جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

يصف لنا طريقة لتوليد وتضخيم وراثيا تعديل فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي (رسفس) ومقايسة البلاك أمثل رسفس. يمكننا توضيح هذا البروتوكول عن طريق إنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي تسمح بالتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV ويعيش تحليل RSV إدراج الهيئات وديناميات حبيبات إدراج الهيئات المرتبطة.

استخدام فيروسات المؤتلف أصبح عاملاً حاسما في علم الفيروسات الأساسية أو التطبيقية. وقد ثبت علم الوراثة العكسي لتكون عبارة عن تقنية قوية للغاية، سواء لفك آليات النسخ المتماثل الفيروسية أو لدراسة الأدوية المضادة للفيروسات أو توفير منصة تطوير اللقاحات. البناء والتلاعب بنظام الجينية العكسية لسلبية-حبلا فيروسات الرنا مثل فيروس المخلوي تنفسي (RSV)، ومع ذلك، تظل حساسة ويتطلب دراية خاصة. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي من حوالي 15 كيلوبايت، يعمل كقالب للنسخ المتماثل للجيش الملكي النيبالي الفيروسية والنسخ. لدينا نظام الوراثة عكس يستخدم نسخة كدنا RSV سلالة طويلة المجين البشري (هرسف). يتم وضع هذا كدنا، فضلا عن كدناس ترميز البروتينات الفيروسية من بوليميريز المعقدة (ل، ف، ن، و M2-1)، في ناقلات التعبير الفردي تحت T7 بوليميريز تسلسلات تحكم. تعداء هذه العناصر في زنزانات فرقة البحث-T7/5، التي تعبر عن ستابلي T7 بوليميريز، يسمح بالنسخ المتماثل هيولى والنسخ من RSV المؤتلف، مما أدى إلى فيريونس المعدلة وراثيا. وتجمع RSV جديدة، التي موجودة على سطح الخلية وفي المادة طافية الثقافة BSRT7/5، لتصيب الإنسان HEp-2 الخلايا للتضخيم الفيروسية. اثنين أو ثلاث جولات من التضخيم مطلوبة للحصول على الأرصدة الفيروسي الذي يحتوي على 1 × 10⁶ و 1 × 10⁷ اللوحة تشكيل وحدات (بفو)/مل. أساليب للأمثل الحصاد، وتجميد، ومعايرة الأرصدة الفيروسية موضحة هنا بالتفصيل. نحن توضيح البروتوكول المعروضة هنا بإنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء الحرة (بروتينات فلورية خضراء) (RSV-التجارة والنقل) أو الفيروسي M2-1 حشو للتجارة والنقل (RSV-M2-1-التجارة والنقل). ونحن تبين كيفية استخدام RSV-التجارة والنقل للتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV و RSV-M2-1-التجارة والنقل لتصور الهياكل الفيروسية، فضلا عن ديناميات الفيروسية البروتين في الخلايا الحية، باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو.

RSV البشرية هو السبب الرئيسي لدخول المستشفى لعدوى الجهاز التنفسي الحادة في الأطفال الرضع في جميع أنحاء العالم¹. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط RSV عبء مرض كبيرة في البالغين مماثلة للأنفلونزا، مع معظم المستشفيات وعبء وفيات المسنين². لا تتوفر أي اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات محددة حتى الآن ضد RSV، لكن الواعدة عقاقير جديدة في التنمية^3،4. التعقيد والخفة لتقنيات القياس الكمي للضرب RSV تعرقل البحث عن الأدوية المضادة للفيروسات أو اللقاحات على الرغم من الجهود الكبيرة الحالية. ويستند التقدير الكمي للضرب RSV في المختبر عموما على طرق شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، التي تتكون غالباً في تحليل تأثير سيتوباثيك بالفحص المجهري، إيمونوستينينج، والحد من البلاك فحوصات، الكمية عكس المنتسخة (قرة)-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والمرتبط بالانزيم الممتز الاعتداء الاختبارات. الفيروسات مع مورثات معدلة والتعبير عن الجينات مراسل، مثل تلك الترميز للتجارة والنقل، وهي أكثر ملاءمة لمثل هذه العروض. بالإضافة إلى استخدام لوحة الآلي القراء، مراسل الجينات تحمل فيروسات المؤتلف يمكن جعل هذه فحوصات أكثر ملاءمة لأغراض التوحيد والفائق.

هو RSV المغلفة، نونسيجمينتيد فيروس الحمض النووي الريبي الشعور السلبي الذي ينتمي إلى جنس أورثوبنيوموفيروس بنيوموفيريداي العائلية، ترتيب مونونيجافيراليس⁵. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي لحوالي 15 كيلو بايت, التي تحتوي على منطقة فضله في الأطراف 3 'و 5' ودعا الزعيم ومقطورة و 10 وحدات النسخي ترميز البروتينات 11. يتم ترتيب الجينات على النحو التالي: 3 '-NS1, NS2، ن، ف، م، ش، ز، و، M2 (ترميز للبروتينات M2-1 و M2-2) و L-5'. الجيش الملكي النيبالي الجينوم محكم وتعبئتها بالبروتين النووي أ. استخدام الجيش الملكي النيبالي المجينية انكابسيداتيد كقالب، وتعتمد على الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بوليميريز الحمض النووي الريبي (RdRp) سيضمن النسخ والنسخ المتماثل من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. RdRp الفيروسية وتتألف من البروتين الكبيرة ل الذي يحمل النشاط بوليميراز النوكليوتيدات في حد ذاتها، عامل مساعد إلزامية فوسفوبروتين ف والبروتين M2-1 الذي يعمل كنسخ فيروسية⁶. في الخلايا المصابة، يستحث RSV تشكيل تضمينات هيولى دعا الهيئات إدراج (IBs). وقد لوحظت تضمينات هيولى شكلياً مشابهة ل عدة مونونيجافيراليس^7،،^،من^89،10. الدراسات التي أجريت مؤخرا على فيروس داء الكلب، فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) وفيروس إيبولا و RSV أظهرت أن توليف الحمض النووي الريبي الفيروسية تحدث في الرابطة، التي يمكن اعتبارها المصانع الفيروسية^8،،من^911، وهكذا ¹²-يركز الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات الفيروسية المطلوبة لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية المصانع الفيروس وتحتوي أيضا على البروتينات الخلوية^13،،من^{1415،16، 17}. IBs معرض سوبكومبارتمينت وظيفية تسمى حبيبات المرتبطة IB (إيباجس)، التي تركز سينثيتيزيد حديثا مرناً الفيروسية الوليدة جنبا إلى جنب مع البروتين M2-1. لا يتم كشف الجيش الملكي النيبالي الجينوم ول، ف ون في إيباجس. إيباجس هي هياكل كروية الحيوي صغيرة داخل الرابطة الذي يحمل خصائص السائل العضيات¹². وعلى الرغم من الدور المركزي للرابطة في تكاثر الفيروس، المعروف القليل جداً حول طبيعة وهيكل داخلي، وتشكيل، وتشغيل هذه المصانع الفيروسية.

