Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

La utilización de virus recombinantes se ha vuelto crucial en virología básica o aplicada. Genética inversa ha demostrado para ser una tecnología muy potente, tanto para descifrar los mecanismos de replicación viral y a estudiar antivirales o proporcionar la plataforma de desarrollo de vacunas. La construcción y manipulación de un sistema de genético reverso para un negativo-strand RNA virus como un virus sincitial respiratorio (VSR), sin embargo, sigue siendo delicadas y requiere conocimientos técnicos especiales. El genoma del RSV es un ARN monocatenario, de sentido negativo de aproximadamente 15 kb que sirve como plantilla para la replicación del RNA viral y transcripción. Nuestro sistema de genética reversa utiliza una copia del cDNA del genoma humano de largo cepa de RSV (HRSV). Este cDNA, así como de los cDNAs que codifican las proteínas virales de la polimerasa compleja (L, P, N y M2-1), se colocan en vectores de expresión individual bajo secuencias de control de polimerasa de T7. La transfección de estos elementos en células BSR-T7/5, que estable expresan T7 polimerasa, permite la replicación citoplasmática y transcripción de la RSV recombinante, dando lugar a viriones modificados genéticamente. Una RSV nueva, que está presente en la superficie celular y en el sobrenadante de cultivo de BSRT7/5, se reunió para infectar las células humanas de HEp-2 para la amplificación viral. Dos o tres rondas de amplificación son necesarios para obtener las poblaciones virales que contiene 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ unidades formadoras de placa (PFU) / mL. Métodos para la óptima recolección, congelación y valoración de las poblaciones virales se describen aquí en detalle. Ilustramos el protocolo que se presenta aquí mediante la creación de dos virus recombinantes que expresan respectivamente gratis proteína verde fluorescente (GFP) (RSV-GFP) o M2-1 viral fusionada a GFP (RSV-M2-1-GFP). Mostramos cómo utilizar RSV-GFP para cuantificar replicación RSV y la RSV-M2-1-GFP para visualizar estructuras virales, así como la dinámica de la proteína viral en células vivas, mediante técnicas de microscopia video.

RSV humano es la principal causa de hospitalización por infección respiratoria aguda en niños en todo el mundo¹. Además, RSV se asocia con una sustancial morbilidad en adultos comparables a la gripe, con la mayor parte de la hospitalización y la carga de mortalidad en los ancianos². No hay vacunas o antivirales específicos disponibles sin embargo contra el VRS, pero promete nuevos fármacos están en desarrollo^3,4. La complejidad y la pesadez de las técnicas de cuantificación de la multiplicación de RSV impiden la búsqueda de antivirales o vacunas a pesar de esfuerzos considerables. La cuantificación de la multiplicación de RSV in vitro se basa generalmente en métodos laboriosos, lentos y costosos, que consisten sobre todo en el análisis del efecto citopático por microscopia, immunostaining, reducción de placa ensayos cuantitativos (qRT) de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de polimerasa (PCR) y enzima-ligado del inmunosorbente pruebas de ensayo. Virus con genomas modificados y la expresión de genes reporteros, tales como codificación de la GFP, son más convenientes para tales proyecciones. Junto a la utilización de lectores de placa automatizada, virus recombinantes portadores de gen reportero pueden hacer estos ensayos más conveniente para los propósitos de estandarización y alto rendimiento.

RSV es un virus ARN de sentido negativo envuelto, que pertenece al género Orthopneumovirus de Pneumoviridae familiar, orden Mononegavirales⁵. El genoma del RSV es un ARN monocatenario, de sentido negativo de unos 15 kb, que contiene una región noncoding en el extremos 3' y 5' llamado líder y Trailer y 10 unidades transcripcionales que codifican 11 proteínas. Los genes se ordenan como sigue: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificación de las proteínas de 1 M2 y M2-2) y L-5'. El ARN genómico firmemente empaquetado por la nucleoproteína N. usando el genoma de ARN genómico como plantilla, viral RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) se asegurará de transcripción y replicación del ARN viral. RdRp viral se compone de la proteína grande L que lleva la actividad de polimerasa nucleótidos por sí, su cofactor obligatorio la fosfoproteína P y la proteína M2-1 que funciona como una transcripción viral factor⁶. En las células infectadas, RSV induce la formación de inclusiones citoplasmáticas llamadas cuerpos de inclusión (IBs). Inclusiones citoplásmicas morfológicamente similares se han observado varios Mononegavirales^7,8,9,10. Recientes estudios sobre el virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de Ebola y RSV demostrada que la síntesis de RNA viral ocurre en IBs, que pueden considerarse así como fábricas virales^{8,9,11, 12}. las fábricas de virus concentrado el ARN y las proteínas virales necesarias para la síntesis de RNA viral y también contienen proteínas celulares^{13,14,15,16, 17}. IBs exhiben un subcompartment funcional llamado gránulos asociada a IB (IBAGs), que se concentran los recién sintetizado naciente mRNA viral junto con la proteína M2-1. El RNA genómico y la L, P y N no son detectados en IBAGs. IBAGs son pequeñas estructuras esféricas dinámicas dentro de IBs que exhiben las propiedades de organelos líquido¹². A pesar del papel central del SCI en la multiplicación viral, muy poco se sabe acerca de la naturaleza, estructura, formación y funcionamiento de estas fábricas virales.

La expresión del genoma de un virus de la polio de un cDNA permitieron la producción de la primera copia viral infecciosa en 1981¹⁸. Para negativo virus de ARN monocatenario, no fue hasta 1994 que la producción de un primer virus de la rabia después de la transfección de plásmidos en células¹⁹ ocurrió. El primer plásmido sistema basado en inversa genético para RSV fue publicado en 1995²⁰. Genética reversa ha conducido a importantes avances en el campo de la virología. La posibilidad de introducir modificaciones específicas en el genoma viral ha proporcionado penetraciones críticas en la replicación y patogenia del virus del RNA. Esta tecnología también ha facilitado el desarrollo de vacunas por lo que permite la atenuación específica a través de una serie específica de modificaciones. Modificaciones del genoma que permite una cuantificación rápida de la multiplicación viral grandemente mejoraron del antiviral proyección y estudio de su modo de acción.

