Method Article
Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.
Der Einsatz von rekombinanten Viren ist entscheidend in der Basis- oder angewandte Virologie geworden. Reverse Genetik ist nachgewiesen worden, werden eine extrem leistungsfähige Technologie, sowohl virale Replikationsmechanismen zu entschlüsseln und zu studieren antivirale Medikamente oder Impfstoffe Entwicklungsplattform vorsehen. Den Bau und die Manipulation von einem reverse genetische System für einen negativ-Strang RNA-Virus wie ein respiratory syncytial Virus (RSV), allerdings bleibt zart und erfordert spezielles Know-how. Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, die als Vorlage für die virale RNA-Replikation und Transkription dient. Unser reverse Genetik-System nutzt eine cDNA-Kopie des RSV lange Belastung Humangenoms (HRSV). Diese cDNA sowie cDNAs Codierung virale Proteine der komplexen Polymerase (L, P, N und M2-1) befinden sich in einzelnen Expressionsvektoren unter T7 Polymerase Steuersequenzen. Die Transfektion dieser Elemente in BSR-T7/5 Zellen, die stabil T7 Polymerase ausdrücken, ermöglicht die zytoplasmatischen Replikation und Transkription der rekombinanten RSV zu gentechnisch veränderten Virionen. Eine neue RSV, die an der Zelloberfläche und in der Kultur Überstand des BSRT7/5 vorliegt, ist versammelt, um menschliche HEp-2 Zellen für virale Verstärkung zu infizieren. Zwei oder drei Runden der Verstärkung sind erforderlich, um virale Bestände mit 1 x 106 bis 1 x 107 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) / mL. Methoden für die optimale Ernte, Einfrieren und Titration der viralen Bestände sind hier ausführlich beschrieben. Wir illustrieren das Protokoll hier vorgestellten durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren bzw. Ausdruck freies grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (RSV-GFP) oder viralen M2-1 mit GFP (RSV-M2-1-GFP) verschmolzen. Wir zeigen, wie mithilfe von RSV-GFP um RSV-Replikation und der RSV-M2-1-GFP viralen Strukturen sowie virale Proteindynamik in lebenden Zellen visualisieren mit Videomikroskopie Techniken zu quantifizieren.
Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit1. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere2Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche nach antivirale Medikamente oder Impfstoffe trotz erheblicher Anstrengungen. Die Quantifizierung der RSV Multiplikation in-vitro-basiert im Allgemeinen auf teure, mühsame und zeitraubende Methoden bestehen vor allem in der Analyse des zytopathischen Effekts durch Plaque-Reduzierung, Mikroskopie, Immunostaining Assays, quantitative (qRT) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Tests zu bestimmen. Viren mit modifizierten Genomen und mit dem Ausdruck Reporter-Gene, wie die Codierung für die GFP, eignen sich eher für solche Vorführungen. Gekoppelt an die Verwendung von automatisierten Platte Leser, machen Reporter-gen tragenden rekombinante Viren diese Assays für Standardisierung und Hochdurchsatz-Zwecke besser geeignet.
RSV ist eine behüllte, nonsegmented negativen Sinne RNA-Virus, das gehört zur Gattung der Pneumoviridae Familie, Ordnung Mononegavirales5 Orthopneumovirus . Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, enthält eine forensisches Region an den 3' und 5' Extremitäten genannt Führer und Anhänger und 10 transkriptionelle Einheiten 11 Proteine codieren. Die Gene sind wie folgt sortiert: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 und M2-2 Proteine kodieren) und L-5 ". Die genomische RNA ist fest Nucleoprotein N. Using Encapsidated genomische RNA als Vorlage verpackt, virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Trichothecene) Transkription und Replikation der viralen RNA zu gewährleisten. Virale Trichothecene besteht aus der großen Protein L trägt die Nukleotid-Polymeraseaktivität schlechthin, seine obligatorische Cofaktor Phosphoprotein P und das M2-1-Protein, das Funktionen wie eine virale Transkription Faktor6. In infizierten Zellen induziert RSV die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen Einschlusskörperchen (IBs) genannt. Morphologisch ähnliche zytoplasmatischen Einschlüssen sind für mehrere Mononegavirales7,8,9,10beobachtet worden. Neuere Untersuchungen zu den Tollwut-Virus, vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und Ebola-Virus RSV hat gezeigt, dass virale RNA-Synthese tritt in IBs, die somit als virale Fabriken8,9,11, angesehen werden kann 12. Virus Fabriken konzentrieren die RNA und virale Proteine für virale RNA-Synthese benötigt und enthalten auch zelluläre Proteine13,14,15,16, 17. IBs weisen eine funktionale Subkompartiment genannt IB-assoziierten Granulat (IBAGs), die sich darauf konzentrieren die neu dazu im Entstehen begriffenen viralen mRNA zusammen mit dem M2-1-Protein. Die genomische RNA und die L, P und N werden in IBAGs nicht erkannt. IBAGs sind kleine dynamische kugelförmigen Strukturen im Inneren IBs, die die Eigenschaften des flüssigen Organellen12aufweisen. Trotz der zentralen Rolle von IBs in virale Vermehrung ist sehr wenig über Natur, interne Struktur, Entstehung und Betrieb dieser viralen Fabriken bekannt.
