Method Article
אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.
השימוש של וירוסים רקומביננטי הפך מכריע וירולוגיה בסיסי או מוחלת. גנטיקה הפוכה הוכח להיות טכנולוגיה רבת עוצמה, הן כדי לפענח את שכפול ויראלי מנגנונים כדי ללמוד antivirals או לספק פלטפורמת פיתוח חיסונים. הבנייה ואת מניפולציה של מערכת גנטית הפוך שלילי-בשרך וירוס רנ א כגון וירוס syncytial במערכת הנשימה (RSV), עם זאת, נותר עדין ודורש ידע מיוחד. הגנום RSV הוא RNA חד גדילי חוטים, שלילי-תחושה של בערך 15 kb המשמש כתבנית עבור נגיפי RNA שכפול והן שעתוק. מערכת הפוכה הגנטיקה שלנו משתמש עותק cDNA של הגנום הארוך זן RSV האנושי (HRSV). CDNA הזה, כמו גם cDNAs קידוד חלבונים ויראלי של פולימראז מורכבות (L, P, N, M2-1), מוצבים ביטוי בודדים וקטורים תחת רצפי בקרה פולימראז T7. תרביות תאים של רכיבים אלה בסר-T7/5 תאים, אשר stably אקספרס T7 פולימראז, מאפשר שכפול cytoplasmic שעתוק של RSV רקומביננטי, והוליד virions מהונדסים. RSV חדש, אשר קיים על פני התא, את תגובת שיקוע של התרבות של BSRT7/5, נאסף להדביק תאים אנושיים HEp-2 עבור נגיפים. שניים או שלושה סיבובים של הגברה נדרשים לרכוש מניות נגיפית המכילה 1 x 106 עונה 1 פרק 107 ויוצרים רובד יחידות (PFU) / mL. שיטות האופטימלי קציר, הקפאה, ו טיטור של מניות ויראלי מתוארים כאן בפירוט. אנחנו המחשת פרוטוקול המובאת כאן על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לבטא חינם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (RSV-GFP) או ויראלי M2-1 דבוקה GFP (RSV-M2-1-GFP). אנו מראים כיצד להשתמש RSV-GFP כדי לכמת את RSV-M2-1-GFP להמחיש מבנים ויראלי, כמו גם חלבון נגיפי דינאמיקה של תאים חיים, באמצעות טכניקות במיקרוסקופ וידאו ושכפול RSV.
האדם RSV הוא הגורם המוביל של אשפוז לדלקת חריפה בדרכי הנשימה תינוקות ברחבי העולם1. בנוסף, RSV משויכת נטל משמעותי במחלה אצל מבוגרים להשוות שפעת, עם רוב אשפוז, התמותה נטל הקשישים2. אין חיסונים או antivirals ספציפיים זמינים עדיין נגד RSV, אבל מבטיח תרופות חדשות הן פיתוח3,4. את המורכבות ואת הכובד של הטכניקות של כימות של כפל RSV לעכב את החיפוש אחר antivirals או חיסונים למרות מאמצים ניכרים הנוכחי. כימות של RSV כפל במבחנה בדרך כלל מבוסס על שיטות מפרך, גוזלת זמן, יקר, אשר מורכב בעיקר בניתוח אפקט ציטופתי על ידי מיקרוסקופ, immunostaining, הפחתת פלאק מבחני, כמותי רוורס טרנסקריפטאז (לרביעיית)-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), והוא מקושר-אנזים immunosorbent assay בדיקות. וירוסים עם הגנום ששונה ולבטא גנים הכתב, כגון אלה קידוד ה-GFP, מתאימים יותר עבור הקרנות כאלה. מצמידים בשימוש בקוראי צלחת אוטומטיות, נושא גן וירוסים רקומביננטי כתב יכול לעשות מבחני אלה מתאימים יותר למטרות התקינה ו תפוקה גבוהה.