Aunque descrito previamente, obtención de transgénicos RSVs sigue siendo delicado. Aquí detallamos un protocolo para crear dos tipos de HRSV recombinante, respectivamente expresan GFP RSV o RSV-M2-1-GFP. En este protocolo, describimos las condiciones de la transfección a rescatar los nuevos virus recombinantes, así como su amplificación para obtener poblaciones virales con alto título, apto para experimentaciones reproducibles. La construcción de vectores de la genética reversa propiamente se describe aquí. Describir métodos de cosecha óptima y la congelación de las poblaciones virales. El método más preciso para cuantificar partículas infecciosas virales sigue siendo el ensayo de placa. Las células son infectadas con diluciones seriadas de la suspensión analizada y se incubaron con un recubrimiento que impide la difusión de partículas virales libres en el sobrenadante. En esas condiciones, el virus infectará sólo celdas contiguas formando una "placa" para cada partícula infecciosa inicial. En el análisis convencional de la titulación de RSV, placas son reveladas por inmunotinción y contadas bajo observación microscópica. Este método es costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí describimos un protocolo muy simple para un ensayo de placa de RSV mediante recubrimiento de celulosa microcristalina que permite la formación de placas visibles al ojo desnudo. Mostramos cómo se puede utilizar RSV-GFP a medida RSV replicación y, por tanto, para cuantificar el impacto de antivirales. Combinación de genética reversa y en tecnología de imagen, demostramos cómo RSV-M2-1-GFP permite a los científicos visualizar M2-1 en células vivas y seguir la dinámica de estructuras virales intracelulares, como IBs.

1. material preparación

1. Compra de medios de comunicación de la célula (suero reducido soporte, mínimo esencial [MEM], 10 x MEM y Dulbecco de modificado medio de águila [DMEM]), reactivo de transfección y celulosa microcristalina (véase Tabla de materiales).
2. Obtener los siguientes vectores de genética reversa: vector(s) genómica y los vectores de expresión que codifican la proteína N y las proteínas del complejo polimerasa. Los vectores de la genómicos contienen el cDNA completo genoma del RSV-GFP (GFP-RSV-p) y del RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) aguas abajo de la promotora de bacteriófago T7 ARN polimerasa (pol T7). Los vectores de expresión (designado como p-N, p p -P,-L y p-M2-1) contiene la secuencia de codificación de N, P, L o M2-1 abajo el pol T7 (véase Rincheval et al¹² y Rameix Welti et al²¹ para más detalles sobre las construcciones de plásmido).
3. Preparar los medios de comunicación para un cultivo de células en un ambiente estéril y para la transfección y la infección. Uso DMEM con 2 mM L-glutamina complementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS), 1.000 unidades/mL de penicilina y estreptomicina de 1 mg/mL (o sin antibióticos) y MEM con 2 mM L-glutamina suplementada con 0%, 2% o 10% FCS, 1.000 unidades/mL de penicilina y 1 mg/mL estreptomicina, señalado como "medio completo" en el siguiente protocolo.
4. Obtención de BSRT7/5²² células y hacer acciones en completo suplementado con 10% dimetil sulfóxido (DMSO) en 1 a 2 x 10⁶ células/mL. Conservar las poblaciones de células en nitrógeno líquido. Obtener células HEp-2. Cultura BSRT7/5 células en DMEM completo y células HEp-2 en MEM completa a 37 ° C y 5% de CO₂ en un ambiente estéril.
5. Preparar una RSV 10 x conservación solución (0,5 M HEPES y 1 M MgSO₄ [pH 7.5] en agua) en un ambiente estéril.
6. Obtener un microscopio de fluorescencia invertido compatible con mediciones de la fluorescencia de GFP y compatible con vivo de imagen si es necesario controlar una infección. Obtener un lector de microplacas compatible con las mediciones de la fluorescencia de GFP para la cuantificación de la replicación RSV-GFP.

2. rescate y el primer paso de Virus recombinantes

Nota: Realizar los siguientes pasos en un ambiente estéril, usando una clase de seguridad II gabinete.