Der Ausdruck des Genoms des Poliovirus aus einer cDNA aktiviert die Produktion des ersten ansteckende virale Klons in 198118. Für negative einzelsträngigen RNA-Viren fand es nicht bis 1994 die Produktion eines ersten Tollwut-Virus nach Transfektion von Plasmiden in Zellen19 statt. Das erste Plasmid-basierte reverse genetische System für RSV erschien 199520. Reverse Genetik führten zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der Virologie. Die Möglichkeit der Einführung von spezifischen Änderungen in das virale Genom hat kritische Einblicke in die Replikation und Pathogenese von RNA-Viren zur Verfügung gestellt. Diese Technologie hat die Entwicklung von Impfstoffen auch erheblich erleichtert, indem es spezifische Dämpfung durch gezielte Reihe von Modifikationen erlaubt. Genom Änderungen erlauben eine schnelle Quantifizierung der viralen Vermehrung erheblich verbessert die antivirale Screening und Untersuchung von ihrer Wirkungsweise.
Obwohl zuvor beschrieben, bleibt die Erlangung genetisch veränderten RSV zart. Hier zeigen wir ein Protokoll erstelle ich zwei Arten von rekombinanten HRSV, RSV-GFP oder RSV-M2-1-GFP bzw. zum Ausdruck zu bringen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Transfektion Voraussetzungen für die neue rekombinanten Viren, sowie ihre Verstärkung zu viralen Aktien mit hoher Titer, geeignet für reproduzierbare Experimente zu retten. Der Bau der reversen Genetik Vektoren ist per se nicht beschrieben. Wir beschreiben Methoden für die optimale ernten und Einfrieren von viralen Bestände. Die genaueste Methode, infektiöse Viruspartikel zu quantifizieren bleibt Plaque-Assay. Zellen sind infiziert mit seriellen Verdünnungen der analysierten Suspension und inkubiert mit einem Overlay, das verbietet die Verbreitung von freien Viruspartikel im Überstand. Unter solchen Bedingungen wird der Virus nur zusammenhängende Zellen, aus denen eine "Tafel" für jedes erste infektiöse Partikel infizieren. In der konventionellen RSV-Titration-Assay sind Gedenktafeln von Immunostaining aufgedeckt und unter mikroskopischer Beobachtung gezählt. Diese Methode ist teuer und zeitaufwändig. Hier haben wir ein sehr einfaches Protokoll für eine RSV-Plaque-Assay mikrokristalline Cellulose verwenden, die es die Bildung von Plaques, die mit bloßem Auge sichtbar ermöglicht. Wir zeigen, wie RSV-GFP Maßnahme RSV Replikation und damit zum verwendet werden kann die Auswirkungen der antiviralen Medikamenten zu quantifizieren. Kombination von reverse Genetik und live-imaging-Technologie, zeigen wir Ihnen wie RSV-M2-1-GFP ermöglicht es Wissenschaftlern, M2-1 in lebenden Zellen zu visualisieren und die Dynamik der intrazellulären viralen Strukturen wie IBs zu folgen.
1. materielle Vorbereitung
(2) Rettung und erste Passage der rekombinanten Virus
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung, mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.