التعبير عن جينوم فيروس شلل الأطفال من كدنا مكن إنتاج استنساخ الفيروسية المعدية الأولى في عام 1981¹⁸. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي السلبية واحد-الذين تقطعت بهم السبل، لم يكن حتى عام 1994 أن إنتاج أول فيروس داء الكلب عقب تعداء البلازميدات إلى خلايا¹⁹ وقع. وصدر أول بلازميد عكس الوراثية النظام القائم ل RSV في 1995²⁰. علم الوراثة العكسي أدت إلى إحراز تقدم كبير في مجال علم الفيروسات. إمكانية إدخال تعديلات محددة في الجينوم الفيروسي قدمت رؤى الحرجة في النسخ المتماثل والمرضية من فيروسات الرنا. ويسرت هذه التكنولوجيا أيضا إلى حد كبير تطوير لقاحات بالسماح التوهين محددة من خلال مجموعة مستهدفة من التعديلات. التعديلات الجينوم مما يتيح إجراء تقييم كمي سريع لتكاثر الفيروس إلى حد كبير تحسين فحص الأدوية المضادة للفيروسات، ودراسة لطريقة العمل.

على الرغم من أن وصف سابقا، يبقى الحصول على رسفس المعدلة وراثيا حساسة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء نوعين من هرسف المؤتلف، على التوالي يعبر عن RSV-التجارة والنقل أو RSV-M2-1-التجارة والنقل. في هذا البروتوكول، يصف لنا تعداء الظروف اللازمة لإنقاذ الفيروسات التوليفية الجديدة، فضلا عن التضخيم بالحصول على الأرصدة الفيروسية مع ارتفاع عيار، مناسبة للتجريب استنساخه. بناء ناقلات الوراثة عكس في حد ذاتها لا يرد هنا. يصف لنا أساليب الحصاد المثلى وتجميد الأرصدة الفيروسية. الطريقة الأكثر دقة لقياس الجسيمات الفيروسية المعدية يظل البلاك المقايسة. الخلايا المصابة بتخفيف المسلسل من تعليق تم تحليلها والمحتضنة مع تراكب التي تحظر نشر الجزيئات الفيروسية الحرة في المادة طافية. في مثل هذه الظروف، سيكون فقط تصيب الفيروس الخلايا المتجاورة تشكل "لوحة" لكل الجسيمات المعدية الأولى. في مقايسة المعايرة RSV التقليدية، كشفت عنها immunostaining لويحات وتحسب تحت الملاحظة المجهرية. هذا الأسلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط جداً مقايسة البلاك RSV استخدام تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز التي تمكن من تشكيل لويحات مرئية بالعين المجردة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام RSV-التجارة والنقل لتدبير RSV النسخ المتماثل، ومن ثم لقياس تأثير الأدوية المضادة للفيروسات. الجمع بين علم الوراثة العكسي وتكنولوجيا التصوير الحي، وعلينا أن نبرهن كيف يسمح RSV-M2-1-بروتينات فلورية خضراء العلماء إلى تصور م 2-1 في الخلايا الحية واتباع القوى المحركة لهياكل الفيروسي داخل الخلية، مثل الرابطة.

1-المواد من إعداد

1. شراء وسائل الإعلام الخلية (تعديل المصل انخفاض وسائط الإعلام، وسائل الإعلام الأساسية الدنيا [MEM]، 10 × الفنزويلية، ودولبيكو المتوسطة النسر [دميم])، كاشف تعداء، وميكروكريستالاين سيليولوز (انظر الجدول للمواد).
2. الحصول على ناقلات التالية لعلم الوراثة العكسي: vector(s) الجينوم وناقلات التعبير ترميز البروتين ن والبروتينات المعقدة بوليميراز. ناقلات الجينوم تحتوي على الجينوم الكامل كدنا RSV-التجارة والنقل (ف-RSV-التجارة والنقل) و RSV-M2-1GFP (ف-RSV-M2-1GFP) مجرى النهر من المروج بوليميراز (بول T7) T7 الحمض النووي الريبي عاثية. ناقلات التعبير (سمي فن، فع، ع-L، وف-M2-1) تحتوي على تسلسل الترميز ن، ف، ل، أو M2-1 المصب T7 pol (انظر رينتشيفال et al.¹² و راميش ويلتي et al.²¹ لمزيد من التفاصيل فيما يتعلق بنيات بلازميد).
3. تعد وسائل الإعلام لثقافة خلية في بيئة معقمة وتعداء والعدوى. استخدام دميم مع مم 2 لتر-الجلوتامين تكملة مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) ووحدات مليلتر 1,000 البنسلين والستربتوميسين 1 ملغ/مل (أو بدون المضادات الحيوية) وتستكمل MEM مع مم 2 لتر-الجلوتامين مع FCS 0%، 2%، أو 10%، و 000 1 وحدة/مل البنسلين، و 1 ملغ/مل ستربتوميسين، سميت "المتوسطة كاملة" في البروتوكول التالية.
4. الحصول على خلايا²² BSRT7/5 وجعل الأرصدة في إكمال المتوسطة وتستكمل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في 1 إلى 2 × 10⁶ خلايا/مل. المحافظة على مخزون الخلية في نيتروجين سائل. الحصول على خلايا HEp-2. خلايا HEp-2 في ذاكرة كاملة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في بيئة معقمة والثقافة BSRT7/5 خلايا في دميم كاملة.
5. إعداد 10 x RSV حفظ حلاً (0.5 م حبيس و 1 م MgSO₄ [الرقم الهيدروجيني 7.5] في الماء) في بيئة معقمة.
6. الحصول على مجهر مقلوب الأسفار متوافق مع القياسات fluorescence بروتينات فلورية خضراء ومتوافقة مع التصوير الحي إذا كان من الضروري رصد عدوى. الحصول على قارئ ميكروسكوبية متوافق مع القياسات fluorescence بروتينات فلورية خضراء كوانتيتيشن من النسخ المتماثل RSV-التجارة والنقل.

2-الإنقاذ ومرور أول فيروس المؤتلف

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية في بيئة معقمة، باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