1. El día antes de la transfección, hacer una suspensión de la línea celular de BSRT7/5 5 x 10⁵ células/ml en medio completo. Distribuir 2 mL de la suspensión celular por pozo en una placa de 6 pozos. Preparar bien por virus, que va a ser rescatado y un pozo adicional para control negativo. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO₂. Comprobar que las células están en una confluencia del 80% – 90% al día siguiente.
2. Desbloquear la genética reversa vectores (en el paso 1.2) p-RSV-GFP y p-RSV-M2-1-GFP, así como p-N, p p -P,-L y p-M2-1. Mezcla, para cada virus rescatar, 1 μg de p-N y p -P, 0.5 μg de p-L, 0,25 μg de p-M2-1 y 1.25 μg de p-RSV (GFP o GFP M2-1) en un tubo.
   Nota: Vectores de expresión diferente de N, P, L y M2-1 pueden ser utilizados; sin embargo, la proporción entre las proteínas tiene que ser mantenido. Realizar el control negativo sustituyendo el vector p-RSV con un vector vacío.
3. Proceder a la transfección, siguiendo el protocolo del fabricante de reactivo de transfección (véase tabla de materiales).
   1. Añadir 250 μl de medio de suero reducido a los vectores mixtos. En otro tubo, diluir 10 μl del reactivo de transfección en 250 μl de medio de suero reducido. Suavemente mezclar los tubos y espere 5 minutos mezcla el contenido de ambos tubos y esperar 20 min a temperatura ambiente.
   2. Enjuague las células de BSRT7/5 con 1 mL de medio de suero reducido y distribuir 1,5 mL de MEM con 10% FCS sin antibióticos por pozo. Si es necesario, incubar a 37 ° C y 5% de CO₂ hasta completa la incubación descrita en el paso 2.3.1.
   3. Añadir 500 μl de la mezcla de transfección preparada en paso 2.3.1 a un pozo, cuando el tiempo de incubación de 20 minutos. Colocar las células en la incubadora a 37 ° C y 5% CO₂ durante 3 días. No cambie el medio de cultivo de las células durante la transfección.
4. Observar la fluorescencia de GFP (excitación a 488 nm) y emisión a 515-535 nm en un microscopio de fluorescencia invertido con 20 aumentos 1 x al día para monitorear la eficacia del rescate, usando la GFP filtro.
5. En el segundo día después de la transfección, las células para el primer paso de los virus rescatados de la semilla. Preparar una suspensión de células HEp-2 en 5 x 10⁵ células/mL en medio completo. Distribuir 2 mL de la suspensión celular por pozo en una placa de 6 pozos (uno bien por virus para rescate y un control negativo).
6. En el tercer día de la transfección, las células scratch en cada pocillo de la placa de 6 pozos de BSRT7/5 transfected, usando un raspador diferentes para cada pozo. Transfiera cada contenido bien (células y sobrenadante) a un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL. Vortex cada tubo vigorosamente durante al menos 30 s para liberar el virus rescatado de las membranas celulares.
   Nota: Esto corresponde al paso 0 (P0) rescatado del virus de la (figura 1).
7. Utilizar la suspensión fresca de P0 viral para realizar la primera amplificación de los virus rescatados.
   1. Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pozos de HEp-2 sembrados el día anterior (ver paso 2.5) y rápidamente agregar 500 μl de la suspensión de P0 (del paso 2.6) por pozo. Coloque la placa HEp-2 a 37 ° C en un eje de balancín subibaja para agitación suave por 2 h.
   2. Retire y deseche el 500 μl del inóculo y añadir 2 mL de MEM con FCS 2%. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 3 días. Esto producirá el primer paso (P1) de los virus rescatados (figura 1).
8. Añadir 1/10 del volumen de solución de conservación de RSV de 10 x (0.5 M HEPES y 1 M MgSO₄ [pH 7.5]) en la suspensión restante de P0 (del paso 2.6). Vórtice los microtubos vigorosamente durante 5 s y alícuota el contenido en tubos criogénicos etiquetados con las etiquetas resistente al alcohol. Sumerja los tubos durante al menos 1 hora en alcohol preenfriado a-80 ° C y almacenar a-80 ° C.
9. Valorar la acción P0 (ver paso 2.6) de cada virus rescatados (ver sección 4 para la valoración de la celulosa microcristalina).
10. Observar la fluorescencia de GFP (excitación a 488 nm) y emisión a 515-535 nm de las células HEp-2 infectadas con la suspensión de P0 bajo un microscopio de fluorescencia invertido con 20 aumentos 1 x al día para controlar la infección. Observar bajo un microscopio de campo luminoso la aparición de pequeños sincicios y desprendimiento que refleja el efecto citopatógeno RSV (CPE) de la célula (ver figura 2).
11. Tenga en cuenta que el rescate ha fracasado si la fluorescencia ni CPE es visible después de 2-3 días.
12. Recoger el primer paso (P1) en día 3 o 4 como se describe en el paso 2.6. En Resumen, raspar las células, recoger las células y sobrenadante junto, vortex, la solución de conservación como se describe en paso 2.8 alícuotas de la muestra y congelarla.
13. Valorar (ver sección 4 para el ensayo de titulación) y ampliar el primer paso (ver sección 3 para la amplificación).

3. amplificación de los virus rescatados

Nota: El siguiente protocolo describe la amplificación de los virus rescatados en un matraz de² 75 cm. Adaptar el tamaño de matraz el volumen necesario y la necesaria multiplicidad de infección (MOI). Tabla 1 indica los volúmenes de diferentes frascos. Realice todos los pasos siguientes en un entorno estéril en una clase de seguridad II gabinete.

1. Preparar una suspensión de células HEp-2 en 5 x 10⁵ células/mL en medio completo, el día antes de la amplificación. Distribuir 15 mL de la suspensión cada frasco de 75 cm² e incube los frascos a 37 º C y 5% CO₂. Preparar un frasco por virus para amplificar.
2. El día después del comienzo de la incubación, comprobar que las células son confluentes de 80 – 100%.
3. Diluir la suspensión viral de paso 2.12 en MEM sin FCS para obtener una suspensión de 3 mL en 50.000 PFU/mL (correspondiente a una MOI de 0.01 UFP/célula).
4. Quite el medio y agregar rápidamente la suspensión viral de 3 mL. Coloque el frasco a 37 ° C en un eje de balancín subibaja para agitación suave por 2 h.
5. Retire y deseche el inóculo y añadir 15 mL de MEM con FCS 2%. Incubar a 37 ° C y 5% CO₂ para 2-4 días.
6. Comprobar la morfología de la célula y la fluorescencia de GFP (excitación a 488 nm) y emisión a 515-535 nm en un microscopio de fluorescencia invertido con 20 aumentos para estimar el momento de cosechar los virus. Tenga en cuenta que esto es generalmente cuando 50 – 80% de la capa de células HEp-2 se desconecta debido a la CPE de RSV que se produce entre 48 y 72 h postinfection (p.i.) (ver figura 3).
7. Raspe todas las celdas con un raspador celular. Reunir las células y el sobrenadante y transferir a un tubo de centrífuga de 50 mL.
8. Añadir el 1/10 del volumen de los 10 x solución de conservación de RSV (0,5 M HEPES y 1 M MgSO₄ [pH 7.5]). Vórtex los tubos vigorosamente durante 5 s y aclarar la suspensión por un centrifugado de 5 minutos a 200 x g.
9. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mL. Mezclar brevemente y alícuota de la suspensión en tubos criogénicos etiquetados con las etiquetas resistente al alcohol. Sumerja los tubos en alcohol preenfriada-80 ° C durante al menos 1 h y almacenarlas a-80 ° C.
10. Liberar una de las alícuotas para valorar la suspensión viral (ver sección 4).

