоресцентный белок (рис. 2). В pRSV-GFP гена GFP была введена между P и M генов, как описано для вишни гена в ранее опубликованной работе²¹. В pRSV м2-1-GFP м2 ген был слева нетронутая и между SH и G гены¹²дополнительных гена кодирования для M2-1-GFP был вставлен. Первый шаг, соответствующий спасательных вируса в клетках BSRT7/5, показано на рисунке 2А. Небольших кластеров Зеленый флуоресцентный клеток были видны 72 h posttransfection в скважинах, соответствующий RSV-GFP и RSV-м2-1-GFP спасения. Флуоресцентного сигнала можно наблюдать в цитоплазмы и ядра в RSV-GFP-инфицированных клеток, соответствующее выражение бесплатно GFP. Напротив в RSV-м2-1-GFP спасения, флуоресцентный цитоплазматических точек можно наблюдать, соответствующее накопление м2-1-ГФП в IBs. Обычно на этом этапе наблюдается не CPE (syncytia, отдельные клетки). Наоборот, во время второй шаг, соответствующий вирус амплификации (первый проход) на Нер-2 клетки, CPE был виден в инфицированных клетках на 72 h п.и. (рис. 2B). На рисунке 3A B показывает сильный CPE инфекции RSV, характеризуется большой syncytia, отсоединена или нет и многие плавучие клетки. Syncytia и клетки выставлены ярко зеленой флуоресценцией. На рисунке 3A показывает эволюцию цитопатического эффекта между 24 и 72 h p.i. в клетках, инфицированных вирусом RSV-м2-1-GFP. Несколько разбросанных флуоресцентные клетки были видны на 24 h п.и. без обнаружению CPE. Малые syncytia (кластер люминесцентные клеток) и несколько отдельных клеток/syncytia начали появляться на 48 h п.и. большой флуоресцентный syncytia и плавающие клетки были ясно видны на 72 h п.и.

Фотографии assay металлической пластинкы титрования и вирусных титры, соответствующий процесс производства RSV показаны на рисунке 5. Выполнение assay металлической пластинкы на отрицательный контроль, transfected с только выражение плазмид N, P, L и м2-1, показали не налета на низкие разрежения. Титры, полученные из transfected клеток были как ожидается, будет выше 100 ОРП/мл, если спасение было эффективным, как показано на рисунке 5. Затем титры возросла проходов, чтобы достичь 10⁶– 10⁷ ОРП/мл в 1 или 2. Обратите внимание, что вирусный титры были похожи между двумя рекомбинантных вирусов.

Клетки были transfected с siRNA, ориентация мРНК вирусного белка (N) или двух клеточных белков (инозин-5'-монофосфат дегидрогеназа [IMPDH] и 3'-фосфат-дегидрогеназы Глицеральдегид [GAPDH]). Клетки были также transfected с nontargeting siRNA. Рисунок 6 показывает, мониторинг RSV умножения с помощью RSV-GFP вирус на малых интерферирующих РНК лечение клетки. Сильный сигнал GFP было отмечено (рис. 6A) и измеренных (Рисунок 6B) на клетки управления transfected с nontargeting siRNA или transfected клеток с siRNA против мРНК GAPDH. В отличие от этого было уменьшено экспрессия гена GFP в инфицированных клетках, выражая siRNA, N или IMPDH. Обратите внимание, что мы проверили, что GFP флуоресцентного сигнала в RSV-GFP-инфицированных клеток на 48h п.и. коррелировалось с вирусной доза ранее свидетельством для аналогичных рекомбинантных RSV, выражая Черри (RSV-вишня)²¹. Чтобы оценить эффективность препарата на RSV умножения, HEp-2 клетки были инфицированы RSV-GFP за 48 ч при наличии различных концентраций препарата. Мы наблюдали сильное снижение GFP сигнала, который достиг фонового шума (было отмечено на неинфицированных клеток сигнал), при наличии концентрации наркотиков, как показано на рисунке 7. Наблюдаемые IC50 для AZD4316 было около 4 Нм, похож на опубликованные ЭК50 около 2 – 40 Нм против разных штаммов HRSV²³. Анализ динамики IBs и IBAGs в живых клетках, благодаря RSV-м2-1-GFP, показано в рисунке 8 и Рисунок 9 (и 1 кино и кино 2). IBs появляются как мобильные сферических структуры способны предохранитель, формируя крупных сферических включение. IBAGs очень динамичный. Они проходят непрерывной сборки разборки циклов с образованием небольших IBAGs, которые растут, предохранитель в крупных IBAGs, а затем исчезают.