1. قبل تعداء، اليوم الإدلاء بتعليق السطر خلية BSRT7/5 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة. توزيع 2 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة 6-جيدا. إعداد بئر واحدة للفيروس الذي هو الذهاب إلى إنقاذ وبئر واحدة إضافية للمراقبة السلبية. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. تحقق من صحة الخلايا في التقاء 80%-90% في اليوم التالي.
2. إلغاء تجميد الوراثة عكس ناقلات (من الخطوة 1، 2) ف-RSV-التجارة والنقل وف-RSV-M2-1-التجارة والنقل، فضلا عن فن، فع، ع-L، وف-M2-1. مزيج، لكل فيروس الإنقاذ، 1 ميكروغرام من فن وع-ع، 0.5 ميكروغرام لرتبة ف-L، 0.25 ميكروغرام لرتبة ف-M2-1، و 1.25 ميكروغرام لرتبة ف-RSV (بروتينات فلورية خضراء أو بروتينات فلورية خضراء M2 1) في أنبوب.
   ملاحظة: يمكن أن تستخدم ناقلات التعبير مختلفة ن ف، ل وم 2-1؛ ومع ذلك، قد نسبة البروتينات الإبقاء على. تنفيذ مراقبة سلبية بالاستعاضة عن ناقلات ف RSV مع موجه فارغ.
3. المضي قدما إلى تعداء، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة كاشف تعداء (انظر الجدول للمواد).
   1. إضافة 250 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط لناقلات مختلطة. في أنبوب آخر، وتمييع 10 ميليلتر من تعداء الكاشف في 250 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. بلطف دوامة كل الأنابيب وانتظر دقيقة 5 ميكس محتويات كلا أنابيب والانتظار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. شطف الخلايا BSRT7/5 مع 1 مل من المصل انخفاض المتوسطة وتوزيع 1.5 مل MEM مع السفح 10% دون المضادات الحيوية كل بئر. إذا لزم الأمر، احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ حتى يتم الانتهاء في الحضانة هو موضح في الخطوة 2.3.1.
   3. إضافة 500 ميليلتر من مزيج تعداء أعد الخطوة 2.3.1 إلى بئر عندما انتهت فترة الحضانة 20 دقيقة. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 3 أيام. لا تقم بتغيير الثقافة المتوسطة للخلايا خلال تعداء.
4. مراقبة fluorescence التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر تحت مجهر مقلوب الأسفار الساعة 20 x التكبير 1 x يوميا لرصد كفاءة الإنقاذ، في التجارة والنقل باستخدام تصفية.
5. في اليوم الثاني بعد تعداء، بذور الخلايا لمرور أول من الفيروسات تم إنقاذهم. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة. توزيع 2 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة 6-البئر (بئر واحدة كل الفيروسات للإنقاذ ومراقبة سلبية واحدة).
6. اليوم الثالث من تعداء الخلايا الصفر في كل من لوحة BSRT7/5 ترانسفيكتيد 6-جيدا، جيدا باستخدام مكشطة مختلفة لكل بئر. نقل كل المحتوى جيدا (الخلايا والمادة طافية) في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2 عقيمة. دوامة كل أنبوب بقوة على الأقل 30 ثانية الإفراج عن الفيروس الذين تم إنقاذهم من أغشية الخلايا.
   ملاحظة: وهذا يتوافق مع مرور 0 (P0) الفيروس الذين تم إنقاذهم (الشكل 1).
7. استخدام تعليق P0 فيروسية جديدة لتنفيذ التضخيم الأولى من الفيروسات تم إنقاذهم.
   1. إزالة المصنف المتوسطة الثقافة من لوحة 6-بئر HEp-2 قبل يوم واحد (راجع الخطوة 2، 5) وإضافة بسرعة 500 ميليلتر من تعليق P0 (من الخطوة 2، 6) كل بئر. ضع لوحة HEp-2 في 37 درجة مئوية في الروك انظر من رأي للانفعالات لينة ح 2.
   2. إزالة وتجاهل 500 ميليلتر من العدوى وإضافة 2 مل MEM مع FCS 2%. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 3 أيام. هذا وسوف تنتج مرور أول (P1) من الفيروسات تم إنقاذهم (الشكل 1).
8. أضف 1/10 حجم 10 x RSV حفظ الحل (0.5 م حبيس و 1 م MgSO₄ [الرقم الهيدروجيني 7.5]) إلى تعليق P0 المتبقية (من الخطوة 2، 6). دوامة microtubes بقوة عن 5 s وقاسمه المحتويات في الأنابيب المبردة المسمى بواسطة العلامات المقاوم للكحول. تزج أنابيب على الأقل 1 ح في الكحول بريكوليد في-80 درجة مئوية، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
9. تيتراتي الأسهم P0 (راجع الخطوة 2، 6) لكل الذين تم إنقاذهم الفيروسات (انظر الفرع 4 للمعايرة ميكروكريستالاين سيليولوز).
10. مراقبة fluorescence التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر الخلايا HEp-2 مصاب بتعليق P0 تحت مجهر مقلوب الأسفار في التكبير x 20 x 1 يوميا لرصد العدوى. مراقبة تحت مجهر برايتفيلد مظهر سينسيتيا الصغيرة والخلية المفرزة التي تعكس تأثير سيتوباثوجينيك RSV (CPE) (انظر الشكل 2).
11. علما بأن فشل عملية الإنقاذ إذا الأسفار ولا CPE مرئياً بعد 2-3 أيام.
12. تجميع مرور أولى (P1) في يوم 3 أو 4 كما هو موضح في الخطوة 2، 6. وباختصار، تتخلص من الخلايا، وجمع الخلايا والمادة طافية معا، دوامة لهم، إضافة حل الحفظ كما هو موضح في الخطوة 2.8، الكوة العينة، وتجميدها.
13. تيتراتي (انظر القسم 4 لفحص المعايرة) وتضخيم مرور الأولى (انظر القسم 3 للتضخيم).

3-تضخيم الفيروسات تم إنقاذهم

ملاحظة: البروتوكول التالي يصف التضخيم الفيروسات الذين تم إنقاذهم في قارورة² 75 سم. تكييف حجم قارورة على وحدة التخزين المطلوبة وتعدد المطلوب للعدوى (وزارة الداخلية). ويبين الجدول 1 كميات لقوارير مختلفة. تنفيذ كافة الخطوات التالية في بيئة معقمة في فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

1. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسطة كاملة، في اليوم السابق التضخيم. توزيع 15 مل تعليق الخلية الواحدة 75 سم² قارورة واحتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. إعداد قارورة واحدة كل الفيروسات تضخيم.
2. في اليوم التالي لبدء الحضانة، تحقق من صحة الخلايا روافد 80%-100%.
3. تمييع تعليق الفيروسية من الخطوة 2.12 في MEM دون FCS للحصول على تعليق 3 مل في 50,000 بفو/مليلتر (المقابلة لوزارة الداخلية 0.01 بفو/خلية).
4. إزالة المتوسطة وإضافة تعليق الفيروسية 3 مل بسرعة. مكان قارورة على 37 درجة مئوية في الروك انظر من رأي للانفعالات لينة ح 2.
5. إزالة وتجاهل العدوى وإضافة 15 مل MEM مع FCS 2%. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 2-4 أيام.
6. تحقق من مورفولوجيا الخلايا والأسفار التجارة والنقل (الإثارة في 488 نانومتر) والانبعاثات في 515 – 535 نانومتر تحت مجهر مقلوب الأسفار الساعة 20 x التكبير بغية تقدير الوقت المناسب للحصاد الفيروسات. لاحظ أن هذا هو عادة عندما يتم فصل 50%-80% طبقة الخلايا HEp-2 بسبب CPE RSV الذي يحدث بين 48 و 72 ساعة بوستينفيكشن (بي) (انظر الشكل 3).
7. تتخلص من كافة الخلايا باستخدام مكشطة خلية. جمع الخلايا والمادة طافية معا وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
8. أضف 1/10 حجم 10 × حل الحفظ RSV (0.5 "م حبيس" و 1 م MgSO₄ [الرقم الهيدروجيني 7.5]). دوامة الأنابيب قوة ل 5 ق وتوضيح التعليق الطرد المركزي 5 دقائق في 200 x ز.
9. نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل. الدوامة بإيجاز وقاسمه التعليق في الأنابيب المبردة المسمى بواسطة العلامات المقاوم للكحول. تزج الأنابيب في الكحول بريكوليد-80 درجة مئوية على الأقل 1 ح وتخزينها في-80 درجة مئوية.
10. إلغاء تجميد أحد مختبرين تيتراتي بتعليق الفيروسية (انظر القسم 4).