4. placa ensayo de titulación

1. Preparar placas de 12 pocillos para valoración el día antes de que se realice el ensayo de titulación (seis pozos deberá valorar por medio de un tubo de virus). Los pozos con 1 mL de células HEp-2 en 5 x 10⁵ células/mL en medio completo de la semilla.
2. Al día siguiente, preparar una suspensión estéril de celulosa microcristalina (2.4% [p/v] de agua) (véase tabla de materiales).
   1. Dispersar a 2,4 g de polvo de celulosa microcristalina en 100 mL de agua destilada, utilizando un agitador magnético estándar, hasta disolución completa del polvo (generalmente 4-12 h). Autoclave de la suspensión a 121 ° C por 20 min y almacenar a temperatura ambiente antes de usar.
      Nota: Bajo tales condiciones, la suspensión es estable por 1 año.
   2. Después de abrir la solución en un ambiente estéril, almacenar a 4 ° C durante 6 meses. Siempre mezcle la suspensión antes de usar (por mano agitación o vórtex) para asegurarse de que es homogénea.
3. Preparar los 2 x MEM en un ambiente estéril. Diluir comercial MEM 10 x con agua destilada y añadir L-glutamina, 1.000 unidades/mL de penicilina y estreptomicina de 1 mg/mL. Agite vigorosamente la dilución y almacenar a 4 ° C.
   Nota: Realice los pasos 4.4, 4.10 en un ambiente estéril utilizando una clase de seguridad II gabinete.
4. Preparar seis tubos con 900 μl de MEM sin FCS por virus para titularse (la valoración). Descongelar las alícuotas de virus, tubo de vortex vigorosamente por 5 s y transferir 100 μl de la primera valoración.
5. Realizar una dilución por diez 6 x, como sigue. Añadir 100 μL de virus a 900 μL del medio en el primer tubo, ponga la tapa en el tubo y mezclar su contenido con un vórtex durante unos segundos. Cambiar la punta de la pipeta, añada 100 μl de la primera dilución a 900 μl del medio en el segundo tubo, ponga la tapa en el tubo y el vórtice. Repita el procedimiento hasta el sexto tubo.
   Nota: Es muy importante cambiar la punta para cada dilución.
6. Escriba el virus de nombre y las diluciones en las placas de 12 pozos de HEp-2. Agregar una marca para que coincida con la placa y la cubierta, ya que pueden ser separados durante la tinción (paso 4.9). Retire el medio de las placas y distribuir 400 μL de una dilución por pozo. Incubar las placas a 37 ° C por 2 h, para la adsorción del virus.
   Nota: Cambiar la punta de la pipeta entre cada inóculo o proceder de menor a mayor concentración con la punta del mismo. Inocular una serie limitada de placas (1 a 2) al mismo tiempo para evitar que las células de secado.
7. Preparar el recubrimiento de celulosa microcristalina en la adsorción de virus (preparación extemporánea). Para obtener 100 mL de superposición, mezclar 10 mL de 2.4% de celulosa microcristalina suspensión, 10 mL de 2 x MEM y 80 mL de MEM con FCS 2%.
   1. Ajustar el pH de los 2 x MEM para alrededor de 7.2 con una solución de bicarbonato de sodio estéril al 7.5%, siguiendo el indicador de color. Añadir la suspensión de celulosa microcristalina y el MEM y mezclar vigorosamente.
8. Al final de la incubación de 2 h, añadir 2 a 3 mL de superposición en cada pocillo de las placas 12-bien sin retirar el inóculo. Tenga cuidado para evitar la contaminación de los pozos adyacentes con inóculo alto título viral. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 6 días. No mueva la placa y no mover la incubadora durante la incubación.
9. Proceder a la tinción de las células, utilizando solución de violeta cristal (violeta de cristal 8% [v/v] 2% formaldehído [v/v] y 20% [v/v] de etanol en agua).
   1. Proteger la superficie de trabajo de la seguridad de la biotecnología con una hoja (el violeta de cristal colores fuertemente las superficies).
   2. Agite suavemente las placas para sacar el recubrimiento de celulosa microcristalina. Eliminar el sobrenadante y lave las células 2 x 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Manejar los platos uno por uno para evitar que las células de secado. Añadir 1-2 mL de la solución de cristal violeta y esperar 10-15 minutos retirar la solución, que puede ser reutilizada para la tinción de la placa posterior.
   3. Sumergir las placas y las tapas en lejía fresca por unos segundos y, luego, lavarlos bien con agua del grifo. Tenga en cuenta que las placas y cubiertas son descontaminadas por el blanqueador.
   4. Poner las placas y las tapas en toallas de papel y deje secar. Secar las placas a una temperatura ambiente el agua de enjuague y después almacenar a temperatura ambiente. Para largos períodos de almacenamiento (meses), mantener las placas protegidas de la luz para proteger el color. Tenga en cuenta que si las células pierden su coloración, pueden ser teñidos otra vez con cristal violeta.
10. Calcular los títulos de virus. Contar las placas en los pocillos de las placas secas, que son visibles a simple vista. Compruebe que el número de las placas de las diluciones diferentes es coherente (factor de 10 entre cada dilución). Elegir el bien en que las placas son los más fáciles de contar. Evaluar el número de placas versus el volumen de inóculo y la dilución.
    Nota: En el ejemplo proporcionado en la figura 4, 21 placas son contadas en la dilución 10^-5 . Estos corresponden a un título de
    
    

5. el uso de Virus recombinante GFP HRSV para controlar la Replicación Viral en células tratadas con ARN interferente pequeño o antivirales

Nota: Realizar todos los pasos excepto el 5.1 y 5.2.5 en un ambiente estéril utilizando una clase de seguridad II gabinete.