Таблица 1: Количество клеток и объем посевным материалом для использования в различных контейнерах.

Рисунок 1: Схематическое представление шагов спасения и амплификации. Трансфекция вектора выражения N, P, L, м2-1 и RSV антигеномного РНК в клетки (спасения) BSRT5/7. Выражение антигеномного RSV РНК и мРНК N, P, L и м2-1, T7 РНК-полимеразы. М2-1, L, N и P белки реплицировать и транскрибировать геномной РНК, инициализировала вирусный умножения. Новые вирусные частицы производятся и размножаться, давая рост P0. Затем вирус, добываемых из спасения (P0) усиливаются на Нер-2 клетки производить высокий титр вирусных подвеска (P1) (усиления). Затем это усиливается получить вирусный запасов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: CPE и шаблон флуоресценции, наблюдаемых в течение спасение RSV-GFP и RSV-м2-1-GFP. (A) BSRT5/7 клетки были transfected с обратной генетики векторов как указано, и фазово контрастной и флуоресценции изображения были взяты в 72 ч posttransfection. Отрицательный контроль (Neg Ctrl) соответствует клетки transfected с векторы выражения м2-1, L, N и P без обратного генетического вектора. (B) HEp-2 клетки были инфицированы вирусом, добываемых из transfected клеток BSRT5/7 (нулевой проход, 72 h posttransfection) и изображения были приняты 72 h postinfection. Изображения показаны являются представительной полей; Шкалы бар = 100 мкм. Области в штучной упаковке прилагается клетки показано увеличение; Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Эволюция CPE и флуоресценции наблюдается во время усиления рекомбинантных RSV. HEp-2 клетки были инфицированы в MOI 0,01/клеток ОРП за 72 ч с первый проход (A) RSV-м2-1-GFP или (B) RSV-GFP. Фазово контрастной и флуоресценции изображения были взяты на 24 ч, 48 h и 72 ч postinfection. Изображения показаны являются представительной поля; Шкалы бар = 100 мкм. Области в штучной упаковке прилагается клетки показано увеличение; Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: определение титра RSV, используя assay металлической пластинкы. (A) результаты титрования assay металлической пластинкы в пластине 12-хорошо. Показаны шесть скважин заражены серийных разведений одной вирусные акции. Разбавления указаны в базы-10 логарифм. Клетки, инфицированные с трех первых разведений все отсоединены. Номера налета был замечен с 10^-4, 10^-5_, и 10^-6 разведений согласуются. (B) Иллюстрация налета перечисления (желтые номера). Зеленая звезда показывает царапины на слоя клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: титрование спасенных и усиленные вируса. Доска фенотипов RSV-GFP и RSV-м2-1-ГФП в различных отрывков assayed на Нер-2 клетки в 12-ну пластине (изображения показывают полностью скважин). Титры последующие ходы показаны в таблице. Репрезентативных данных отображаются. Разведений вирусный запасов указаны в базы-10 логарифм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: ингибирование RSV-GFP выражение siRNA, RSV N или IMPDH. A549 клетки обрабатывали управления nontargeting малых интерферирующих РНК (NT) (светло синяя полоса) или siRNA ориентации GAPDH (синяя полоса), RSV N (оранжевый бар) или IMPDH2 (зеленый бар) в течение 48 часов и затем инфицированных RSV-ГФП в MOI 0,05 ОРП/ячейки. Зеленая Флуоресценция было зачитано на 48 ч postinfection. (A) представитель изображения RSV-GFP-инфицированных клеток на 48 ч п.и., лечение с малых интерферирующих РНК, как видно на фотографии. Шкалы бар = 100 µm. (B) данные являются среднее ± SD двух независимых эксперименты, проведенные в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: ингибирование RSV-GFP умножение составных AZD4136. HEp-2 клетки в 96-луночных пластины были инфицированы RSV-ГФП в MOI 0,05 ОРП/ячейки присутствии серийных разведений AZD4316 составные или управления ДМСО. Зеленая Флуоресценция было зачитано на 48 h п.