3. Verstärkung der geretteten Viren
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Verstärkung der geretteten Viren in einem 75 cm2 Kolben. Passen Sie die Flasche auf den benötigten Mengen und die erforderlichen Multiplizität der Infektion (MOI). Tabelle 1 zeigt Bände für verschiedene Fläschchen. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung in einer Klasse II Sicherheitsschrank.
(4) Plakette Titration Assay
(5) die Verwendung von HRSV-GFP rekombinanten Virus Virusreplikation in Zellen mit kleinen interferierende RNA oder Virostatika behandelt zu überwachen
Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Ausnahme von 5.1 und 5.2.5 in einer sterilen Umgebung mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.
6. Charakterisierung der M2-1 Lokalisierung In Vivo mit dem RSV-M2-1-GFP rekombinanten Virus
Hinweis: Führen Sie Schritte 6.1 und 6.2 in einer sterilen Umgebung, mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.
In dieser Arbeit beschrieben, ein detailliertes Protokoll zur Herstellung rekombinanter RSV-Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins (Abbildung 2). Im pRSV-GFP wurde das GFP-gen zwischen dem P und M gen eingeführt, wie für die Kirsche gen zuvor veröffentlichte Arbeit21beschrieben. In pRSV-M2-1-GFP das M2-gen war unangetastet gelassen und ein zusätzliches Gen Kodierung für M2-1-GFP zwischen SH und G Gene12eingefügt wurde. Der erste Schritt zur Rettung des Virus in BSRT7/5 Zellen, entsprechend ist in Abbildung 2Adargestellt. Kleine Gruppen von grün fluoreszierenden Zellen waren sichtbar 72 h Posttransfection in Brunnen, RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP Rettung entspricht. Das Fluoreszenzsignal konnte im Zytoplasma und Zellkerne im RSV-GFP-infizierten Zellen, entspricht des Ausdrucks der freien GLP beobachtet werden. Im Gegensatz dazu konnte bei der RSV-M2-1-GFP-Rettung, fluoreszierende zytoplasmatischen Pünktchen beobachtet werden, M2-1-GFP Akkumulation in IBs entspricht. In der Regel wird bei diesem Schritt keine CPE (Syncytia, freistehende Zellen) beobachtet. Umgekehrt, während im zweiten Schritt entsprechend Virus Verstärkung (erster Durchgang) auf HEp-2 Zellen, CPE war sichtbar in infizierten Zellen bei 72 h p.i. (Abb. 2 b). Abbildung 3A B zeigt die starke CPE der RSV-Infektion zeichnet sich durch große Syncytia, freistehend oder nicht, und viele Einzelfeldern. Syncytia und Zellen ausgestellt hell grün fluoreszieren. Abbildung 3A zeigt die Entwicklung des zytopathischen Effekts zwischen 24 und 72 h p.i. in Zellen mit dem RSV-M2-1-GFP-Virus infiziert. Ein paar vereinzelte fluoreszierende Zellen waren sichtbar bei 24 h p.i. ohne eine nachweisbare CPE. Kleine Syncytia (Cluster von fluoreszierenden Zellen) und ein paar freistehende Zellen/Syncytia begann, bei 48 h p.i. große fluoreszierende Syncytia erscheinen und schwimmende Zellen waren deutlich sichtbar bei 72 h p.i.
Bilder von Plaque Titration Assay und virale Titer entspricht den gesamten Prozess der RSV-Produktion sind in Abbildung 5dargestellt. Durchführung der Plaque-Assay auf die negativ-Kontrolle, mit nur den Ausdruck Plasmiden von M2-1, N, P und L transfiziert ergab keine Gedenktafel an die niedrigsten Verdünnung. Die Titer der transfizierten Zellen entnommen wurden voraussichtlich über 100 PFU/mL liegen, wenn die Rettung effizient, war wie in Abbildung 5dargestellt. Dann erhöht die Titer über die Passagen zu 106– 107 PFU/mL in der Passage 1 oder 2 zu erreichen. Beachten Sie, dass die virale Titer zwischen beiden rekombinanten Viren ähnelten.