4-لوحة معايرة الإنزيم

1. إعداد لوحات 12-جيدا للمعايرة في اليوم قبل إجراء الفحص معايرة (ستة آبار سيتعين أن تيتراتي أنبوب واحد من الفيروسات). البذور الآبار مع 1 مل خلايا HEp-2 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة.
2. وفي اليوم التالي إعداد تعليق عقيمة ميكروكريستالاين سيليولوز (2.4% [w/v] في الماء) (انظر الجدول للمواد).
   1. تفريق 2.4 غرام مسحوق ميكروكريستالاين سيليولوز في 100 مل ماء المقطر، استخدام محرض مغناطيسي قياسية، حتى حل كامل من المسحوق (عادة ح 4 – 12). اﻷوتوكﻻف التعليق على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتخزينه في درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، التعليق مستقرة لمدة سنة واحدة.
   2. بعد فتح الحل في بيئة معقمة، احفظها في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر. دائماً مزيج تعليق قبل الاستخدام (بالمصافحة باليد أو فورتيكسينج) للتأكد من أنها متجانسة.
3. إعداد 2 × MEM في بيئة معقمة. تمييع MEM التجارية 10 x مع الماء المعقم وإضافة لام الجلوتامين و 1,000 وحدة/مل البنسلين والستربتوميسين 1 ملغ/مل. اهتز إضعاف قوة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: نفذ الخطوات 4.4-4.10 في بيئة معقمة باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.
4. إعداد ست أنابيب تحتوي على 900 ميليلتر من MEM دون FCS كل الفيروسات تكون معاير (أنابيب المعايرة). ذوبان الجليد مختبرين الفيروس، دوامة لهم قوة ل 5 s، ونقل 100 ميليلتر للمعايرة أول أنبوب.
5. أداء إضعاف إضعاف 6 x، كما يلي. إضافة 100 ميكروليتر من الفيروس إلى 900 ميكروليتر من المتوسطة في الأنبوب الأول، وضع الغطاء على الأنبوب، ومزيج محتوياتها قبل فورتيكسينج لبضع ثوان. تغيير التلميح على الماصة، إضافة 100 ميليلتر لتمييع الأولى إلى 900 ميليلتر من المتوسطة في الأنبوب الثاني، وضع الغطاء على أنبوب ودوامه. كرر الإجراء حتى أنبوب السادسة.
   ملاحظة: من المهم جداً لتغيير التلميح لكل تخفيف.
6. كتابة الفيروس اسم وتخفيف حظيرة على لوحات HEp-2 12-جيدا. إضافة علامة لمطابقة اللوحة وغلافه نظراً لأنهم يمكن فصلها خلال تلطيخ (الخطوة 4.9). إزالة المتوسطة من اللوحات وتوزيع 400 ميليلتر لتمييع واحد كل بئر. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 2، للفيروس الامتزاز.
   ملاحظة: تغيير تلميح ماصة بين كل العدوى أو تنطلق من أدنى إلى أعلى تركيز مع نصيحة نفسه. تطعيم سلسلة محدودة من لوحات (1 إلى 2) في نفس الوقت لتجنب الخلايا التجفيف.
7. إعداد تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز أثناء الامتزاز الفيروس (إعداد عفوي). للحصول على 100 مل تراكب، مزيج من 10 مل تعليق 2.4% ميكروكريستالاين سيليولوز، 10 مل 2 × MEM، و 80 مل من MEM مع FCS 2%.
   1. ضبط درجة الحموضة 2 × MEM إلى حوالي 7.2 بمحلول بيكربونات الصوديوم عقيمة 7.5 في المائة، بعد أن مؤشر اللون. أضف تعليق ميكروكريستالاين سيليولوز والذاكرة والمزيج بقوة.
8. تضاف في نهاية الحضانة ح 2، 2 إلى 3 مل تراكب لكل بئر من لوحات 12-جيدا دون إزالة العدوى. كن حذراً لتجنب تلوث الآبار المجاورة مع إينوكولومس عيار الفيروسية عالية. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 6 أيام. لا تقم بتحريك اللوحة ولا تقم بتحريك الحاضنة أثناء الحضانة.
9. المضي قدما بوصمة عار الخلايا، باستخدام الحل البنفسجي كريستال (8% الكريستال البنفسجي [v/v] ونسبة 2% فورمالدهايد [v/v] 20% إيثانول [v/v] في المياه).
   1. حماية سطح العمل للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع ورقة (البنفسجي كريستال بشدة ألوان السطوح).
   2. تهز بلطف لوحات الإقلاع تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز. إزالة في supernatants وتغسل الخلايا 2 x 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). التعامل مع لوحات واحداً تلو الآخر لتجنب الخلايا التجفيف. أضف 1 – 2 مل من محلول الكريستال البنفسجي وانتظر 10-15 دقيقة إزالة الحل، التي يمكن إعادة استخدامها لتلوين لوحة اللاحقة.
   3. تزج بلوحات والأغطية في بليتش جديدة لبضع ثوان، ومن ثم غسلها جيدا بماء الصنبور. لاحظ أن يتم تطهير لوحات ويغطي بالمبيض.
   4. وضع لوحات وأغطية على مناشف ورقية والسماح لهم الجافة. الجافة اللوحات في درجة حرارة المحيطة بعد الشطف المياه وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. للتخزين فترات طويلة (شهور)، تبقى لوحات محمية من الضوء لحماية اللون. لاحظ أن إذا تفقد الخلايا على التلون، أنها يمكن أن تكون ملطخة مرة أخرى كريستال بنفسجي.
10. حساب التتر الفيروس. عد لويحات في آبار لوحات الجافة، والتي تكون مرئية بالعين المجردة. تأكد من أن عدد اللوحات لتخفيف مختلفة مترابطة (عامل 10 بين كل تمييع). اختر البئر التي لويحات أسهل الاعتماد. تقييم عدد لويحات مقابل حجم العدوى والتخفيف.
    ملاحظة: على سبيل المثال قدمت في الشكل 4، تحسب لويحات 21 في التخفيف 10^-5 . وهذه تناظر عيار من
    
    

5-استخدام الفيروس المؤتلف هرسف-التجارة والنقل لمراقبة النسخ المتماثل فيروسية في الخلايا تعامل مع الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة أو الأدوية المضادة للفيروسات

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات باستثناء 5.1 و 5.2.5 في بيئة معقمة باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