1. El efecto de silenciamiento sobre multiplicación de RSV del gen celular de monitoreo
   Nota: El protocolo de la transfección depende del reactivo (véase Tabla de materiales).
   1. Preparar placas de 96 pocillos para la medición de la GFP. Dos días antes del ensayo, para dado ARN interferente pequeño (siRNA), preparar una solución de medios de comunicación reducido suero que contiene siRNA en una concentración de 100 nM y un reactivo de transfección de siRNA diluido al 1/500. Incubar la solución durante 30 min a temperatura ambiente.
   2. Añadir 25 μl de la solución a los pozos de la placa preparada en 5.1.1 (por triplicado). Semilla de los pozos con 75 μl de una suspensión de células A549 en 4 x 10⁵ células/mL en medio completo sin antibióticos para obtener una concentración celular final de 3 x 10⁵ células/mL. Incube la placa durante 48 h a 37 ° C y 5% CO₂.
      Nota: La concentración final de siRNA es de 25 nM y el volumen de reactivo de transfección final es 0,5 μL/pocillo).
   3. Infectar a las células como sigue. Retire el medio de los pozos. Añadir 100 μl de suspensión de RSV-GFP en 50.000 PFU/mL e incubar por 2 h a 37 ° C y 5% CO₂. Retirar la suspensión viral y añadir 100 μl de DMEM con 2% de FCS y sin rojo de fenol. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO₂.
   4. En 24 h y 48 h p.i., medir la fluorescencia, utilizando un spectrofluorometer a longitudes de onda de excitación y emisión de 488 y 520 nm, respectivamente (fluorescencia se expresa en unidades de fluorescencia relativa). Utilizar células A549 como estándares para los niveles de fluorescencia y el fondo.
      Nota: Las células deben fijarse con 4% paraformaldehido (PFA) antes de medir sin la tapa de la placa.
2. Evaluación de la inhibición de la droga con RSV-GFP
   1. Preparar placas de 96 pocillos para la medición de la GFP. El día antes del ensayo, la semilla los pocillos con 100 μl de una suspensión de células HEp-2 en 5 x 10⁵ células/mL en medio completo sin rojo de fenol.
   2. Preparar una dilución seriada de la probado drogas (AZ4316 en este ejemplo) en MEM complementado con 2% de FCS y los antibióticos (50 μL por pocillo). Preparar una suspensión viral 10.000 PFU/ml de MEM sin factor vascular stromal (SVF) y sin rojo de fenol (50 μL por pocillo).
   3. Retire el medio de la HEp-2 de 96 pocillos de la placa y añadir 50 μl de la suspensión de droga y 50 μl de la suspensión viral (por triplicado). Realizar una simulacro infección paralelamente como control.
      Nota: La dilución de la droga y suspensión viral pueden ser mezclados antes de añadir en las celdas, o se puede añadir secuencialmente.
   4. Incube la placa durante 48 h a 37 ° C y 5% CO₂.
   5. Medida de la fluorescencia, usando un spectrofluorometer como se describe en el paso 5.1.4. Utilizar células HEp-2 infectadas con mofa como estándares para los niveles de fondo de fluorescencia.

6. Caracterización de la M2-1 localización en Vivo con el Virus recombinante VSR-M2-1-GFP

Nota: Realice los pasos 6.1 y 6.2 en un ambiente estéril, usando una clase de seguridad II gabinete.

1. Preparar una suspensión de células HEp-2 en 5 x 10⁵ células/mL en medio completo. Semillas de 1,5 mL de la suspensión celular en un 35 mm plato de Petri permeant a CO₂ y adaptada para viven imágenes.
2. Realice la infección el día después de la siembra con el virus RSV-M2-1-GFP en MOI 1, como se describe en pasos 3.3-3.5 (quitarlo del medio, Añadir 500 μl a 1 mL de inóculo, incubar la muestra a 37 º C agitando suavemente por 2 h; eliminar el inóculo y añadir 1,5 mL de MEM con 2 % FCS). Incube las células a 37 ° C y 5% CO₂ durante el tiempo deseado (IBs empezarán a aparecer desde 10 h p.i.).
3. La cámara de incubación de un microscopio invertido, dotado de 40 x a 100 objetivos x a 37 ° C, antes de colocar la placa de Petri conteniendo las células infectadas en la etapa de precalentamiento. Abra la fuente de CO₂ y espere para la estabilización del foco.
4. Realizar la proyección de imagen con filtros compatibles con GFP, debajo de una frecuencia de excitación baja intensidad y la imagen (de 1 a 0.1 imágenes por minuto) para minimizar la fototoxicidad.

En este trabajo, describe un protocolo detallado para producir virus RSV recombinantes que expresan una proteína fluorescente (figura 2). PRSV-GFP, el gene GFP se introdujo entre los genes P y M, como se describe para el gene de cerezo en el trabajo anteriormente publicado²¹. En el pRSV-M2-1-GFP, el gen M2 fue tocado y un gen adicional que codifica M2-1-GFP fue insertado entre SH y G genes¹². El primer paso, correspondiente al rescate del virus en las células de BSRT7/5, se muestra en la figura 2A. Pequeños racimos de células fluorescentes verdes fueron posttransfection visible 72 h en los pozos correspondientes a rescate RSV-GFP y RSV-M2-1-GFP. La señal fluorescente se podría observar en el citoplasma y los núcleos en las células infectadas por RSV-GFP, correspondiente a la expresión de GFP gratis. En cambio, en el rescate de RSV-M2-1-GFP, pequeños puntos citoplasmáticos fluorescentes podrían observar, corresponde a la acumulación de M2-1-GFP en IBs. Generalmente no CPE (sincicios, células separadas) se observa en este paso. Por el contrario, durante la segunda etapa, correspondiente a la amplificación del virus (primer paso) en células HEp-2, el CPE era visible en las células infectadas en 72 h p.i. (figura 2B). Figura 3A B muestra el fuerte CPE de la infección de RSV, caracterizado por grandes sincicios, separados o no y muchas células flotantes. Sincicios y células exhiben fluorescencia verde brillante. Figura 3A se muestra la evolución del efecto citopático entre 24 y 72 h p.i. en células infectadas con el virus RSV-M2-1-GFP. Algunas células fluorescentes dispersadas eran visibles en el 24 h p.i. sin un CPE detectable. Sincicios pequeño (grupo de células fluorescentes) y algunas células/sincicios independientes comenzaron a aparecer en grandes fluorescentes sincicios de 48 h p.i y las células flotantes eran claramente visibles en 72 h p.i.