Zellen wurden mit SiRNA, die Ausrichtung auf die mRNA ein virales Protein (N) oder zwei zelluläre Proteine (Inosin-5'-Monophosphate-Dehydrogenase [IMPDH] und Glyceraldehyde-3'-Phosphat-Dehydrogenase [GAPDH]) transfiziert. Zellen wurden auch mit nontargeting SiRNA transfiziert. Abbildung 6 zeigt die Überwachung der RSV Multiplikation mit RSV-GFP Virus auf SiRNA-behandelten Zellen. Ein starkes Signal der GFP wurde (Abb. 6A) beobachtet und gemessen (Abb. 6 b) auf Kontrollzellen transfiziert mit nontargeting SiRNA oder Zellen mit SiRNA gegen GAPDH mRNA transfiziert. Im Gegensatz dazu wurde die GFP Expression in infizierten Zellen, die mit dem Ausdruck SiRNA Ausrichtung auf N oder IMPDH verringert. Beachten Sie, dass wir überprüft, dass die GFP Fluoreszenzsignal in RSV-GFP-infizierten Zellen bei 48h p.i. mit der viralen Dosis wie zuvor für eine ähnliche rekombinante RSV mit dem Ausdruck Cherry (RSV-Kirsche)21korreliert war. Zur Beurteilung der Effizienz der Droge auf RSV Multiplikation, infiziert waren HEp-2 Zellen mit RSV-GLP für 48 h in Anwesenheit von verschiedenen Drogen-Konzentrationen. Wir beobachten eine starke Abnahme der GFP-Signal, das die Geräuschkulisse erreicht (es war ein Signal auf nicht infizierten Zellen beobachtet), in der Gegenwart eine höhere Wirkstoffkonzentration, wie in Abbildung 7dargestellt. Die beobachteten IC50 für AZD4316 war ca. 4 nM, ähnlich wie die veröffentlichten EC50 von etwa 2 bis 40 nM gegen verschiedene HRSV Stämme23. Die Analyse der Dynamik von IBs und IBAGs in lebenden Zellen, dank RSV-M2-1-GFP werden in Abbildung 8 und Abbildung 9 (und Film 1 und Film 2) angezeigt. IBs werden als mobile kugelförmigen Strukturen in der Lage, zu verschmelzen, bilden eine größeren kugelförmigen Aufnahme angezeigt. IBAGs sind sehr dynamisch. Sie durchlaufen kontinuierliche Montage-Demontage-Zyklen mit der Bildung von kleinen IBAGs, die wachsen, Sicherung in großen IBAGs, und dann verschwinden.
Platte oder Kolben | HEp-2 Zellen, die am Vortag ausgesät werden | Mittleres Volumen (mL) | Virus Inokulum Volumen (mL) |
150 cm2 Kolben | 15 x 106 | 30 | 5 |
75 cm2 Kolben | 7,5 x 106 | 15 | 3 |
25 cm2 Kolben | 2.5 x 106 | 5 | 1 |
6-Well-Platte | 1 x 106 | 2 | 0,5 |
Tabelle 1: Die Anzahl der Zellen und Inokulum Volumen in verschiedenen Flaschen verwenden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Rettungs- und Verstärkung Schritte. Transfektion des Expressionsvektors N, P, L, M2-1 und RSV antigenomic RNA in BSRT5/7 Zellen (Rescue). Ausdruck von antigenomic RSV-RNA und die mRNA des M2-1, N, P und L durch die T7-RNA-Polymerase. Die M2-1, N, P und L Proteine zu replizieren und transkribieren die genomische RNA, initiieren einen virale Vermehrung-Zyklus. Neue Viruspartikel entstehen und sich vermehren, geben Anlass zu der P0. Das Virus von der Rettung (P0) geerntet wird dann verstärkt auf HEp-2 Zellen eine höhere Titer virale Suspension (P1) produzieren (Amplifikation). Dies wird dann verstärkt, um virale Bestände zu erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: CPE und das Muster der Fluoreszenz beobachtet während der Rettung von RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 Zellen mit der reversen Genetik Vektoren transfiziert wurden, wie angegeben, und Phasenkontrast- und Fluoreszenz Bilder wurden bei 72 h posttransfection. Die negative-Kontrolle (Neg Ctrl) entspricht mit Expressionsvektoren von M2-1, N, P und L ohne die reverse genetische Vektor transfected Zellen. (B) HEp-2 Zellen waren infiziert mit dem Virus aus den transfizierten