1. رصد تأثير الجينات الخلوية إسكات على الضرب RSV
   ملاحظة: تعتمد البروتوكول تعداء على الكاشف (انظر الجدول للمواد).
   1. إعداد لوحات 96-جيدا لقياس التجارة والنقل. يومين قبل الفحص، نظراً للحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)، تعد حلاً المصل انخفاض الوسائط التي تحتوي على siRNA بتركيز 100 نانومتر وكاشف تعداء siRNA تمييع في 1/500. احتضان الحل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إضافة 25 ميليلتر من الحل إلى الآبار التي بليت أعدت في 5.1.1 (في ثلاث نسخ). بذور الآبار مع ميليلتر 75 من تعليق لخلايا A549 في 4 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة دون المضادات الحيوية للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 3 × 10⁵ خلايا/مل. احتضان لوحة ح 48 شركة 37 درجة مئوية و 5%₂.
      ملاحظة: أن تركيز siRNA النهائي هو 25 نانومتر وحجم الكاشف تعداء النهائي 0.5 ميليلتر/جيد).
   3. تصيب الخلايا كما يلي. إزالة المتوسطة من الآبار. إضافة 100 ميليلتر من تعليق RSV-التجارة والنقل في 50,000 بفو/ملليلتر واحتضانها ح 2 في CO 37 درجة مئوية و 5%₂. إزالة تعليق الفيروسية وإضافة 100 ميليلتر من دميم مع FCS 2% ودون الأحمر الفينول. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
   4. في 24 ساعة وبي ح 48، قياس الأسفار، واستخدام سبيكتروفلوروميتير تعيين لموجات الإثارة والانبعاثات من 488 و 520 نانومتر، على التوالي (هو التعبير عن الأسفار في الأسفار النسبية وحدات). استخدام خلايا A549 مصاب كمعايير لمستويات الأسفار والخلفية.
      ملاحظة: الخلايا بحاجة إلى أن تكون ثابتة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) قبل قياس لهم دون غطاء لوحة.
2. تقييم للمخدرات تثبيط استخدام RSV-بروتينات فلورية خضراء
   1. إعداد لوحات 96-جيدا لقياس التجارة والنقل. في اليوم السابق الفحص، البذور الآبار مع 100 ميليلتر من تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة دون الأحمر الفينول.
   2. إعداد إضعاف مسلسل اختبار المخدرات (AZ4316 في هذا المثال) في MEM تكملها FCS 2% والمضادات الحيوية (50 ميليلتر للبئر الواحد). إعداد تعليق فيروسية في 10,000 بفو/مل في MEM دون عامل الأوعية الدموية stromal (SVF) ودون الفينول الأحمر (50 ميليلتر للبئر الواحد).
   3. إزالة المتوسطة من HEp 96-جيدا-2 لوحة وإضافة 50 ميليلتر من تعليق المخدرات و 50 ميليلتر من تعليق الفيروسية (في ثلاث نسخ). أداء مرض صورية بالتوازي كعنصر تحكم.
      ملاحظة: قد تكون مختلطة بتمييع المخدرات وتعليق الفيروسية قبل إضافتها على الخلايا، أو يمكن إضافتها بشكل تسلسلي.
   4. احتضان لوحة ح 48 شركة 37 درجة مئوية و 5%₂.
   5. قياس الأسفار، باستخدام سبيكتروفلوروميتير كما هو موضح في الخطوة 5.1.4. تستخدم الخلايا المصابة موك HEp-2 كمعايير لمستويات الخلفية الفلورية.

6-وصف للتعريب M2-1 في فيفو بفيروس RSV-M2-1-بروتينات فلورية خضراء المؤتلف

ملاحظة: نفذ الخطوات 6.1 و 6.2 في بيئة معقمة، باستخدام فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.

1. إعداد تعليق الخلايا HEp-2 في 5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسط كاملة. ويعيش البذور 1.5 مل تعليق خلية في 35 مم طبق بيتري بيرمينت CO₂ وتكييفها للتصوير.
2. إجراء العدوى اليوم بعد البذر بفيروس RSV-M2-1-التجارة والنقل في وزارة الداخلية 1، كما هو موضح في الخطوات 3، 3 – 3.5 (إزالة المتوسطة، إضافة ميليلتر 500 إلى 1 مل العدوى، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية بينما تهتز برفق ح 2؛ والعدوى وإضافة 1.5 مل MEM مع 2 % سفح المنحدر القاري). احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ للوقت المطلوب (IBs سوف تبدأ في الظهور من 10 ح بي).
3. يسخن الدائرة المجهر المقلوب مجهزة 40 x 100 x أهداف في 37 درجة مئوية، قبل وضع طبق بتري يحتوي على الخلايا المصابة في المرحلة الحضانة. افتح العرض₂ CO والانتظار لتحقيق الاستقرار على التركيز.
4. القيام بالتصوير مع المرشحات المتوافقة مع التجارة والنقل، وتحت تردد إثارة منخفض الكثافة والصورة (من 1 إلى صورة 0.1 في الدقيقة) لتقليل الضيائية.

في هذا العمل، يمكننا وصف بروتوكول مفصلاً لإنتاج فيروسات RSV المؤتلف معربا عن بروتين فلوري (الشكل 2). في برسف-التجارة والنقل، تم إدخال الجين التجارة والنقل بين الجينات ف وم، كما هو موضح للجينات الكرز في الأعمال المنشورة سابقا²¹. في برسف-م 2-1-التجارة والنقل، الجينات M2 يمسها وجينات إضافية الترميز م 2-1-التجارة والنقل تم إدراجها بين الجينات SH وز¹². الخطوة الأولى، المقابلة لإنقاذ الفيروس في الخلايا BSRT7/5، ويظهر في الشكل 2 ألف. وكانت مجموعات صغيرة من الخلايا الفلورية الخضراء بوسترانسفيكشن ح 72 مرئية في الآبار المقابلة لإنقاذ RSV-التجارة والنقل و RSV-M2-1-التجارة والنقل. ويمكن ملاحظة إشارة مضيئة في السيتوبلازم والنواة في الخلايا المصابة RSV-التجارة والنقل، المقابلة للتعبير عن التجارة والنقل مجاناً. وفي المقابل، في إنقاذ RSV-M2-1-التجارة والنقل، النقاط هيولى الفلورسنت الصغيرة يمكن ملاحظة، المقابلة لتراكم م 2-1-التجارة والنقل في الرابطة. عادة يتم ملاحظة لا CPE (سينسيتيا، خلايا منفصلة) في هذه الخطوة. على العكس من ذلك، أثناء الخطوة الثانية، المقابلة لتضخيم الفيروس (أول ممر) في الخلايا HEp-2، كان التعليم المهني المستمر مرئية في الخلايا المصابة في بي ح 72 (الشكل 2). الشكل 3 ألف ويبين ، ب CPE قوي العدوى RSV، تميزت سينسيتيا الكبيرة, منفصلة أم لا، وعدد الخلايا العائمة. سينسيتيا والخلايا أظهرت فلورية خضراء مشرقة. ويبين الشكل 3 ألف تطور أثر سيتوباثيك بين 24 و 72 بي ح في الخلايا المصابة بفيروس RSV-M2-1-التجارة والنقل. الخلايا الفلورسنت متفرقة قليلة كانت مرئية في بي ح 24 دون CPE قابلة للاكتشاف. سينسيتيا الصغيرة (كتلة من الخلايا الفلورسنت) وفصل بعض الخلايا/سينسيتيا بدأت تظهر في 48 ح بي سينسيتيا نيون كبيرة والخلايا الطافية كانت واضحة للعيان في بي ح 72

صور للوحة المعايرة بالانزيم والتتر الفيروسية المقابلة لكامل عملية الإنتاج RSV مبينة في الشكل 5. تنفيذ المقايسة البلاك على المراقبة السلبية، transfected مع فقط والبلازميدات التعبير ن ف، ل وم 2-1، كشف لا اللوحة في إضعاف أدنى. التتر التي تم الحصول عليها من الخلايا transfected يتوقع أن أعلاه بفو مليلتر 100 إذا كان الإنقاذ فعالة، كما هو مبين في الشكل 5. ثم، زيادة التتر عبر الممرات، تصل إلى 10⁶–10⁷ بفو/مل في مرور 1 أو 2. علما بأن التتر الفيروسي متشابهة بين الفيروسات المؤتلف اثنين.