и., данные являются среднее ± SD двух независимых эксперименты, проведенные в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: анализ динамики IBs, отслеживая флуоресцентный белок м2-1-ГФП в HEp-2-инфицированных клеток по микроскопии промежуток времени. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 минут для 5 h с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. IBs флуоресцентные (зеленый), потому что они принимающей м2-1-GFP и ядер запятнаны с Hoechst (синий). Белые стрелки указывают проходят слияние IBs. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: анализ динамики IBAGs в RSV-м2-1-GFP-инфицированных клеток по микроскопии промежуток время. В 18 ч п.и. клетки были образы с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. М2-1-GFP белка был визуализирован на зеленой флуоресценцией. Белые стрелки указывают IBs, проходят слияние IBAGs. Шкалы бар = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фильм 1: In vivo анализ динамики IBs в RSV-м2-1-ГФП в клетках, инфицированных HEp-2. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 минут для 5 h с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. Шкалы бар = 10 мкм. Результате фильм показывает 7 кадров в секунду (fps). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Фильм 2: In vivo анализ динамики IBAGs в RSV-м2-1-GFP-инфицированных клеток. В 18 ч п.и. клетки были образы каждые 5 мин за 3 ч. и 40 мин с флуоресцентным микроскопом, в камере нагревается при 37 ° C. Шкалы бар = 2 мкм. Результате фильм показывает 4 fps. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Здесь мы представляем метод спасения рекомбинантного RSVs из пяти плазмид и их усиление. Возможность манипулировать геном вируса революционизировало вирусологии исследования для тестирования мутации и выразить дополнительных гена или тегами вирусного белка. RSV мы описал и используется в качестве примера в этой статье является вирус, выражая Репортер ген, RSV-GFP (Неизданное) и выражает м2-1 белок сплавили GFP тег¹². RSV спасение является сложной задачей и требует практики. Эффективность трансфекции имеет решающее значение, в зависимости от мудрый выбор реагента transfection и предварительной оптимизации трансфекции протокола. Использование клеток, выражая бактериофага Т7 pol является обязательным, потому что вирусный cDNA находится ниже по течению T7 Поль промоутер в большинстве обратного генетического вектора. Альтернативой является выразить T7 ГСМ от vaccinia вируса помощник. Однако использование клеток, стабильно выражая T7 Поль отпадает необходимость разделения двух вирусов и предотвращает возможные помехи спасения коровью. Это имеет важное значение для выполнения первого прохода обратного генетического (P0 до P1) без замораживания посевным материалом для обеспечения максимальной спасения эффективности. Это означает, что МВД не контролируется. Однако на этом шаге, титры остаются очень низкая, что приводит к низкой МВД для первого прохода. Чтобы получить RSV запасов с высокой инфекционной титры (10⁶– 10⁷ ОРП/мл), важно дождаться сильного CPE и соскрести клетки для сбора вирусных частиц, прилагается к клеткам. В этом исследовании титры не увеличивается после 96 h п.и. Быстрое охлаждение вирусный подвеска важно поддерживать высокие титры. Вместо этого из путем погружения в спирте, охладить при температуре-80 ° C, это может также быть достигнуто путем погружения в смесь сухого льда/этанол или в жидком азоте. Помимо сохранения решения обеспечит больше стабильности вирус подвески в-80 ° C. Хранения при температуре-80 ° C является критическим, поскольку вирус будет быстро потери его инфективности при хранении при температуре-20 ° C, или в жидком азоте. Мы описали RSV усиления на Нер-2 клетки, который является наиболее популярной линии клетки расти RSV, но это также возможность расти эффективно на многочисленных других клеточных линий в пробирке. Однако, обратите внимание, что рост клеток Vero может привести к изменению в G выражение²⁴.