RSV הוא מעטפת, nonsegmented שלילי-סנס וירוס רנ א שייך הסוג של Orthopneumovirus של Pneumoviridae משפחה, סדר Mononegavirales5. הגנום RSV הוא RNA חד גדילי חוטים, שלילי-תחושה של בערך 15 kb, אשר מכיל את אזור noncoding ב הגפיים 3' ו 5' שנקרא מנהיג, הקרוואן, 10 יחידות תעתיק קידוד חלבונים 11. הגנים מסודרים כדלקמן: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (קידוד חלבונים M2-1 ו- M2-2), L-5'. ה-RNA הגנומי נארז בחוזקה על ידי נוקלאופרוטאין שימוש ש RNA הגנומי encapsidated כתבנית, תלויי-RNA נגיפי RNA פולימראז (RdRp) יבטיח שעתוק ושכפול של RNA נגיפי. RdRp ויראלי מורכב של החלבון גדולה L אשר נושאת את פעילות נוקלאוטיד פולימראז כשלעצמה, שלה קופקטור חובה phosphoprotein P והחלבון M2-1, אשר מתפקד בתור תעתיק ויראלי גורם6. תאים נגועים, RSV גורם להיווצרות של הכללות cytoplasmic נקרא הכללה גופים (IBs). תכלילים cytoplasmic מורפולוגית דומים נצפו9,8,7, Mononegaviralesמספר10. מחקרים שנעשו לאחרונה על נגיף הכלבת, vesicular stomatitis וירוס (VSV), אבולה וירוס RSV הראה כי סינתזה RNA נגיפי מתרחשת ב- IBs, אשר יכול להיחשב ובכך מפעלים ויראלי8,9,11, 12. המפעלים וירוס להתרכז RNA וחלבונים ויראלי נדרש סינתזה RNA נגיפי, מכילים גם חלבונים הסלולרית13,14,15,16, 17. IBs התערוכה של subcompartment תפקודית שנקרא בגרגרים הקשורים ליברות (IBAGs), אשר רכזו החדש synthetized המתהווה mRNA הנגיפי יחד עם החלבון M2-1. RNA הגנומי של L, P, ואת N לא מזוהים ב- IBAGs. IBAGs הם מבנים כדוריים דינמי קטן בתוך המעי הרגיז כי התערוכה את המאפיינים של organelles נוזלי12. למרות התפקיד המרכזי של IBs בכפל נגיפית, מעט מאוד ידוע על הטבע, המבנה הפנימי, היווצרות, הפעולה של המפעלים האלה ויראלי.
הביטוי של הגנום של poliovirus מ cDNA אפשרה הייצור של השיבוט ויראלי זיהומיות הראשון בשנת 198118. חד-גדילי RNA שלילי וירוסים, זה לא היה עד 1994 הייצור של וירוס הכלבת הראשון בעקבות תקנים של פלסמידים לתוך תאים19 התרחש. מבוסס על פלסמיד הפוכה גנטי המערכת הראשונה עבור RSV פורסם בשנת 199520. גנטיקה הפוכה הובילו התקדמות גדולה בתחום של וירולוגיה. האפשרות של הצגת שינויים ספציפיים לתוך הגנום הנגיפי סיפקה קריטי תובנות שכפול ועל בפתוגנזה של וירוסי RNA. טכנולוגיה זו הנחתה במידה רבה גם את ההתפתחות של חיסונים בכך שהוא מאפשר הנחתה ספציפי באמצעות סדרת יישוב של שינויים. שינויים הגנום ומאפשר כימות מהירה של כפל נגיפית במידה רבה משופרים את ההקרנה אנטי ויראליים, חקר את מצב הפעולה.
למרות שתואר קודם לכן, קבלת RSVs מהונדסים נשאר עדין. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול כדי ליצור שני סוגים של HRSV רקומביננטי, בהתאמה לבטא RSV-GFP או RSV-M2-1-GFP. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התנאים תרביות תאים הנחוצים כדי להציל רקומביננטי וירוסים חדשים, כמו גם הגברה שלהם כדי לקבל מניות ויראלי עם כייל נוגדנים גבוה, מתאים experimentations לשחזור. הבנייה של וקטורים של הגנטיקה הפוכה כשלעצמה לא מתואר כאן. אנו מתארים שיטות קציר אופטימלית, הקפאה של מניות ויראלי. השיטה המדויקת ביותר לכמת נגיפים זיהומיות נשאר פלאק וזמינותו. תאים נגועים דילולים טורי של ההשעיה שנותחה, מודגרות עם כיסוי האוסרת פעפוע של חלקיקים נגיפיים חינם ב- תגובת שיקוע. בתנאים כאלה, רק ידביק הווירוס תאים רציפים ויוצרים "שלט" עבור כל חלקיק זיהומיות הראשונית. ב RSV טיטור וזמינותו קונבנציונאלי, שלטי התגלה על ידי immunostaining, ספרתי בהסתכלות מיקרוסקופית. שיטה זו היא יקרים ולגזול. כאן אנחנו תיאר פרוטוקול פשוט מאוד עבור assay רובד RSV באמצעות כיסוי שעוות תאית המאפשרת היווצרות הפלאק גלוי לעין בלתי מזוינת. אנחנו מראים כיצד ניתן להשתמש RSV-GFP כדי למדוד RSV שכפול וכדי, לפיכך, לכמת את ההשפעה בשווי. שילוב של גנטיקה הפוכה וטכנולוגיה הדמיה בשידור חי, נדגים כיצד RSV-M2-1-GFP מאפשרות למדענים להמחיש M2-1 בתאים חיים, לעקוב אחר הדינמיקה של מבנים תאיים ויראלי, כגון תסמונת המעי הרגיז.