تم transfected الخلايا مع siRNA استهداف مرناً للبروتين الفيروسي (ن) أو اثنين من البروتينات الخلوية (إينوسيني-5 '-الأدينوزين نازعة [إيمبده] ونازعه 3'-فوسفات جليسيرالديهيدي [جابده]). كما تم transfected الخلايا مع siRNA نونتارجيتينج. ويبين الشكل 6 رصد RSV الضرب باستخدام فيروس RSV-التجارة والنقل على معاملة siRNA الخلايا. لوحظ إشارة قوية بالتجارة والنقل (الشكل 6A) ويقاس على مراقبة الخلايا (الشكل 6B) transfected مع siRNA نونتارجيتينج أو الخلايا transfected مع siRNA ضد مرناً جابده. وفي المقابل، انخفض تعبير بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المصابة معربا عن siRNA استهداف N أو إيمبده. ملاحظة أنه يمكننا التحقق من أن إشارة الفلورسنت بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المصابة RSV-التجارة والنقل في بي ح 48 كان يرتبط مع الجرعة الفيروسية كما تبين سابقا ل RSV المؤتلف مشابهة التعبير عن الكرز (RSV-الكرز)²¹. لتقييم فعالية العقاقير في تكاثر RSV، خلايا HEp-2 كانوا مصابين RSV-التجارة والنقل ح 48 حضور مختلف المخدرات تركيزات. لاحظنا انخفاض قوية من إشارة التجارة والنقل، التي وصلت إلى ضجيج الخلفية (كان هناك إشارة إلى الاحتفال في الخلايا غير مصاب)، حضور تركز المتزايد للمخدرات، كما هو مبين في الشكل 7. IC50 الملحوظ ل AZD4316 وكان حوالي 4 نانومتر، مماثلة ل EC50 المنشورة من حوالي 2 – 40 شمال البحر الأبيض المتوسط ضد مختلف سلالات هرسف²³. ويبين تحليل ديناميات IBs وإيباجس في الخلايا الحية، وبفضل RSV-M2-1-التجارة والنقل، الرقم 8 و الرقم 9 (وفيلم 1 و 2 الفيلم). تظهر الرابطة كهياكل كروية متحركة قادرة على الصمامات، تشكيل تضمين كروي أكبر. إيباجس حيوية للغاية. أنها تخضع لدورات الجمعية-التفكيك المتواصل مع تشكيل إيباجس الصغيرة التي تنمو، والصمامات في إيباجس الكبيرة، وثم تختفي.

الجدول 1: عدد الخلايا وحجم العدوى لاستخدامها في قوارير مختلفة.

رقم 1: التمثيل التخطيطي لخطوات الإنقاذ والتضخيم. تعداء ناقل التعبير من الحمض النووي الريبي أنتيجينوميك ن، ف، ل، م 2-1، و RSV داخل الخلايا BSRT5/7 (الإنقاذ). تعبير RSV أنتيجينوميك "الجيش الملكي النيبالي"، ومرناً من ن ف ول و M2-1، بوليميراز الرنا T7. البروتينات ف ول، ن و M2-1 تكرار ونسخ الحمض النووي الريبي الجينوم، بدء دورة تكاثر الفيروس. الجسيمات الفيروسية الجديدة تنتج وتتكاثر، إعطاء الزيادة P0. ثم يتم تضخيمه الفيروس حصادها من الإنقاذ (P0) في الخلايا HEp-2 لإنتاج أعلى عيار فيروسية تعليق (P1) (التضخيم). وهذا يتم تضخيمه ثم الحصول على الأرصدة الفيروسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: التعليم المهني المستمر والنمط للأسفار التي لوحظت خلال إنقاذ RSV-التجارة والنقل و RSV-M2-1-التجارة والنقل- (أ) تم transfected الخلايا BSRT5/7 مع ناقلات الوراثة عكس كما ورد، وتم أخذ صور المرحلة-التباين والأسفار في 72 ح بوسترانسفيكشن. مراقبة سلبية (Neg Ctrl) يناظر الخلايا transfected مع ناقلات التعبير ن ف، ل وم 2-1 دون ناقل الجينية العكسية. (ب) الخلايا HEp-2 كانوا مصابين بالفيروس حصادها من الخلايا BSRT5/7 ترانسفيكتيد (صفر مرور، بوسترانسفيكشن ح 72) وأخذت الصور إمكانية ح 72. الصور التي تظهر حقول الممثل؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. منطقة محاصر إحاطة الخلايا تظهر في التكبير؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تطور التعليم المهني المستمر والأسفار لوحظت خلال تضخيم RSV المؤتلف. الخلايا HEp-2 مصابين في موي بفو 0.01/خلايا ح 72 مع مرور أول (A) RSV-M2-1-التجارة والنقل أو (ب) RSV-التجارة والنقل. أخذت الصور والمرحلة-على النقيض من الأسفار ح 24، ح 48 وح 72 إمكانية. الصور التي تظهر حقل الممثل؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. منطقة محاصر إحاطة الخلايا تظهر في التكبير؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: تحديد عيار RSV استخدام مقايسة البلاك. (أ) نتائج الفحص معايرة اللوحة في صفيحة 12-جيدا. وترد الآبار الستة المصابين بتخفيف المسلسل من أحد الأسهم الفيروسية. يشير إلى تخفيف لوغاريتم العشري. الخلايا المصابة بتخفيف الأولى ثلاثة كل فصل. ولاحظ أرقام اللوحة مع 10^-4، 10^-5_، و 10^-6 تخفيف تتسق. (ب) رسم توضيحي للتعداد البلاك (الأرقام الصفراء). نجمة خضراء تشير إلى خدوش على طبقة الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: معايرة الفيروس الذين تم إنقاذهم وتضخيم. تعمل اللوحة RSV-التجارة والنقل و RSV-M2-1-التجارة والنقل في الممرات المختلفة جزيئي في الخلايا HEp-2 في لوحة 12-جيدا (إظهار الصور بأكملها الآبار). التتر المقاطع اللاحقة تظهر في الجدول. وترد بيانات تمثيلية. يشير إلى تخفيف مخزون الفيروسية لوغاريتم العشري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: تثبيط تعبير RSV-التجارة والنقل siRNA استهداف RSV ن أو إيمبده- خلايا A549 تعامل مع التحكم نونتارجيتينج siRNA (NT) (الشريط الأزرق الخفيفة) أو siRNA استهداف جابده (الشريط الأزرق) أو N RSV (شريط برتقالي) أو IMPDH2 (الخضراء بار) ح 48 والمصابين ثم RSV-التجارة والنقل في وزارة الداخلية 0.05 بفو/خلية. وقد قرأ الفلورية الخضراء في بوستينفيكتيون ح 48. (أ) صور الممثل من الخلايا المصابة RSV-التجارة والنقل في بي ح 48، تعامل مع siRNA كما نشاهد في الصور. شريط المقياس = 100 ميكرومتر.، (ب) البيانات هي ± يعني SD من تجربتين مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: تثبيط تكاثر RSV-التجارة والنقل بمجمع AZD4136- الخلايا HEp-2 في لوحات 96-جيدا كانوا مصابين RSV-التجارة والنقل في وزارة الداخلية 0.05 بفو/خلية حضور تخفيف المسلسل من AZD4316 مركب أو عنصر تحكم [دمس]. وتليت الفلورية الخضراء في بي ح 48 هي البيانات يعني ± SD من تجربتين مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: تحليل لديناميات IBs بتتبع البروتين الفلورسنت م 2-1-بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المصابة HEp-2 بالوقت الفاصل مجهرية. في بي ح 18، خلايا تم تصويرها كل 5 دقائق ح 5 مع مجهر الأسفار، في غرفة ساخنة في 37 درجة مئوية. الرابطة الفلورية (الأخضر) نظراً لأنها تستضيف م 2-1-التجارة والنقل، والملون الأنوية مع هويشت (أزرق). تشير الأسهم البيضاء IBs تخضع الانصهار. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 9: تحليل لديناميات إيباجس في RSV-M2-1-التجارة والنقل-إصابة الخلايا بالميكروسكوب انقضاء الوقت. في بي ح 18، خلايا تم تصويرها مع مجهر الأسفار، في غرفة ساخنة في 37 درجة مئوية. وكان تصور البروتين M2-1-التجارة والنقل الفلورية الخضراء. تشير الأسهم البيضاء IBs تمر بمزيج إيباجس. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الفيلم 1: المجراة في تحليل ديناميات IBs في RSV-M2-1-التجارة والنقل في الخلايا المصابة HEp-2- في بي ح 18، خلايا تم تصويرها كل 5 دقائق ح 5 مع مجهر الأسفار، في غرفة ساخنة في 37 درجة مئوية. شريط المقياس = 10 ميكرون. ويظهر الفيلم الناتج 7 إطارات/s (fps). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