Мы описали очень простой протокол налета титрования RSV, используя наложение микрокристаллическая целлюлоза. Что касается всех анализов титрования чувствительны к загрязнению с высокий титр суспензий, требующих тщательного манипуляции. Обычных анализов титрования RSV использовать агарозы или карбоксиметил целлюлозы (CMC) накладки и требуют иммуноокрашивания и микроскопические наблюдения для определения титра. Протокол, с помощью класса агарозы иммунодиффузии было описано включение прямой визуализации бляшки без иммуноокрашивания²⁵. Однако, Нер-2 клетки очень чувствительны к подогреваемый агар оверлея, что делает этот протокол трудно использовать для нескольких вирус титрования (например, наложение слишком жарко разрушает слоя клеток); с другой стороны когда это не достаточно горячей, он твердеет после первого распространения пластины. Использование микрокристаллической целлюлозы для assay металлической пластинкы впервые описана, Матросович et al. для пробирного титрования вирус гриппа A²⁶. Благодаря своей низкой вязкости оверлея микрокристаллическая легко отказаться и удалить из тарелка скважин, что делает его совместимым с 96-луночных пластинами. Это, таким образом, особенно пригодных для серологических исследований и анализа чувствительности наркотиков. Обратите внимание, что поскольку микрокристаллическая целлюлоза не нужно быть нагрета, препараты могут быть легко включены в оверлее. Важно, однако, что пластины остаются по-прежнему прекрасно во время инкубации; в противном случае большие кометы образный очагов сформирует вместо круглых металлических пластинк. Налета откровение, используя фиолетовый кристалл является дешевым и простым, но это решение является токсичным и должен быть надлежащим образом удаляться. Рециркуляции решения ограничивает отходов производства. Кроме того этот метод чувствителен к повреждения монослоя клеток, которая будет выглядеть как ложные белые пятна, которые не являются вирусные бляшек. Один из примеров показан на рисунке 4 (Зеленая звезда). Для предотвращения этого предубеждения, 1) клетки должны быть обработаны с осторожностью, чтобы избежать царапин или промывка монослое клеток, 2) стремление и дозирования всегда на том же месте для должны ограничить ущерб одной из известных областей, и 3) ложные белые пятна могут быть определены Благодаря их формы (не сферических), их острых краев и их позиции. Мы впервые использовали Avicel RC 581, как ранее опубликованные^21,26. Однако RC 581 больше не доступен, и мы успешно заменены RC 591. Адаптировать этот assay для других пар клеток/вирус, концентрация микрокристаллическая должно быть установлено в зависимости от вируса и клетки. Слишком много микрокристаллической целлюлозы могут быть токсичными для клетки и приводит к небольшой таблички, слишком мало приведет к распространению вируса в среде.