1. הכנה גשמי
2. הצלה ומעבר הראשון של וירוס רקומביננטי
הערה: בצע את כל השלבים הבאים בסביבה סטרילית, באמצעות מחלקה II בטיחות ארון.
3. הגברה של וירוסים שהוצלה
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר ההגברה של וירוסים שניצלו בבקבוקון2 75 ס מ. להתאים את גודל הבקבוק לאמצעי האחסון הדרוש ואת הריבוי הנדרש של זיהום (MOI). טבלה 1 מציין אמצעי אחסון עבור מבחנות שונות. בצע את כל השלבים הבאים בסביבה סטרילית בכיתה II בטיחות הקבינט.
4. פלאק טיטור Assay
5. השימוש של וירוס רקומביננטי HRSV-GFP כדי לפקח על שכפול ויראלי תאים שטופלו RNA מפריעות קטן או עלולות
הערה: בצע שלבים כל פרט 5.1 ו- 5.2.5 בסביבה סטרילית באמצעות מחלקה II בטיחות בארון.
6. אפיון לוקליזציה M2-1 In Vivo עם וירוס רקומביננטי RSV-M2-1-GFP
הערה: בצע שלבים 6.1 ו- 6.2 בסביבה סטרילית, באמצעות מחלקה II בטיחות בארון.
בעבודה זו, אנו המתואר פרוטוקול מפורט כדי לייצר וירוסים RSV רקומביננטי ביטוי חלבון פלואורסצנטי (איור 2). ב- pRSV-GFP, גן ה-GFP הוצג בין הגנים P ו- M, כמתואר עבור הגן שרי העבודה שפורסמו בעבר21. PRSV-M2-1-GFP, הגן M2 והמבריא שהוגש, קידוד גנטי נוסף M2-1-GFP הוכנס בין הגנים של SH ו- G-12. השלב הראשון, המתאים להצלה של הוירוס בתאים BSRT7/5, מוצג באיור 2A. בקבוצות קטנות של תאים ניאון ירוק היו גלויים 72 h posttransfection בבארות המתאים הצלה RSV-GFP ו- RSV-M2-1-GFP. יכול להיות שנצפו האות פלורסנט הציטופלסמה והן גרעינים ב RSV GFP-תאים הנגועים, המתאימים לביטוי של ה-GFP חינם. לעומת זאת, במשימת החילוץ RSV-M2-1-GFP, נקודות cytoplasmic פלורסנט קטנות יכול להיות שנצפו, המתאים הצטברות M2-1-GFP ב IBs. בדרך כלל אין CPE (syncytia, תאים מנותקת) הוא ציין בשלב זה. לעומת זאת, במהלך השלב השני, המתייחס וירוס הגברה (המעבר קודם) על HEp-2 תאים CPE היה גלוי תאים נגועים ב- 72 h חוקר פרטי (איור 2B). איור 3 א B מציג את CPE חזקה של הזיהום RSV, מאופיין syncytia גדולים, מנותק או לא, ותאים צפים רבים. Syncytia ותאים הציג פלורסצנטיות ירוק בהיר. איור 3 א מציג את התפתחות אפקט ציטופתי בין 24 ל-72 h חוקר פרטי בתאים נגועים בנגיף RSV-M2-1-GFP. כמה תאים פלורסנט פזורים היו גלויים-חוקר פרטי 24 שעות ביממה בלי CPE לזיהוי. Syncytia קטן (מקבץ של תאים פלורסנט) כמה מנותק תאים/syncytia החלו להופיע ב 48 שעות עבודות שירות פלורסנט syncytia גדול, תאים צף נראו בבירור על 72 h חוקר פרטי
תמונות של פלאק טיטור assay, נגיפי titers המייצגים כל התהליך של הפקת RSV מוצגים באיור5. ביצוע וזמינותו פלאק על הפקד שלילי, transfected עם רק הביטוי פלסמידים של N, P, L ו- M2-1, חשף אין רובד-דילול הנמוך. Titers המתקבל התאים transfected היו אמורים להיות מעל 100 PFU/mL אם החילוץ היה יעיל, כמוצג באיור5. . אז, titers גברה על המעברים, להגיע 106–107 PFU/mL-קטע 1 או 2. שימו לב כי titers ויראלי היו דומות בין שני וירוסים רקומביננטי.