الفيلم 2: تحليل المجراة في ديناميات إيباجس في الخلايا RSV م 2-1-التجارة والنقل-المصابة. في بي ح 18، خلايا تم تصويرها كل 5 دقائق لمدة 3 ساعات و 40 دقيقة مع مجهر الأسفار، في غرفة ساخنة في 37 درجة مئوية. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. ويظهر الفيلم الناتج 4 الثانية. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

هنا نقدم طريقة لإنقاذ المؤتلف رسفس من البلازميدات الخمسة، وعلى التضخيم. القدرة على التلاعب جينوم الفيروسات أحدث ثورة في بحوث علم الفيروسات لاختبار الطفرات والتعبير عن جينات إضافية أو بروتين فيروسي المعلمة. RSV لدينا وصف والمستخدمة كمثال في هذا المقال هو فيروس التعبير عن جين مراسل، RSV-بروتينات فلورية خضراء (غير منشور)، وتعرب عن تنصهر بروتين M2-1 ل علامة التجارة والنقل¹². إنقاذ RSV تحديا وتتطلب الممارسة. كفاءة تعداء أمر بالغ الأهمية، اعتماداً على تشكيلة الحكمة من الكاشف تعداء وتحسين سابقة من بروتوكول تعداء. استخدام خلايا معربا عن pol T7 عاثية إلزامي لأنه يتم وضع كدنا الفيروسية المصب المروج بول T7 في معظم ناقلات الجينية العكسية. وبديل للتعبير عن pol T7 من فيروس اللقاحية مساعد. بيد أن استخدام الخلايا ستابلي معربا عن T7 pol يتجنب ضرورة فصل الفيروسات اثنين ويمنع أي تداخل محتمل من اللقاحية مع الإنقاذ. من المهم أن تؤدي بمرور أول عكس الوراثية (P0 إلى P1) دون تجميد العدوى لضمان الكفاءة القصوى الإنقاذ. وهذا يعني أن وزارة الداخلية لا تخضع للرقابة. ومع ذلك، في هذه الخطوة، التتر تظل منخفضة جداً، ونتج عنه موي منخفضة لمرور أول. الحصول على أرصدة RSV مع التتر المعدية عالية (10⁶–10⁷ بفو/mL)، المهم أن ننتظر CPE قوية وتتخلص من الخلايا لجمع الجسيمات الفيروسية يعلق على الخلايا. في هذه الدراسة، لم يزد التتر بعد 96 ح بي تبريد سريع لتعليق الفيروسية من المهم الحفاظ على التتر عالية. بدلاً من ذلك من قبل الانغماس في الكحول بريكوليد في-80 درجة مئوية، وهذا أيضا يمكن بالغمر في خليط إيثانول/الجليد الجاف أو النتروجين السائل. إضافة حل الحفظ ستضمن استقرار أطول من تعليق الفيروس في-80 درجة مئوية. التخزين في-80 درجة مئوية بالغة الأهمية، حيث أن الفيروس سيتم بسرعة الخسارة العدوى عند تخزينها في-20 درجة مئوية أو في نيتروجين سائل. وصفت لنا التضخيم RSV على الخلايا HEp-2، الذي هو خط الخلية الأكثر شعبية تنمو RSV، ولكن كما أنها قادرة على زيادة كفاءة في العديد من خطوط الخلايا الأخرى في المختبر. نلاحظ، مع ذلك، أن النمو في الخلايا فيرو قد يؤدي إلى تغيير في التعبير ز²⁴.

وصفت لنا بروتوكول المعايرة البلاك من RSV تغشيه ميكروكريستالاين سيليولوز باستخدام بسيط جداً. أما بالنسبة لجميع الاختبارات المعايرة، أنها حساسة للتلوث بالمعلقات عيار عالية، تتطلب معالجة متأنية. استخدام التراكبات السليلوز (CMC) [اغروس] أو كاربوكسيميثيل فحوصات المعايرة RSV التقليدية وتتطلب إيمونوستينينج والملاحظات المجهرية لتحديد عيار. وقد وصفت بروتوكول باستخدام إيمونوديفوسيون الصف [اغروس] تمكين التصور مباشرة من لويحات دون إيمونوستينينج²⁵. ومع ذلك، HEp-2 الخلايا حساسة جداً لإنشاء تراكب أجار ساخنة، مما يجعل من الصعب استخدامها للمعايرة الفيروسات متعددة هذا البروتوكول (مثلاً، إنشاء تراكب حار جداً يدمر طبقة الخلية)؛ من ناحية أخرى، عندما يكون الساخنة لا يكفي، فإنه يتصلب بعد أول لوحة توزيع. استخدام ميكروكريستالاين سيليولوز مقايسة البلاك أول وصف بها ماتروسوفيتش et al فيروس إنفلونزا أ فيروس معايرة الإنزيم²⁶. فضل لها اللزوجة منخفضة، تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز من السهل التخلي عن وأن إزالة من لوحة الآبار، وجعلها متوافقة مع لوحات 96-جيدا. وهكذا، أنها دراسات خاصة قابلة للتكيف للأمصال وتحاليل الحساسية المخدرات. لاحظ أن منذ ميكروكريستالاين سيليولوز لا تحتاج إلى تسخين، المخدرات قد يسهل إدراجها في التراكب. من المهم، مع ذلك، أن اللوحات تظل تماما لا تزال خلال الحضانة؛ وبخلاف ذلك، سوف تشكل البؤر الكبيرة على شكل المذنب بدلاً من لويحات جولة. الوحي البلاك استخدام الكريستال البنفسجي رخيصة وبسيطة، ولكن هذا الحل السامة وأن يتم التخلص منها بشكل صحيح. إعادة التدوير للحل الذي يحد من إنتاج النفايات. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب حساسة لتلف الخلايا أحادي الطبقة التي تبدو كالبقع البيضاء الكاذبة التي لا تكون لويحات الفيروسية. ويبين الشكل 4 (نجمة خضراء) مثال واحد. لمنع هذا التحيز، 1) الخلايا أن يكون التعامل معها بحذر لتجنب خدش أو مسح الخلية أحادي الطبقة، 2) تطلع والاستغناء عن دائماً بذل في نفس المكان للحد من الأضرار التي لحقت بأحد المجالات المعروفة، ويمكن تحديد البقع البيضاء 3) كاذبة بفضل شكلها (غير كروية) والحواف الحادة، وموقفهم. أولاً استخدمنا 581 اتفاقية روتردام أفيسيل، كما نشرت سابقا^21،26. ومع ذلك، 581 اتفاقية روتردام لم يعد متاحاً، واستبدلنا بنجاح قبل 591 اتفاقية روتردام. للتكيف مع هذا التحليل للأزواج الفيروسات الخلية الأخرى، قد تركز ميكروكريستالاين سيليولوز يتحدد تبعاً للفيروس والخلايا. قد يكون الكثير ميكروكريستالاين سيليولوز السامة للخلايا وقد تؤدي إلى لويحات صغيرة، ضئيلة جداً سوف يؤدي إلى انتشار الفيروس في الأجل المتوسط.