Imágenes del ensayo de titulación de placa y los títulos virales correspondientes a todo el proceso de producción de RSV se muestran en la figura 5. Realizar el análisis de la placa en el control negativo, transfectado con sólo la plásmidos de expresión de N, P, L y M2-1, no reveló ninguna placa a la dilución más baja. Los títulos obtenidos de las células transfected debían estar por encima de 100 PFU/mL si el rescate fue eficiente, como se muestra en la figura 5. Entonces, los títulos aumentaron durante los pasos, para llegar a 10⁶– 10⁷ PFU/mL en paso 1 o 2. Tenga en cuenta que los títulos virales son similares entre los dos virus recombinantes.

Las células fueron transfectadas con siRNA contra el ARNm de una proteína viral (N) o de dos proteínas celulares (Inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa [IMPDH] y gliceraldehído 3'-fosfato deshidrogenasa [GAPDH]). Las células fueron transfectadas también con siRNA nontargeting. La figura 6 muestra el seguimiento de la multiplicación de RSV mediante virus RSV-GFP en células tratadas con ARNsi. Una fuerte señal GFP se observó (figura 6A) y medida (Figura 6B) en las células control transfected con siRNA nontargeting o las células transfected con siRNA contra GAPDH mRNA. En cambio, se redujo la expresión de GFP en células infectadas expresando siRNA dirigidas a N o IMPDH. Tenga en cuenta que hemos verificado que la señal fluorescente GFP en células infectadas por RSV-GFP en 48h p.i. se correlacionó con la dosis viral como previamente demostrada para una RSV recombinante similar expresando Cherry (cereza de RSV)²¹. Evaluar la eficacia de la droga en multiplicación de RSV, células HEp-2 fueron infectadas por RSV-GFP por 48 h en presencia de diferentes concentraciones de la droga. Observamos una fuerte disminución de la señal de la GFP, que alcanzó el ruido de fondo (había una señal que se observa en las células no infectadas), en presencia de una concentración creciente de la droga, como se muestra en la figura 7. El IC50 observadas para AZD4316 era cerca de 4 nM, similar a la CE50 publicado de unos 2 – 40 nM contra diferentes cepas HRSV²³. El análisis de la dinámica de IBs y IBAGs en células vivas, gracias a la RSV-M2-1-GFP, se muestran en la figura 8 y figura 9 (y 1 película y película 2). IBs aparecen como estructuras esféricas móviles capaces de fusionar, formando una inclusión esférica más grande. IBAGs son muy dinámicos. Se someten a ciclos de ensamblaje y desensamblaje continua con la formación de IBAGs pequeñas que crecen, fusible en IBAGs grandes y luego desaparecer.

Tabla 1: Número de células y el volumen de inóculo a utilizar en diferentes frascos.

Figura 1: representación esquemática de los pasos de amplificación y rescate. Transfección del vector de expresión de ARN antigenómico N, P, L, M2-1 y RSV en BSRT5/7 células (rescate). Expresión del ARN antigenómico VRS y del mRNA de N, P, L y M2-1, por la polimerasa del RNA T7. Las proteínas N, P, L y M2-1 replican y transcriben el RNA genómico, iniciando un ciclo de multiplicación viral. Nuevas partículas virales se producen y multiplican, dando origen a la P0. Entonces se amplifica el virus cosechado de rescate (P0) en células HEp-2 para producir una suspensión viral mayor de título (P1) (amplificación). Esto luego se amplifica para obtener las poblaciones virales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: CPE y el patrón de fluorescencia observaron durante el rescate de RSV-GFP y RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 células fueron transfectadas con vectores de la genética reversa como se indica, y se tomaron imágenes de contraste de fases y fluorescencia a las 72 h posttransfection. El control negativo (Neg Ctrl) corresponde a las células transfectadas con los vectores de expresión de N, P, L y M2-1 sin el vector genético inverso. (B) células HEp-2 estaban infectadas con el virus de las células transfected BSRT5/7 (el cero paso, posttransfection 72 h) y de imágenes fueron tomadas h 72 agentes. Las imágenes mostradas son de campos representativos; Barra de escala = 100 μm. La zona en caja incluye las células que se muestra en la ampliación; Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: evolución de la CPE y la fluorescencia observada durante la amplificación del recombinante VSR. Células HEp-2 fueron infectadas en un MOI de 0,01 PFU/células de 72 horas con el primer paso del RSV-M2-1-GFP (A) o (B) RSV-GFP. Imágenes de contraste de fases y fluorescencia fueron tomadas en 24 h, 48 h y 72 h agentes. Las imágenes mostradas son de un campo representativo; Barra de escala = 100 μm. La zona en caja incluye las células que se muestra en la ampliación; Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: determinación del título de RSV mediante el ensayo de placa de. (A) resultados de la prueba de titulación de placa en una placa de 12 pozos. Se muestran los seis pozos infectados con diluciones seriadas de una acción viral. Las diluciones se indican en un logaritmo de base 10. Células infectadas con las tres primeras diluciones son todos despegadas. Los números de la placa se observó con el 10^-4, 10^-5_, y 10^-6 diluciones son constantes. (B) ilustración de la enumeración de la placa (números amarillos). La estrella verde indica rasguños en la capa de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: titulación de un virus rescatado y amplificado. Fenotipos de la placa de la RSV-GFP y RSV-M2-1-GFP en los diferentes pasajes que ensayarse en células HEp-2 en una placa de 12 pozos (las imágenes muestran la totalidad de los pozos). Los títulos de los siguientes pasos se muestran en la tabla. Se muestran datos representativos. Diluciones de las poblaciones virales se indican en un logaritmo de base 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: inhibición de la expresión de GFP RSV por siRNA contra RSV N o IMPDH. Las células A549 fueron tratadas con control nontargeting siRNA (NT) (barra azul clara) o siRNA dirigidas a GAPDH (barra azul), N de RSV (barra naranja) o IMPDH2 (verde de la barra) por 48 h y luego infectados por RSV-GFP en un MOI de 0.05 UFP/célula. La fluorescencia verde se leyó en el postinfection de 48 h. (A) imágenes representativas de las células infectadas por RSV-GFP en 48 h p.i., tratados con siRNA como se ve en las fotos. Barra de escala = 100 μm. (B) los datos son la media ± SD de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: inhibición de la multiplicación de RSV-GFP por compuesto de AZD4136. Células HEp-2 en placas de 96 pocillos fueron infectadas por RSV-GFP en un MOI de 0.05 UFP/célula en presencia de diluciones seriadas de AZD4316 compuesto o control de DMSO. Fue leer la fluorescencia verde en 48 h p.i. que datos son la media ± SD de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Análisis de la dinámica del SII mediante el seguimiento de la proteína fluorescente M2-1-GFP en células HEp-2-infected por microscopia de lapso de tiempo. En 18 h p.i., las células fueron reflejadas cada 5 min para 5 h con un microscopio de fluorescencia, en una cámara calentada a 37 ° C. El SII es fluorescente (verde) ya que albergar M2-1-GFP, los núcleos se tiñen con Hoechst (azul). Las flechas blancas indican IBs sometidos a fusión. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Análisis de la dinámica de IBAGs en RSV M2-1-GFP-células infectadas por microscopia de lapso de tiempo. A 18 h p.i., las células fueron fotografiadas con un microscopio de fluorescencia, en una cámara calentada a 37 ° C. La proteína M2-1-GFP fue visualizada por fluorescencia verde. Las flechas blancas indican que experimentan una fusión de IBAGs IBs. Barra de escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 de la película: In vivo análisis de la dinámica de IBs en RSV-M2-1-GFP en células infectadas con HEp-2. En 18 h p.i., las células fueron reflejadas cada 5 min para 5 h con microscopio de fluorescencia, en una cámara calentada a 37 ° C. Barra de escala = 10 μm. La película resultante muestra 7 fotogramas/s (fps). Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Película 2: In vivo análisis de la dinámica de IBAGs en RSV M2-1-GFP-células infectadas. En 18 h p.i., las células fueron reflejadas cada 5 min durante 3 h y 40 min con microscopio de fluorescencia, en una cámara calentada a 37 ° C. Barra de escala = 2 μm. La película resultante muestra 4 fps. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Aquí presentamos un método de rescate de recombinante RSVs de cinco plásmidos y su amplificación. La habilidad de manipular el genoma de los virus ha revolucionado la investigación de virología para probar mutaciones y expresar un gen adicional o una etiquetado proteína viral. El RSV hemos descrito y utilizado como ejemplo en este artículo es un virus que expresa un gen reportero, RSV-GFP (inédito) y expresa una proteína M2-1 fusionada a GFP etiqueta¹². Rescate de RSV es difícil y requiere práctica. La eficiencia de la transfección es crítica, según una selección sabia del reactivo de transfección y una optimización previa del Protocolo de la transfección. Es obligatorio el uso de las células que expresan el pol de bacteriófago T7 porque el cDNA viral se coloca aguas abajo el promotor de T7 pol en la mayor parte del vector genética inversa. Una alternativa es expresar el pol T7 de un virus ayudante de vaccinia. Sin embargo, el uso de las células que expresan estable la pol T7 evita la necesidad de separar los dos virus y evita la posible interferencia de vaccinia con el rescate. Es importante realizar el primer paso de la inversa genética (P0 a P1) sin que se congele el inóculo para asegurar la eficiencia máxima del rescate. Esto implica que no es controlado por el Ministerio del interior. Sin embargo, en este paso, los títulos siguen siendo muy bajos, resultando en un bajo MOI para el primer paso. Para obtener las existencias de RSV con altos títulos infecciosos (10⁶– 10⁷ PFU/mL), es importante esperar un CPE fuerte y para raspar las células que se reúnen las partículas virales a las células. En este estudio, los títulos no aumentó después de 96 h p.i. El enfriamiento rápido de la suspensión viral es importante mantener altos títulos. En lugar de por una inmersión en alcohol preenfriado a-80 ° C, esto se puede también lograr por inmersión en una mezcla de hielo seco/etanol o en nitrógeno líquido. La adición de la solución de conservación asegurará una mayor estabilidad de la suspensión del virus a-80 ° C. El almacenamiento a-80 ° C es crítico, ya que el virus rápidamente pérdida su infectividad cuando se almacena a-20 ° C o en nitrógeno líquido. Hemos descrito la amplificación de RSV en células HEp-2, que es la línea celular más popular para crecer RSV, pero también es capaz de crecer eficientemente en numerosas otras líneas celulares in vitro. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el crecimiento en células Vero puede resultar en una alteración en la expresión de G²⁴.