Мы описали два примера использования RSV-GFP вируса для мониторинга ИСВ умножения: присутствии АРВ или когда глушителей клеточных белков. Мы продемонстрировали, что сигнал GFP соотносится с вирусной умножения. Представленные здесь метод позволяет легкое оценки вирусных умножения в режиме реального времени. Это позволяет ученым легко определить IC50 противовирусного препарата, как показано на рисунке 7. Важно отметить, что это измерение адаптированы для использования в средних или широкополосной связи, особенно для скрининга химических библиотек. Этот репортер выражая вирус также может быть полезным для оценки воздействия на вирус умножение модуляции клеточных белков. Система РНК-интерференции это биологический процесс, согласно которому конкретные мРНК разлагается после его конкретное признание siRNA, тем самым уменьшая или, в идеале, отмене выражение соответствующего белка²⁷. В пример, приведенный здесь, мониторинг интенсивности сигнала GFP RSV-GFP-инфицированных клеток мы оценивали влияние подавления вирусных нуклеокапсидом мРНК (N) или узел IMPDH мРНК на RSV умножения. IMPDH2 — Пуриновые биосинтетических фермент, который катализирует ограничения скорости шага к de novo биосинтеза гуаниновых нуклеотидов ИМП²⁸. Таким образом, он является регулятором внутриклеточных гуаниновых нуклеотидов пула. IMPDH ингибиторы, такие как рибавирина, оказывают тормозящее действие на РНК-вирусов, включая RSV инфекции^29,30,31. Как показано на рисунке 6, ингибированием экспрессии IMPDH повреждает вирусный умножения, как отмечалось сокращение GFP сигнала, влияние рибавирина на RSV рост передразнивать. Аналогичным образом вирусный умножения почти отменили присутствии siRNA, ориентация вирусного белка N. Ожидалось, что этот результат с siRNA, ориентация белка N ожидалось для предотвращения вирусных нуклеокапсидом Ассамблеи и оказалась сильно ухудшить вирусной репликации³². Администрация этих малых интерферирующих РНК путем распыления препятствует последующей инфекции RSV в здоровых взрослых³³. Эффект N или IMPDH siRNA конкретных с ингибитирование GAPDH выражение, выбран в качестве управления гена, не нанесет ущерба вирусный умножения по сравнению с nontargeting siRNA. Обратите внимание, что отсутствие токсичности ячейки был обнаружен в любых условиях. Взятые вместе, эти результаты проверки стратегии, представленные здесь, которая может быть вверх, масштабируется до высокопроизводительного скрининга с помощью библиотек siRNA или другие методы нокаут, например ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технологии³⁴.

Рекомбинантных вирусов, выражая флуоресцентный протеин сплавливания представляют собой мощные инструменты для изучения вирусные белки и вирусных структур динамики. RSV, выражая флуоресцентный белок м2-1 позволяет наблюдение динамики IBs и IBAGs. ИБС, которые могут рассматриваться как вирусные фабрики RSV, отображаются в виде сферических динамических структур. Они способны сливаются в крупных структур сферической формы (рис. 8 и 1 кино). Эти данные позволяют предположить, что RSV IBs являются жидкие органеллы, похож на то, что было описано для вируса бешенства³⁵. IBAGs представляют собой subcompartment внутри IBs, в котором вирусный мРНК и м2-1 протеиновый концентрат, например геномной РНК, нуклеокапсидом и полимеразы, присутствуют только в остальной части IBs¹². Видео микроскопии эксперименты показывают, что IBAGs очень динамичной структуры, экспонируется свойств жидкости (рис. 9 и 2 фильма). Они могут рассматриваться как жидкий отсеков в результате жидкость жидкость фазового перехода.

Инструмент выбора для изучения механизмов их умножения и их чувствительность к лекарствам остается возможность генетически манипулирования вирусов. Обратный генетики теперь может считаться частью «классических» методы вирусологии. Однако он остается трудным для некоторых вирусов, как RSV. Вот почему этот протокол описывает подробно шаги, чтобы успешно спасения и усилить рекомбинантных RSVs.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Авторы благодарят д-р Юй Цинь от компании АстраЗенека R & D Бостон, MA, США, за предоставление AZD4316 наркотиков. Авторы благодарны Cymages платформу для доступа к Микроскоп ScanR Olympus, которое было поддержано гранты от региона Иль (DIM один здоровья). Авторы признают поддержки от INSERM и Университет Версаль Сен-Кантен.