התאים היו transfected עם siRNA פילוח של ה-mRNA של חלבון נגיפי (N) או של שני חלבונים הסלולר (inosine-5'-monophosphate דהידרוגנאז [IMPDH] ו גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז [GAPDH]). התאים היו גם transfected עם nontargeting siRNA. איור 6 מראה את הפיקוח על כפל RSV באמצעות וירוס RSV-GFP על תאים שטופלו siRNA. אות GFP חזק נצפתה (איור 6A) נמדד (איור 6B) על תאים שליטה transfected עם nontargeting siRNA או תאים transfected עם siRNA נגד GAPDH mRNA. לעומת זאת, הביטוי GFP ירדו תאים נגועים לבטא siRNA מיקוד N או IMPDH. שימו לב כי אנחנו אומת כי האות פלורסנט GFP ב RSV GFP-תאים הנגועים ב 48 שעות חוקר פרטי היה בקורלציה עם המינון ויראלי כפי שהוכח בעבר עבור RSV רקומביננטי דומה לבטא דובדבן (RSV-שרי)21. כדי להעריך את יעילות התרופה על כפל RSV, HEp-2 תאים נדבקו בנגיף ה-RSV-GFP במשך 48 שעות בנוכחות ריכוזים סמים שונים. ראינו ירידה חזקה של האות ה-GFP, אשר הגיע רעשי הרקע (היה שם אות שנצפו בתאי נגוע), בנוכחות ריכוז התרופה מוגברת, כפי שמוצג באיור 7. IC50 נצפתה עבור AZD4316 היה כ 4 nM, הדומה EC50 המפורסמים של בערך 2-40 ננומטר נגד זנים שונים של HRSV23. הניתוח של הדינמיקה של IBs ו IBAGs בתאים חיים, הודות RSV-M2-1-GFP, מוצגים באיור 8 , איור 9 (ו סרט 1 ו 2 סרט). IBs מופיעים מבנים כדוריים ניידים מסוגל להתמזג, ויוצרים של הכללה כדורית גדול יותר. IBAGs הם מאוד דינמי. הם עוברים הרכבה רציפה-פירוק מחזורים עם היווצרות של IBAGs קטן לגדול, הפתיל לתוך IBAGs גדולים, ונעלמים.
צלחת או את הבקבוק. | HEp-2 תאים כדי להיות נזרע יום לפני | נפח בינוני (mL) | וירוס Inoculum נפח (mL) |
150 ס"מ2 הבקבוק | 15 x 106 | 30 | 5 |
הבקבוק2 75 ס מ | 7.5 x 106 | 15 | 3 |
הבקבוק2 25 ס מ | 2.5 x 106 | 5 | 1 |
לוח 6-ובכן | עונה 1 פרק 106 | 2 | 0.5 |
טבלה 1: מספר תאים ונפח inoculum להשתמש במבחנות שונות.