Zellen BSRT5/7 (die Null Passage, 72 h Posttransfection) geerntet und Bilder wurden 72 h postinfection. Die gezeigten Bilder sind von repräsentativen Bereichen; Maßstabsleiste = 100 µm. Die Box Bereich umschließt Zellen in Vergrößerung gezeigt; Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Entwicklung der CPE und die Fluoreszenz beobachtet, während die Verstärkung der rekombinanten RSV. HEp-2 Zellen wurden bei einer MOI von 0,01 PFU/Zellen 72 h mit den ersten Durchgang von (A) RSV-M2-1-GFP oder (B) RSV-GFP infiziert. Phasenkontrast- und Fluoreszenz Bilder wurden bei 24 h, 48 h und 72 h postinfection. Die gezeigten Bilder sind von einer repräsentativen Bereich; Maßstabsleiste = 100 µm. Die Box Bereich umschließt Zellen in Vergrößerung gezeigt; Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ermittlung der RSV-Titer mit dem Plaque-Assay. (A) Ergebnisse des Plaque Titration Assays in einem 12-Well-Platte. Die sechs Brunnen mit seriellen Verdünnungen von einem viralen bestand infiziert werden angezeigt. Verdünnungen sind in einem Logarithmus Basis 10 angegeben. Mit den drei ersten Verdünnungen infizierte Zellen sind alle freistehend. Die Plakette Zahlen beobachtet mit den 10-410-5, und 10-6 Verdünnungen im Einklang stehen. (B) Darstellung der Plaque-Enumeration (gelbe Zahlen). Der grüne Stern zeigt Kratzer auf der Zellschicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Titration eines geretteten und verstärkte Virus. Plaque Phänotypen der RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP an den verschiedenen Stellen untersucht auf HEp-2 Zellen in einem 12-Well-Platte (die Bilder zeigen die Gesamtheit der Brunnen). Die Titer der nachfolgenden Passagen sind in der Tabelle dargestellt. Repräsentative Daten werden angezeigt. Verdünnungen der viralen Bestände sind in einem Logarithmus Basis 10 angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Hemmung der RSV-GFP Expression von SiRNA Ausrichtung auf RSV N oder IMPDH. A549 Zellen wurden behandelt mit Steuerung nontargeting SiRNA (NT) (leichte blaue Balken) oder SiRNA targeting GAPDH (blauer Balken), RSV N (orangefarbener Balken) oder IMPDH2 (grüner Balken) für 48 h und dann mit RSV-GFP bei einer MOI von 0,05 PFU/Zelle infiziert. Die grünen Fluoreszenz wurde in 48 h Postinfection gelesen. (A) repräsentative Bilder der RSV-GFP-infizierten Zellen bei 48 h p.i., mit SiRNA behandelt, wie auf den Bildern zu sehen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Daten sind der Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Hemmung der RSV-GFP Multiplikation mit zusammengesetzten AZD4136. HEp-2 Zellen in 96-Well Platten wurden mit RSV-GFP bei einer MOI von 0,05 PFU/Zelle im Beisein von Verdünnungsreihen AZD4316 zusammengesetzte oder Kontrolle DMSO infiziert. Die grünen Fluoreszenz wurde bei 48 h p.i. gelesen, die Daten der Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Analyse der Dynamik des Reizdarmsyndroms durch die Verfolgung des fluoreszierenden Proteins GFP 1 M2 in HEp-2-infizierte Zellen Zeit verfallen Mikroskopie. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min für 5 h mit einem Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Die IBs sind fluoreszierend (grün), weil sie M2-1-GFP Gastgeber und Kerne sind mit Hoechst (blau) gefärbt. Die weißen Pfeile zeigen IBs Fusion unterziehen. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Analyse der Dynamik der IBAGs im RSV-M2-1-GFP-infizierten Zellen durch Zeit verfallen Mikroskopie. Um 18 h p.i. wurden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Das M2-1-GFP-Protein wurde durch grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die weißen Pfeile zeigen IBs eine Verschmelzung von IBAGs unterziehen. Maßstabsleiste = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: In-vivo Analyse der Dynamik des Reizdarmsyndroms im RSV-M2-1-GFP im HEp-2-infizierte Zellen. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min für 5 h mit Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Maßstabsleiste = 10 µm. Der daraus resultierende Film zeigt 7 Bilder/s (fps). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Movie 2: In-vivo Analyse der Dynamik der IBAGs im RSV-M2-1-GFP-infizierten Zellen. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min. 3 h und 40 min mit Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Maßstabsleiste = 2 µm. Der daraus resultierende Film zeigt 4 fps. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Hier präsentieren wir eine Methode zur Rettung des rekombinanten RSV aus fünf Plasmide und ihre Verstärkung. Die Fähigkeit zu manipulieren, das Genom der Viren revolutioniert Virologie-Forschung, um Mutationen zu testen und ein zusätzliches Gen oder ein tagged viral Protein ausdrücken. Der RSV haben wir beschrieben und als ein Beispiel in diesem Artikel ist ein Virus mit dem Ausdruck ein Reportergen, RSV-GLP (unveröffentlicht) und drückt eine M2-1-Protein mit einem GLP-Tag12verschmolzen. RSV-Rettung ist anspruchsvoll und erfordert Übung. Die Transfektion Effizienz ist entscheidend, je nach eine kluge Auswahl des Transfection Reagens und eine vorherige Optimierung des Protokolls Transfektion. Die Verwendung von Zellen, die mit dem Ausdruck der Bakteriophagen T7 Pol ist obligatorisch, da die virale cDNA stromabwärts der T7-Pol-Veranstalter in einem Großteil der reverse genetische Vektor platziert wird. Eine Alternative ist die T7-Pol von einem "Vaccinia" Helfervirus abzugeben. Jedoch die Verwendung von Zellen stabil mit dem Ausdruck der T7-Pol vermeidet die Notwendigkeit der Trennung der beiden Viren und verhindert mögliche Störungen der "Vaccinia" mit der Rettung. Es ist wichtig, den ersten Durchgang der reverse genetische (P0, P1) durchzuführen, ohne zu frieren das Inokulum um maximale Rettung Effizienz zu gewährleisten. Dies bedeutet, dass das Innenministerium nicht kontrolliert wird. Allerdings bleiben bei diesem Schritt die Titer sehr niedrig, was eine niedrige MOI für den ersten Durchgang. Um RSV Aktien mit hohen infektiöse Titer (106– 107 PFU/mL) zu erhalten, ist es wichtig zu warten, bis eine starke CPE und kratzen Sie die Zellen, um die virale Partikel angebracht zu den Zellen zu sammeln. In dieser Studie erhöhte Titer nicht nach 96 h p.i. Die schnelle Abkühlung der viralen Suspension ist wichtig, hohe Titer zu erhalten. Stattdessen kann der durch ein Eintauchen in Alkohol bei-80 ° C vorgekühlt dies auch durch Eintauchen in eine Trockeneis/Ethanol-Mischung oder in flüssigem Stickstoff erreicht werden. Die Zugabe der Erhaltung-Lösung gewährleistet eine längere Stabilität der Virus Suspension bei-80 ° C. Die Lagerung bei-80 ° C ist kritisch, da das Virus schnell Verlust wird seine Infektiosität bei-20 ° c oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Wir beschrieben die RSV Verstärkung auf HEp-2 Zellen, die die beliebtesten Zellinie RSV wachsen, aber es ist auch in der Lage, effizient auf zahlreichen anderen Zelllinien in vitro wachsen. Beachten Sie jedoch, dass eine Veränderung in G Ausdruck24Wachstum auf Vero-Zellen führen kann.