وصفت لنا مثالين لاستخدام فيروس RSV-التجارة والنقل لمراقبة تكاثر RSV: حضور العقاقير المضادة للفيروسات أو عند إسكات بروتين خلوي. أظهرنا أن إشارة بروتينات فلورية خضراء يرتبط مع تكاثر الفيروسية. الطريقة المعروضة هنا يسمح التقييم دون عناء الضرب الفيروسية في الوقت الحقيقي. وهي تمكن العلماء بسهولة تحديد IC50 من العقاقير المضادة للفيروسات، كما هو مبين في الشكل 7. الأهم من ذلك، هذا القياس يمكن تكييفها لاستخدامها في المتوسطة أو النطاق العريض، خاصة بالنسبة لفحص المكتبات الكيميائية. قد يكون هذا الفيروس معربا عن مراسل أيضا مفيدة لتقييم تأثير على تكاثر الفيروس تحوير التعبير البروتين الخلوي. تدخل الجيش الملكي النيبالي هو عملية بيولوجية مرناً محددة تتحلل فيه عقب اعترافها محددة ب siRNA، وبالتالي خفض، أو إلغاء وبشكل مثالي، التعبير عن البروتين الموافق²⁷. في المثال المذكور هنا، عن طريق رصد كثافة إشارة بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المصابة RSV-التجارة والنقل، قمنا بتقييم تأثير تكميم أفواه nucleocapsid الفيروسية مرناً (ن) أو المضيف مرناً إيمبده على الضرب RSV. IMPDH2 هو إنزيم السكروز البيورين الذي يحفز خطوة الحد من معدل نحو تخليق نوفو دي الحيوي من النيوكليوتيدات جوانين من الوجود العسكري الدولي²⁸. ومن ثم منظم تجمع النوكليوتيدات جوانين داخل الخلايا. مثبطات إيمبده، مثل ribavirin، ممارسة الآثار المثبطة على فيروسات الرنا، بما في ذلك RSV العدوى^29،،من³⁰³¹. كما هو موضح في الشكل 6، وتثبيط التعبير إيمبده يضعف الضرب الفيروسية كما هو مبين بالحد إشارة بروتينات فلورية خضراء، محاكاة آثار ريبافيرين على النمو RSV. وبالمثل، تضاعف فيروسي تقريبا إلغاء حضور siRNA استهداف البروتين N الفيروسية. ويتوقع هذه النتيجة منذ siRNA استهداف البروتين ن كان من المتوقع أن يمنع الجمعية نوكليوكابسيد الفيروسية وقد ثبت أن تنال بشدة من النسخ المتماثل الفيروسية³². إدارة هذه siRNA من نيبوليزيشن تحول دون الإصابة اللاحقة ب RSV في البالغين الأصحاء³³. أثر siRNA ن أو إيمبده محددة منذ تثبيط التعبير جابده، اختيرت كجين مراقبة، ولا يخل بالضرب الفيروسية بالمقارنة مع siRNA نونتارجيتينج. علما أنه تم الكشف عن لا سمية الخلية في أي ظروف. أخذت معا، التحقق من هذه النتائج الاستراتيجية المعروضة هنا، التي يمكن أن تكون حتى تحجيم للفحص باستخدام siRNA المكتبات أو غيرها من الأساليب خروج المغلوب، مثل Cas9 كريسبر التكنولوجيا³⁴الفائق.

فيروسات المؤتلف معربا عن بروتين فلوري انصهار تمثل أدوات قوية لدراسة ديناميات الفيروسية الهياكل والبروتينات الفيروسية. RSV معربا عن بروتين M2-1 فلورية يتيح مراقبة ديناميات IBs وإيباجس. تظهر الرابطة، التي يمكن أن تعتبر كمصانع RSV الفيروسية، كالهياكل الحيوية كروية. أنهم قادرون على الصمامات معا لتشكيل هياكل كروية أكبر (الشكل 8 و 1 الفيلم). هذه البيانات تشير إلى أن الرابطة RSV العضيات السائلة، مماثلة لما تم وصفه ل فيروس السعار³⁵. وتمثل إيباجس سوبكومبارتمينت داخل الرابطة، فيها مرناً الفيروسية و M2-1 تركيز البروتين، مثل الجيش الملكي النيبالي الجينوم و nucleocapsid بوليميريز، موجودة فقط في بقية IBs¹². تجارب الفيديو مجهرية تكشف أن إيباجس هياكل حيوية جداً نستعرض خصائص السائل (الشكل 9 و 2 فيلم). يمكن اعتبار أنها المقصورات السائلة الناتجة عن سائل المرحلة الانتقالية.

إمكانية التلاعب وراثيا الفيروسات يظل أداة الاختيار دراسة كل الآليات الضرب وحساسيتها للأدوية. علم الوراثة العكسي يمكن أن يعتبر الآن جزءا من تقنيات علم الفيروسات "الكلاسيكية". بيد أنها لا تزال شاقة لبعض الفيروسات، مثل RSV. وهذا السبب في هذا البروتوكول ويصف بالتفصيل الخطوات اللازمة لإنقاذ وتضخيم المؤتلف رسفس بنجاح.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يشكر المؤلفون الدكتور تشين يو من استرا زينيكا R & D بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير الدواء AZD4316. الكتاب ممتنون لمنصة سيماجيس للوصول إلى المجهر أوليمبوس ScanR، الذي كان يدعمه المنح المقدمة من المنطقة القارسة (الصحة واحد خافت). الكتاب الاعتراف بدعم من INSERM وجامعة فرساي ساينتكوينتين.