איור 1: ייצוג סכמטי של השלבים הצלה, הגברה. תרביות תאים של הביטוי וקטור של N, P, L, M2-1, ו- RSV antigenomic RNA לתאים BSRT5/7 (חילוץ). ביטוי של RNA RSV antigenomic, את ה-mRNA של N, P, L ו- M2-1, על ידי T7 RNA פולימראז. החלבונים N, P, L ו- M2-1 לשכפל ו לתמלל את הרנ א גנומי, ייזום מחזור כפל נגיפית. חלקיקי נגיף חדשים המיוצרים ולהתרבות, נותן לעורר P0. הווירוס שנקטפו החילוץ (P0) ואז מוגבר בתאי HEp-2 כדי לייצר גבוה כייל נוגדנים ויראלי השעיה (P1) (הגברה). ואז זה מועצם לרכוש מניות ויראלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: CPE והתבנית של קרינה פלואורסצנטית ציין במהלך החילוץ של RSV-GFP ו- RSV-M2-1-GFP. (א) BSRT5/7 תאים היו transfected עם וקטורים של הגנטיקה הפוך כמצוין, תמונות חדות שלב עם פלורסצנטיות נלקחו 72 h posttransfection. הפקד שלילי (Neg Ctrl) מקביל תאים transfected עם הווקטורים ביטוי של N, P, L ו- M2-1 ללא הווקטור גנטי הפוכה. (B) HEp-2 תאים נדבקו בוירוס לקצור את התאים BSRT5/7 transfected (אפס המעבר, 72 h posttransfection) ואת התמונות צולמו 72 h postinfection. הדימויים המוצגים הם של נציג שדות; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. האזור מסגרת יקיף תאים שמוצג ההגדלה; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: האבולוציה של CPE, זריחה ציין במהלך ההגברה של RSV רקומביננטי. HEp-2 תאים נדבקו ב MOI 0.01 PFU תאים עבור 72 h עם חלוף הראשון (A) RSV-M2-1-GFP או RSV (B)-GFP. תמונות חדות שלב עם פלורסצנטיות צולמו ב 24 שעות, 48 שעות, ו- 72 h postinfection. הדימויים המוצגים הם של שדה ייצוגית; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. האזור מסגרת יקיף תאים שמוצג ההגדלה; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: קביעת כייל RSV באמצעות וזמינותו פלאק. (א) תוצאות וזמינותו טיטור פלאק בצלחת 12-. טוב. הבארות שישה נגוע דילולים טורית אחת המניות ויראלי של מוצגים. דילולים נקובים בהלוגריתם בסיס 10. תאים נגועים דילולים הראשונה שלושה כל מנותקים. המספרים פלאק נצפתה עם 10-4, 10-5, ו- 10-6 דילולים עקביים. (B) איור של הספירה פלאק (מספרים צהוב). כוכב ירוק מציין שריטות על שכבת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: טיטור של וירוס שניצלו, מוגבר. פלאק פנוטיפים של RSV-GFP ו- RSV-M2-1-GFP-המעברים שונים לבדיקה על HEp-2 תאים בצלחת 12-טוב (התמונות להראות מכלול הבארות). Titers של המעברים הבאים מוצגים בטבלה. נציג נתונים מוצגים. דילולים של המניות ויראלי הם הצביעו על הלוגריתם בסיס 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: עיכוב של הביטוי RSV-GFP מאת siRNA מיקוד RSV N או IMPDH. A549 תאים שטופלו siRNA nontargeting הבקרה (NT) (פס כחול בהיר) או siRNA מיקוד GAPDH (פס כחול), RSV N (בר תפוזים) או IMPDH2 (ירוק בר) במשך 48 שעות ולאחר מכן נגוע RSV-GFP-MOI של 0.05 PFU תא. ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק היה לקרוא ב 48 שעות postinfection. (א) להחליפן בתמונות של תאים נגועים-RSV-GFP ב 48 שעות עבודות שירות, שטופלו siRNA כפי שניתן לראות על התמונות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתונים (B) האם זאת אומרת ± SD של שני ניסויים עצמאית הופיעה בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: עיכוב של RSV-GFP לכפל תרכובת AZD4136. HEp-2 תאים ב 96-ובכן צלחות נדבקו בנגיף RSV-GFP-MOI 0.05 PFU תא בנוכחות דילולים טורי של AZD4316 תרכובת של או פקד דימתיל סולפוקסיד. ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק היה לקרוא ב 48 שעות עבודות שירות שהנתונים הם הגרמנים זאת אומרת ± של שני ניסויים עצמאית הופיעה בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: ניתוח של הדינמיקה של IBs על ידי מעקב אחר החלבון הניאון M2-1-GFP ב HEp 2-תאים הנגועים מאת זמן לשגות מיקרוסקופ. ב 18 h עבודות שירות, התאים היו צילמו כל 5 דקות במשך 5 שעות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בחדר מחומם ב 37 º C. IBs הן פלורסנט (ירוק) מכיוון שהם מארחים M2-1-GFP, גרעינים מוכתמים Hoechst (כחול). החצים הלבנים מציינים IBs בתהליך היתוך. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: ניתוח של הדינמיקה של IBAGs ב RSV M2-1-GFP-תאים הנגועים מאת זמן לשגות מיקרוסקופ. ב 18 h עבודות שירות, התאים היו עם תמונה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בחדר מחומם ב 37 º C. החלבון M2-1-GFP היה דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק. החצים הלבנים מציינים IBs בתהליך היתוך של IBAGs. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: ניתוח In vivo של הדינמיקה של IBs ב RSV-M2-1-GFP ב HEp 2-תאים הנגועים. ב 18 h עבודות שירות, התאים היו צילמו כל 5 דקות במשך 5 שעות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בחדר מחומם ב 37 º C. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. הסרט המתקבל מראה 7 מסגרות לשנייה (fps). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרט 2: ניתוח In vivo של הדינמיקה של IBAGs ב RSV M2-1-GFP-תאים הנגועים. ב 18 h עבודות שירות, התאים היו צילמו כל 5 דקות במשך 3 שעות, 40 דקות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות, בחדר מחומם ב 37 º C. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. הסרט המתקבל מראה 4 fps. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
כאן אנו מציגים שיטת החילוץ של רקומביננטי RSVs מ 5 פלסמידים, הגברה שלהם. היכולת לתמרן את הגנום של וירוסים יש מהפכה וירולוגיה המחקר לבדוק מוטציות, מבטאים גנים נוספים או חלבון נגיפי מתויגות. RSV יש תיאר ואנו לשמש דוגמא במאמר זה הוא וירוס לבטא גן כתב את RSV-GFP (לא פורסם), מבטא החלבון M2-1 דבוקה תג ה-GFP12. חילוץ RSV הוא מאתגר ודורש תרגול. היעילות תרביות תאים הוא קריטי, בהתאם בחירה נבונה של תרביות תאים הכימית ואופטימיזציה מוקדמת של פרוטוקול תרביות תאים. השימוש של תאים המבטאים את pol T7 bacteriophage הוא חובה כי cDNA ויראלי ממוקם במורד הזרם האמרגן pol T7 רוב וקטור גנטי הפוכה. אפשרות אחרת היא לבטא את pol T7 מפני וירוס vaccinia המסייע. עם זאת, השימוש של תאים stably לבטא את pol T7 מונע את הצורך להפריד את שני וירוסים ומונעת הפרעות אפשריות של vaccinia עם החילוץ. חשוב לבצע את המעבר הראשון של הפוך גנטי (P0 ל P1) ללא מקפיא את inoculum על מנת להבטיח יעילות מירבית הצלה. זה מרמז כי למשרד הפנים לא נשלט. עם זאת, בשלב זה, titers להישאר נמוך מאוד, וכתוצאה מכך MOI נמוך עבור המעבר הראשון. כדי להשיג RSV מניות עם titers גבוהה זיהומיות (106–107 PFU/mL), חשוב להמתין CPE חזקה וכדי לגרד את התאים כדי לאסוף את חלקיקי נגיפי המוצמדות לתאים. במחקר זה, titers לא גדלה לאחר 96 שעות עבודות שירות קירור מהיר של ההשעיה ויראלי חשוב לשמור על titers גבוהה. במקום על ידי הטבילה באלכוהול precooled ב-80 מעלות צלזיוס, זה עשוי גם להיות מושגת על ידי טבילה שילוב קרח יבש/אתנול או חנקן נוזלי. התוספת של הפתרון שימור תבטיח יציבות יותר של המתלה וירוס ב-80 מעלות צלזיוס. האחסון ב- 80 ° C הוא קריטי, שכן הווירוס יהיה במהירות אובדן infectivity שלו כאשר הוא מאוחסן ב-20 ° C או בחנקן נוזלי. אנו המתואר הגברה RSV-HEp-2 תאים, שהוא הקו הסלולרי הפופולרי ביותר לגדול RSV, אבל זה גם יוכל לגדול בצורה יעילה על קווי תא רבים אחרים במבחנה. עם זאת, שים לב כי גידול בתאי Vero עלול לגרום שינוי הביטוי G24.