Wir beschrieben ein sehr einfaches Protokoll der Plaque Titration der RSV eine mikrokristalline Cellulose verwenden. Alle Titration Assays ist empfindlich gegenüber Verunreinigungen mit hoher Titer Suspensionen, erfordern sorgfältige Manipulation. Konventionelle RSV Titration Assays verwenden Agarose oder Carboxymethylcellulose (CMC) Zellulose-Overlays und erfordern Immunostaining und mikroskopische Beobachtungen für die Titer-Bestimmung. Ermöglicht die direkte Visualisierung von Plaques ohne Immunostaining25ist ein Protokoll mit Immunodiffusion Klasse Agarose beschrieben worden. HEp-2 Zellen sind jedoch sehr empfindlich auf eine beheizte Agar-Overlay, die dieses Protokoll verwenden Sie für mehrere Virus Titrationen erschwert (z. B. eine zu heiße-Overlay zerstört die Zellschicht); auf der anderen Seite, wenn es nicht heiß genug ist, erstarrt es nach der ersten Platte-Verteilung. Die Verwendung von mikrokristalline Cellulose für einen Plaque-Assay wurde zuerst von Matrosovich Et Al. für eine Influenza-A-Virus Titration Assay26beschrieben. Dank seiner niedrigen Viskosität ist die mikrokristalline Cellulose Überlagerung leicht zu verzichten und von Platte Brunnen, so dass es kompatibel mit 96-Well Platten zu entfernen. Es ist daher besonders anpassungsfähig an serologischen Studien und Droge Sensitivitätsanalysen. Beachten Sie, dass die Medikamente da mikrokristalline Cellulose nicht beheizt werden muss, leicht in der Überlagerung integriert werden können. Es ist jedoch wichtig, dass die Platten ganz still während der Inkubation bleiben; Andernfalls werden große Komet-förmigen Brennpunkte statt Runde Plaketten bilden. Plaque-Offenbarung mit Kristallviolett ist billig und einfach, aber diese Lösung ist giftig und muss ordnungsgemäß entsorgt werden. Das recycling der Lösung schränkt Abfallproduktion. Darüber hinaus ist diese Methode für Monolage Zellschäden, die als falsche weiße Flecken erscheinen würde, die nicht virale Plaques sind empfindlich. Ein Beispiel ist in Abbildung 4 (grüner Stern) dargestellt. Um diese Verzerrung zu vermeiden, 1) Zellen mit Vorsicht zu vermeiden, kratzen oder Spülung der Zelle Monolage, 2) streben zu handhaben und Verzicht auf immer an der gleichen Stelle zu umschreiben, die Schäden an einem bekannten Bereich gemacht haben, und (3) falsche weiße Flecken identifiziert werden kann Dank ihrer Form (nicht sphärisch), deren scharfen Kanten und ihre Position. Wir haben zuerst Avicel RC 581, als zuvor veröffentlichten21,26. Jedoch die RC-581 ist nicht mehr verfügbar, und wir erfolgreich durch RC 591 ersetzt. Dieser Assay an andere Zelle/Virus-Paare anzupassen, hat die Konzentration von mikrokristalline Zellulose abhängig von dem Virus und die Zellen ermittelt werden. Zuviel mikrokristalline Cellulose kann giftig für Zellen und führen zu kleinen Plaketten, zu wenig führt zur Verbreitung des Virus in das Medium.
Wir beschrieben zwei Anwendungsbeispiele des RSV-GFP Virus RSV Multiplikation zu überwachen: in der Gegenwart eine antivirale Medikament oder wenn eine zelluläre Protein zum Schweigen zu bringen. Wir zeigten, dass das GFP-Signal mit virale Vermehrung korreliert ist. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die mühelose Evaluierung der virale Vermehrung in Echtzeit. Es kann Wissenschaftler die IC50 eine antivirale Medikament leicht zu bestimmen, wie in Abbildung 7dargestellt. Wichtig ist, ist dieses Maß anpassungsfähig für den Einsatz in Medium oder Breitband, vor allem für das Screening von chemischen Bibliotheken. Dieser Reporter exprimierenden Virus kann auch zur Beurteilung der Wirkung auf Virus Multiplikation einer Modulation der zellulären Proteinexpression nützlich. RNA-Interferenz ist ein biologischer Prozess, wobei eine spezifische mRNA im Anschluss an seine besondere Anerkennung durch SiRNA, abgebaut wird, wodurch oder, im Idealfall, Abschaffung