Hemos descrito un protocolo muy simple de valoración de la placa de RSV con un recubrimiento de celulosa microcristalina. En cuanto a todos los ensayos de titulación, es sensible a la contaminación con suspensiones de alto título, que requieren manipulación cuidadosa. Ensayos de titulación de RSV convencionales utilizan superposiciones de agarosa o carboximetil celulosa (CMC) y requieren immunostaining y observaciones microscópicas para determinación de título. Un protocolo utilizando agarosa grado de inmunodifusión se ha descrito lo que permite la visualización directa de las placas sin immunostaining²⁵. Sin embargo, las células HEp-2 son muy sensibles a una caliente agar de recubrimiento, que hace difícil para varias titulaciones de virus este protocolo (por ejemplo, un recubrimiento muy caliente destruye la capa de células); por el contrario, cuando es no lo suficientemente caliente, se solidifica después de la primera distribución de placa. El uso de celulosa microcristalina para un ensayo de placa primero descrito por Matrosovich et de un virus de influenza A titulación ensayo²⁶. Gracias a su baja viscosidad, la superposición de la celulosa microcristalina es fácil de dispensar y de retirar de los pozos de la placa, lo que es compatible con placas de 96 pocillos. Por lo tanto, es particularmente adaptable a serológico estudios y análisis de sensibilidad de la droga. Tenga en cuenta que desde celulosa microcristalina no necesita ser calentado, las drogas pueden ser fácilmente incorporadas en el recubrimiento. Sin embargo, es importante que las placas siguen siendo perfectamente aún durante la incubación; de lo contrario, grandes focos en forma de cometa se forman en lugar de placas redondas. Revelación de la placa usando cristal violeta es barato y simple, pero esta solución es tóxica y debe desecharse adecuadamente. El reciclaje de la solución de límites de producción de residuos. Además, este método es sensible a daños de monocapa de células que aparecen como puntos blancos falsos que no son placas virales. Un ejemplo se muestra en la figura 4 (estrella verde). Para evitar este sesgo, 1) las células tienen que manejarse con precaución para evitar raspar o limpiar la monocapa celular, 2) aspiración y dispensación siempre tienen que circunscribir el daño a un área conocida en el mismo lugar, y 3) falsas manchas blancas pueden ser identificados Gracias a su forma (no esférica), sus bordes filosos y su posición. Primero utilizamos Avicel RC 581, previamente publicado^21,26. Sin embargo, la RC 581 ya no está disponible y hemos substituido con éxito por RC 591. Para adaptar este análisis a otras parejas de células, virus, la concentración de celulosa microcristalina debe ser determinado dependiendo de los virus y las células. Mucha celulosa microcristalina puede ser tóxica para las células y plomo, para placas pequeñas, demasiado poco conducirá a la difusión del virus en el medio.

Describen dos ejemplos de uso del virus RSV-GFP para controlar la multiplicación de RSV: en presencia de una droga antiviral o al silenciamiento de una proteína celular. Hemos demostrado que la señal GFP está correlacionada con la multiplicación viral. El método aquí presentado permite la evaluación fácil de multiplicación viral en tiempo real. Permite a los científicos determinar con facilidad el IC50 de una droga antiviral, como se muestra en la figura 7. Lo importante, esta medida es adaptable para el uso en medio o de banda ancha, especialmente para el cribado de quimiotecas. Este virus expresando reportero también puede ser útil para evaluar el efecto sobre la multiplicación del virus de una modulación de la expresión de la proteína celular. ARN de interferencia es un proceso biológico por el que un mARN específico se degrada a raíz de su reconocimiento específico por siRNA, disminuyendo o, idealmente, supresión de la expresión de la proteína correspondiente²⁷. En el ejemplo dado aquí, mediante el control de intensidad de la señal GFP en células infectadas por RSV-GFP, se evaluó el impacto del silenciamiento de la nucleocápside viral mRNA (N) o el anfitrión mRNA IMPDH sobre multiplicación de RSV. IMPDH2 es una enzima biosintética de purinas que cataliza un paso tarifa-limitador hacia la biosíntesis de novo de nucleótidos de guanina de IMP²⁸. Por lo tanto es un regulador de la piscina de nucleótido de guanina intracelular. Inhibidores de la IMPDH, como la ribavirina, ejercen efectos inhibitorios sobre virus del RNA, incluyendo infección de RSV^29,30,31. Como se muestra en la figura 6, la inhibición de la IMPDH expresión deteriora la multiplicación viral como se indica por la reducción de la señal de la GFP, mímico los efectos de la ribavirina en el crecimiento de RSV. Asimismo, la multiplicación viral casi se suprime en presencia de siRNA dirigidos a la proteína viral N. Este resultado se esperaba ya que siRNA dirigidos a la proteína N se esperaba evitar el ensamblaje de la nucleocápside viral ha demostrado para afectar fuertemente la replicación viral³². La administración de estos siRNA por nebulización inhibe la posterior infección por RSV en adultos sanos³³. El efecto de siRNA N o IMPDH es específico puesto que la inhibición de la expresión de la GAPDH, elegida como un gen de control, no impide la multiplicación viral en comparación con el siRNA nontargeting. Tenga en cuenta que no se ha detectado ninguna toxicidad celular en cualquier condición. Tomados en conjunto, estos resultados validan la estrategia presentada aquí, que podría hasta escalar al alto rendimiento de cribado utilizando librerías de siRNA u otros métodos de nocaut, como CRISPR Cas9 tecnología³⁴.

Virus recombinantes que expresan una proteína fluorescente de fusión representan herramientas poderosas para el estudio de las proteínas virales y la dinámica de estructuras virales. RSV expresan una proteína fluorescente de M2-1 permite la observación de la dinámica de IBs y de IBAGs. SII, que puede ser considerado como fábricas virales RSV, aparece como estructuras dinámicas esféricas. Son capaces de fusionar para formar estructuras esféricas más grandes (figura 8 y 1 película). Estos datos sugieren que la RSV IBs son organelos líquidos, similares a lo que se ha descrito para el virus de rabia³⁵. IBAGs representan un subcompartment dentro de IBs, mRNA viral y M2-1 concentrado de proteína, como el RNA genómico, la nucleocápside y la polimerasa, sólo están presentes en el resto de los IBs¹². Experimentos de microscopia video revelan que IBAGs son estructuras muy dinámicas, exhibiendo propiedades de líquido (figura 9 y película 2). Se puede considerar como compartimentos líquidos resultantes de la transición de fase líquido-líquido.

La posibilidad de manipular genéticamente virus sigue siendo un instrumento de elección para el estudio de los mecanismos de su multiplicación y su sensibilidad a las drogas. Genética inversa puede considerarse ahora como parte de las técnicas "clásicas" de virología. Sin embargo, sigue siendo arduo para algunos virus, como el RSV. Por esta razón este protocolo describe detalladamente los pasos para rescatar con éxito y amplificar RSVs recombinantes.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores agradecen el Dr. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, Estados Unidos, para proporcionar la droga AZD4316. Los autores agradecemos a la plataforma de Cymages acceso al microscopio ScanR Olympus, que fue apoyado por subvenciones de la región Ile-de-France (DIM una salud). Los autores reconocen apoyo del INSERM y la Universidad de Versailles Saint-Quentin.