אנחנו תיאר פרוטוקול פשוט מאוד של פלאק טיטור של RSV באמצעות כיסוי שעוות תאית. באשר כל מבחני טיטור, זה רגיש לזיהום עם כייל נוגדנים גבוה השעיה, הדורשים טיפול זהיר. קונבנציונאלי מבחני טיטור RSV להשתמש agarose או carboxymethyl כיסויי תאית (CMC) ודורשים immunostaining ותצפיות מיקרוסקופיים לקביעת כייל נוגדנים. פרוטוקול באמצעות immunodiffusion כיתה agarose תואר המאפשר את פריט חזותי ישיר של הפלאק ללא immunostaining25. עם זאת, HEp-2 תאים רגישים מאוד כיסוי אגר מחוממת, מה שהופך את פרוטוקול זה קשה להשתמש עבור titrations וירוס מרובות (למשל, כיסוי חם מדי הורסת את שכבת תאים); מצד שני, כאשר זה לא מספיק חם, זה עפור לאחר התפלגות צלחת הראשונה. השימוש שעוות תאית וזמינותו רובד ראשון תואר על-ידי Matrosovich et al. עבור שפעת וירוס טיטור assay26. תודות שלו צמיגות נמוכה, שעוות תאית הכיסוי קל לוותר, להסיר את צלחת וולס, כך שיהיה תואם 96-ובכן צלחות. זה, לכן, במיוחד וישימה כדי סרולוגית מחקרים וניתוחים רגישות סמים. שימו לב כי מאז שעוות תאית אינו צריך להיות מחומם, הסמים יכול בקלות לשלב בכיסוי. עם זאת, חשוב כי הלוחות יישארו עדיין לחלוטין במהלך הדגירה; אחרת, מוקדים גדולים בצורת כוכב השביט יהוו במקום שלטי עגול. ההתגלות פלאק באמצעות קריסטל ויולט היא פשוטה וזולה, אך פתרון זה רעיל צריך להיות מסולק כראוי. מיחזור של הפתרון מגביל ייצור פסולת. יתר על כן, שיטה זו היא רגישים נזק טפט מופיע בתור שווא כתמים לבנים שאינם הפלאק ויראלי. כך למשל מוצג באיור 4 (כוכב ירוק). כדי למנוע הטיה זו, תאים 1) צריך להתנהל בזהירות כדי למנוע שריטות או שטיפה של טפט תא, 2) שאיפה dispensing תמיד צריך לעשות, באותו מקום. כדי circumscribe את הנזק מאזור ידוע אחד ואת עשויה להיות מזוהה כתמים לבנים 3) שווא בזכות צורתם (לא כדורית), שלהם קצוות חדים, והמיקום שלהם. תחילה השתמשנו Avicel RC 581, כפי שפורסמו בעבר21,26. עם זאת, 581 RC אינה זמינה, החלפנו אותו בהצלחה על ידי RC 591. להסתגל זה הנועד זוגות תא/וירוסים אחרים, הריכוז של שעוות תאית צריך להיקבע בהתאם הוירוס ולא התאים. שעוות תאית מדי עלולים להיות רעילים עבור תאים, להוביל הפלאק קטן, מעט מדי תוביל פעפוע של הנגיף המדיום.