des Ausdrucks des entsprechenden Proteins27. In dem Beispiel hier, durch die Überwachung der GFP Signalintensität im RSV-GFP-infizierten Zellen untersuchten wir die Auswirkungen von das Schweigen der virale Nukleokapsid (N) mRNA oder dem Host IMPDH mRNA auf RSV Multiplikation. IMPDH2 ist ein Purin biosynthetischen Enzym, das einen Bandbreitenbegrenzung Schritt in Richtung der de-Novo-Biosynthese von Guanin Nukleotide aus IMP28katalysiert. Es ist also ein Regulator der intrazellulären Guanin-Nukleotid-Pool. IMPDH-Inhibitoren, wie z. B. Ribavirin, üben hemmende Wirkungen auf RNA-Viren, einschließlich der RSV-Infektion29,30,31. Wie in Abbildung 6dargestellt, beeinträchtigt die Hemmung der IMPDH Ausdruck virale Vermehrung, wie durch die Reduktion des GFP-Signals, imitiert die Wirkung von Ribavirin auf RSV Wachstum gekennzeichnet. Ebenso wird die virale Vermehrung im Beisein von SiRNA Ausrichtung auf das virale Protein N fast abgeschafft. Dieses Ergebnis wurde erwartet, da SiRNA Ausrichtung des N-Proteins erwartet wurde, dass virale Nukleokapsid Versammlung zu verhindern und erweist sich als virale Replikation32stark beeinträchtigen. Die Verwaltung dieser SiRNA durch Vernebelung gehemmt, die nachfolgende Infektion durch RSV in gesunden Erwachsenen33. Die Wirkung von N oder IMPDH SiRNA ist seit der Hemmung des Ausdrucks GAPDH, gewählt als Kontrolle gen spezifisch, virale Multiplikation im Vergleich zu den nontargeting SiRNA nicht beeinträchtigt. Beachten Sie, dass keine Zelle Toxizität unter allen Bedingungen erkannt wurde. Zusammengenommen, bestätigen diese Ergebnisse die Strategie hier vorgestellten, die zum Hochdurchsatz-screening mit SiRNA-Bibliotheken oder andere Ko-Methoden, wie z. B. CRISPR-Cas9 Technologie34vergrößert werden konnte.
Rekombinante Viren, die mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Fusionsprotein repräsentieren leistungsfähige Werkzeuge, virale Proteine und viralen Strukturen Dynamik zu studieren. RSV mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins M2-1 ermöglicht die Beobachtung der Dynamik von IBs und IBAGs. IBs, die als RSV virale Fabriken angesehen werden können, erscheinen als kugelförmige dynamische Strukturen. Sie sind in der Lage, miteinander zu verschmelzen, zu größeren kugelförmigen Strukturen (Abb. 8 und Film 1). Diese Daten deuten darauf hin, dass RSV IBs sind flüssige Organellen, ähnlich wie was für Tollwut-Virus35beschrieben ist. IBAGs repräsentieren eine Subkompartiment innen IBs, in der viralen mRNA und M2-1 Proteinkonzentrat, wie der genomischen RNA, das Nukleokapsid und die Polymerase sind nur in den Rest der IBs-12. Videomikroskopie Experimente zeigen, dass IBAGs sehr dynamische Strukturen, die Flüssigkeit Eigenschaften (Abbildung 9 und Movie 2) ausstellen. Sie können als flüssige Fächer durch flüssig-flüssig Phasenübergangs betrachtet werden.
Es bleibt die Möglichkeit genetisch manipulieren, Viren ein Werkzeug der Wahl, sowohl die Mechanismen der ihre Vermehrung und ihre Empfindlichkeit gegenüber Drogen zu studieren. Reverse Genetik könnte nun als Teil der "klassischen" Techniken der Virologie. Es bleibt jedoch für einige Viren, wie RSV anstrengend. Daher ist dieses Protokoll im Detail beschreibt die Schritte erfolgreich zu retten und rekombinanten RSV zu verstärken.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Die Autoren danken Dr. Qin Yu von AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, für die Bereitstellung der AZD4316 Droge. Die Autoren sind dankbar für die Cymages-Plattform für den Zugriff auf die ScanR Olympus Mikroskop, das durch unterstützt wurde aus der Region Ile-de-France (DIM eine Gesundheit) gewährt. Die Autoren erkennen Unterstützung von INSERM und der Universität Versailles Saint-Quentin.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
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