אנו המתואר שתי דוגמאות של שימוש של וירוס ה-RSV-GFP כדי לפקח RSV כפל: בנוכחות של תרופה קוטלת נגיפים או כאשר להשתיק חלבון תאית. להדגים האות ה-GFP הוא מתואם עם כפל נגיפית. השיטה המוצגת כאן מאפשר הערכת מאמץ כפל נגיפית בזמן אמת. היא מאפשרת למדענים לקבוע בקלות את IC50 של תרופה אנטי ויראליים, כפי שמוצג באיור 7. חשוב, מדידה זו ניתנת להתאמה לשימוש בינוני או פס רחב, במיוחד להקרנה של ספריות כימי. וירוס לבטא כתב זה יכול להיות שימושי גם להעריך את ההשפעה על וירוס הכפלה של אפנון ביטוי חלבון תאית. התערבות RNA היא תהליך ביולוגי לפיו mRNA ספציפי יורד בעקבות הכרה ספציפית על ידי siRNA, ובכך להקטין או, באופן אידיאלי, המבטלת את הביטוי של חלבון התואם27. בדוגמה שניתנו כאן, על ידי ניטור GFP עוצמת האות ב RSV GFP-תאים הנגועים, אנחנו העריכו את ההשפעה של וכמובן nucleocapsid ויראלי mRNA (N) או המארח IMPDH mRNA על כפל RSV. IMPDH2 הוא אנזים biosynthetic הוחלף נגזר פורין זה מזרז הגבלת קצב צעד לקראת de novo ביוסינטזה של נוקלאוטידים גואנין מ IMP28. . זה ובכך מווסת של הבריכה נוקלאוטיד גואנין תאיים. מעכבי IMPDH, כגון ribavirin, להפעיל מעכבות ההשפעות על וירוסי RNA, כולל RSV זיהום29,30,31. כפי שמוצג באיור 6, עיכוב של IMPDH ביטוי פוגע כפל נגיפית כמצוין על-ידי הפחתת האות ה-GFP, מחקה את ההשפעות של ribavirin על צמיחה RSV. באופן דומה, הכפלה ויראלי הוא ביטל כמעט בנוכחות siRNA מיקוד החלבון N ויראלי. תוצאה זו היה צפוי מאז siRNA מיקוד החלבון N אמורה למנוע nucleocapsid ויראלי הרכבה, הוכיחה לפגום בתוקף שכפול ויראלי32. הממשל של אלה siRNA מאת nebulization עכבות הזיהום עוקבות מאת RSV ב והבריאים33. ההשפעה של siRNA N או IMPDH הוא ספציפי מאז עיכוב של הביטוי GAPDH, נבחר לשמש גן הבקרה, אינו פוגע כפל נגיפית לעומת siRNA nontargeting. שימו לב כי אין רעילות תא זוהה בכל תנאי. תוצאות אלה יחדיו, לאמת את האסטרטגיה המובאים כאן, אשר יכול להיות למעלה את גודלו הקרנת באמצעות ספריות siRNA או בשיטות אחרות נוקאאוט, כגון CRISPR-Cas9 טכנולוגיה34תפוקה גבוהה.
וירוסים רקומביננטי ביטוי חלבון פלואורסצנטי פיוז'ן מייצגים כלים רבי-עוצמה ללמוד חלבונים ויראלי ו דינמיקת מבנים ויראלי. RSV ביטוי חלבון פלואורסצנטי M2-1 מאפשרת התבוננות הדינמיקה של IBs ושל IBAGs. תסמונת המעי הרגיז, אשר עשוי להיחשב מפעלים ויראלי RSV, מופיעים מבנים כדוריים דינמי. הם מסוגלים להינתך יחד טופס מבנים כדוריים גדולים יותר (איור 8 ו 1 סרט). נתונים אלו מראים כי RSV IBs הם organelles נוזלי, דומה היה מה שתואר על וירוס הכלבת35. IBAGs מייצגים של subcompartment בתוך IBs, רבגוני mRNA הנגיפי M2-1 תרכיז חלבון, כגון את הרנ א גנומי, את nucleocapsid של פולימראז, נמצאים רק שאר ה IBs12. ניסויים מיקרוסקופ הסרטונים חושפים כי IBAGs הם מאוד דינמי מבנים בתערוכה מאפיינים נוזלי (איור 9 ו- 2 סרט). הם עשויים להיחשב נוזלי תאי הנובעות מעבר פאזה נוזל-נוזל.
האפשרות של מניפולציה גנטית וירוסים נשאר כלי הבחירה ללמוד שני המנגנונים של כפל שלהם, את רגישותם לתרופות. גנטיקה הפוכה עשוי להיחשב עכשיו כחלק טכניקות "קלאסי" של וירולוגיה. עם זאת, הוא נשאר עבור וירוסים מסוימים, כמו RSV. זו הסיבה מדוע פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הפעולות כדי להציל ומגבירים רקומביננטי RSVs בהצלחה.
המחברים אין לחשוף.
המחברים מודים ד ר צ'ין יו של חברת AstraZeneca R & D בוסטון, מסצ'וסטס, ארה ב, על מתן התרופה AZD4316. המחברים מודים פלטפורמת Cymages לגישה אל המיקרוסקופ ScanR האולימפוס, אשר נתמכה על ידי מעניק מאזור ile-de-(בריאות אחד עמום). המחברים להכיר תמיכה את INSERM ואוניברסיטת סן ורסאי.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved